全 文 ：扁柑（Citrus reticulata Blanco cv. Bian Gan）属
芸香科（Rutaceae）、 柑橘亚科（Aurantioideae）、 柑
橘属（Citreae）植物。 扁柑产量稳定， 果实色泽鲜艳，
有光泽， 果形美观， 耐贮藏， 风味浓郁， 易剥皮，
是广西地方特有的柑橘品种。 扁柑在广西分布较
广， 栽培历史悠久， 果实形态表现出丰富的多样
性， 但目前广西扁柑类资源还存在着同名异物或同
物异名的现象， 而扁柑在分类上是属于宽皮柑橘类
的柑类还是桔类， 目前还没得到充分的证明。 为了
更好地利用这一特色品种资源， 准确了解广西扁柑
资源现状、 类型、 分类地位及亲缘关系， 从而更好
的创新利用。 本研究对 21 份广西扁柑资源、 2 份
越南柑资源及 12份近缘的其它柑橘资源进行 ISSR-
PCR 分析， 从 100 条引物中筛选 10 条引物， 对 35
份资源进行遗传多样性及亲缘关系分析， 为今后对
柑橘新品种的选育、 资源创新利用提供重要依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验供试的 35 份柑橘资源中包括： 21 份广
西扁柑资源、 2 份越南柑资源及 12 份近缘的其它
柑橘资源。 分别采自广西的大新县、 金城江区、 那
陈镇、 凭祥市、 龙州县、 浦北县、 百色市及广西大
学果树标本园。 选择健康幼嫩的叶片， 带回实验
室， 放入-40 ℃冰箱中保存备用。 详细资源信息见
（表 1）。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取和检测 选取健康幼嫩的柑橘
热带作物学报 2011， 32（3）： 443-446
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2010-11-13 修回日期： 2011-02-18
基金项目： 科技部国际合作项目（No. 2008DFA30900）； 广西研究生创新项目（No. 2008105930901D21； 105930903050）。
作者简介： 郭丽英， 女， 硕士研究生。 研究方向： 果树生物技术与种质改良。 *通讯作者及并列第一作者： 黄桂香， E-mail: hguixiang@163.com。
扁柑种质资源亲缘关系的 ISSR分析
郭丽英， 黄桂香 *， 何新华， 张树伟， 李 峰， 陈 虎
广西大学农学院， 广西南宁 530004
摘 要 为了准确了解广西扁柑资源现状、 类型、 分类地位及亲缘关系， 从而更好地开发利用， 本试验对 35 份
柑橘资源， 其中包括 21 份广西扁柑资源、 2 份越南柑资源及 12 份近缘的其它柑橘属资源进行 ISSR-PCR 分析。
结果显示： 10 条引物共扩增出 134 条 DNA 片段， 其中 108 条具有多态性， 比率为 81％。 用 UPGMA 软件进行
聚类分析， 35 份柑橘资源的遗传系数在 0.64～1.00 之间， 在遗传系数为 0.80 处将 35 份材料划分为 5 类， 其中所
有扁柑类资源均和椪柑、 南丰蜜桔聚在一类， 初步证明扁柑类资源的分类地位应属于宽皮柑橘类的桔类。 各扁
柑资源间的相似系数在 0.90 以上， 亲缘关系较近。
关键词 扁柑； 种质资源； ISSR； 聚类分析
中图分类号 S666.9 文献标识码 A
ISSR Analysis of Citrus reticulata Blanco cv.
Bian Gan Germplasm Resources
GUO Liying, HUANG Guixiang, HE Xinhua, ZHANG Shuwei, LI Feng, CHEN Hu
College of Agriculture, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004, China
Abstract This study aimed at accurately understanding of resource status and types, taxonomic status and genetic
relationship of Guangxi Citrus reticulata Blanco cv. Bian Gan, thus promoting its utilization. Thirty-five accessions
of Citrus germplasm,including 21 Guangxi Citrus reticulata Blanco cv. Bian Gan species, 2 Vietnam samples and
12 closely related varieties were analysed by using inter-simple sequence repeat (ISSR) and the results showed that
134 fragments of DNA were amplified with 10 primers by using ISSR-PCR, among which 108 (81％) fragments were
polymorphic. The genetic distance was analyzed, and a tree diagram constructed by using UPGMA algorithm. The
genetic similarity coefficients among the accessions were calculated with NTSYS-pc2.10e software and the values
were between 0.64 and 1.00. The 35 materials could be clustered into 5 groups at the similarity coefficient level
of 0.80， all Citrus reticulata Blanco cv. Bian Gan samples had the greatest genetic similarity with Ponkan and
Nanfeng mandarin, indicating that Citrus reticulata Blanco cv. Bian Gan was mandarin. Citrus reticulata Blanco cv.
Bian Gan had a near relationship because of a high index which was above 0.90.
Key words Citrus reticulata Blanco cv. Bian Gan; Germplasm resources; ISSR; Genetic relationship
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2011.03.015
第 32 卷热 带 作 物 学 报
叶片， 采取改良 CTAB 法 [1]提取叶片基因组 DNA，
测定其纯度， 用 1％琼脂凝胶电泳检测 DNA， 并用
紫外分光光度计， 测定浓度与纯度质量。 最终将
DNA稀释到 25 ng/μL， 放入-20℃冰箱备用。
1.2.2 引物筛选 试验中选用的 100条 ISSR 引物
参照加拿大哥伦比亚大学 UBC 公司公布的引物序
列， 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
经过复选， 选出 10 条多态性较好的引物用于柑橘
种质资源遗传多样性分析。
1.2.3 PCR 扩增 采用优化后适用于扁柑资源的
ISSR 反应体系： DNA（25 ng/μL）1.0 μL、 10×buffer
（含Mg2+）2.0μL、 4.0 mmol/L dNTP 0.5μL、 30μmol/L
引物 1 μL、 DNA 聚合酶（2.5 U/μL ）0.4 μL， 加水
至 20 μL。 PCR 扩增程序为： 94 ℃预变性 4 min；
94 ℃变性 50 s， 复性退火温度随引物而定 1 min，
72 ℃延伸 2 min， 循环 35 次； 72 ℃延伸 7 min。 扩
增反应结束后， 在扩增产物中加入 4 μL 溴酚蓝混
匀， 取 8 μL 扩增产物在 1.8％琼脂糖凝胶中电泳，
编号 样品名 来源地
1 大新腊月柑 1 广西大新县下雷镇仁益村下吞屯
2 大新腊月柑 2 广西大新县下雷镇仁益村下吞屯
3 大新腊月柑 3 广西大新县下雷镇吉门村布鸟屯
4 大新腊月柑 4 广西大新县下雷镇仁益村下吞屯
5 大新腊月柑实生苗 广西大学果树标本园
6 浦北无核扁柑 广西浦北县龙门镇兴平村黑水塘
7 那陈土柠檬 广西南宁市那陈镇五龙村坛浮坡屯
8 那陈扁柑 1 广西南宁市那陈镇五龙村坛浮坡屯
9 那陈扁柑 2 广西南宁市那陈镇五龙村坛浮坡屯
10 那陈扁柑实生苗 广西南宁市那陈镇五龙村坛浮坡屯
11 百色乌拉扁柑 广西百色市那毕乡乌拉村
12 百色六鸡扁柑 广西百色市那毕乡六鸡村那暖屯
13 龙州本地柑 广西龙州县武德乡科甲村陇密屯
14 凭祥本地柑 1 广西凭祥市上石镇下敖村过锦屯
15 凭祥本地柑 2 广西凭祥市上石镇下敖村过锦屯
16 凭祥本地柑 3 广西凭祥市上石镇下敖村过锦屯
17 鸳鸯柑 广西河池市金城江区六昌园艺所
18 金城江扁柑 广西河池市金城江区六昌园艺所
19 广柑 广西河池市金城江区六昌园艺所
20 上思扁柑 1 广西上思县那琴乡桃岭村
21 上思扁柑 2 广西上思县那琴乡桃岭村
22 上思扁柑 3 广西上思县那琴乡桃岭村
23 宫川早温 广西大学标本园
24 山川早温 广西大学标本园
25 椪柑 广西大学标本园
26 南丰蜜桔 广西大学标本园
27 红江橙 广西大学标本园
28 纽荷尔脐橙 广西大学标本园
29 红七柚 广西大学标本园
30 沙田柚 广西大学标本园
31 尤克力柠檬 广西大学标本园
32 法国香水柠檬 广西大学标本园
33 越南柑 1 广西大学标本园嫁接
34 越南柑 2 广西大学标本园嫁接
35 融安金弹 广西大学标本园
表 1 供试材料及来源
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第 3 期 郭丽英等： 扁柑种质资源亲缘关系的 ISSR分析
M. DL 2 000 marker， 样品编号见表 1。
bp
2 000
1 000
750
500
250
100
图 1 引物 812 扩增柑橘品种的 ISSR 电泳图
表 2 10 条 ISSR 引物序列及扩展结果
引物
引物序
列（5-3）
条带
总数
多态性
位点
多态性位点
百分数/％
807 （AG）8T 15 11 73
808 （AG）8C 16 16 100
811 （GA）8A 13 13 100
810 （GA）8T 11 9 75
825 （AG）8T 17 15 88
847 （CA）8RC 15 11 80
834 （AG）8TG 11 7 63
873 （GACA）3 11 10 83
842 （GA）8YG 9 7 78
818 （CA）8G 11 8 67
电泳缓冲液为 1×TAE， EB染色后拍照（表 2）。
1.2.4 聚类分析 谱带记录以电脑记录的荧光条
带为依据， 有条带则多态性记为 “l”， 空缺时记为
“0”， 把得到的（0， 1）矩阵输入 NTsys 2.10e， 用
NTsys 2.10e 软件进行遗传相似性系数计算， 并用
UPGMA 程序构建聚类图。
2 结果与分析
2.1 引物筛选及 ISSR-PCR扩增结果
选取浦北扁柑、 椪柑、 沙田柚 3个形态差异较
大的品种， 从 100条 ISSR引物中筛选出 10 条条带
清晰， 多态性较强的引物。 然后用这 10 条引物对
所有供试品种进行 ISSR-PCR 扩增， 并进行统计分
析。 结果表明： 10 条引物共扩增出 134 条 DNA 片
段， 其中 108 条具有多态性， 多态性比率为 81％，
其中 808、 811 中多态性占的比例大， 多态性谱带
达到 100％。 平均每条引物可获得 13 条带， 平均
多态性条带为 10.8 条（图 1 为引物 812 的部分电泳
图谱）。
2.2 聚类分析
2.2.1 亲缘关系分析 利用 Ntedit 软件计算 10 条
ISSR 引物扩增结果在品种之间的相似系数， 结果
显示， 在供试的 35 份材料中， 两两间遗传相似系
数的范围为 0.64~1.00 之间。 其中那陈扁柑 2 和百
色乌拉扁柑的亲缘关系最近， 相似系数为 1.000；
上思扁柑 1和上思扁柑 3相似系数也同样为 1.000；
与龙州本地柑最近的为凭祥扁柑 2， 相似系数为
0.992； 越南柑 1 和越南柑 2 的的亲缘关系最近，
相似系数为 0.962。 利用 UPGMA 方法构建了亲缘
关系树状图（图 2）。 可见， 21份扁柑资源和 2份越
南柑在 0.89 处与其它分开 。 在遗传相似系数为
0.90 的水平上分为 2 组， 第 1 组包括： 腊月柑 1、
腊月柑 2、 腊月柑 3、 腊月柑 4、 腊月柑实生苗、
龙州本地柑、 凭祥本地柑 1、 凭祥本地柑 2、 凭祥
本地柑 3、 广柑、 越南柑橘 1、 越南柑橘 2； 第 2
组包括： 浦北扁柑无核、 那陈扁柑 1、 那陈扁柑 2、
那陈扁柑实生苗、 百色乌拉扁柑、 百色六鸡扁柑、
鸳鸯柑、 金城江扁柑、 上思扁柑 1、 上思扁柑 2、
上思扁柑 3。 在这 23 份材料中， 上思 1 和上思 3
的遗传系数为 0， 有可能为同一品种。 同样百色乌
拉扁柑和那陈扁柑 2也未表现出差异性， 也有可能
是不同地方的同一种质。
在所有的 21 份扁柑品种及 2 份越南柑桔中，
每个组的相似系数都很高， 表明这些资源的亲缘关
系近， 扁柑资源的遗传变异很小。 以上分类数据支
持基于形态学建立的分类结果。
2.2.2 扁柑种质 ISSR 特异性分子标记 在获得
的所有 ISSR 扩增带中， 部分为不同品种所特有的
带， 为特异性分子标记， 是园艺植物品种鉴定的重
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第 32 卷热 带 作 物 学 报
3 讨论
（1）ISSR 分析在扁柑资源中的遗传关系研究方
面是可行的 [3-5]。 在遗传相似系数为 0.90 的水平上
扁柑资源可分为 2 组， 第 1 组包括： 腊月柑 1、 腊
月柑 2、 腊月柑 3、 腊月柑 4、 腊月柑实生苗、 龙
州本地柑、 凭祥本地柑 1、 凭祥本地柑 2、 凭祥本
地柑 3、 广柑、 越南柑 1、 越南柑 2； 第 2 组包括：
浦北扁柑、 那陈扁柑 1、 那陈扁柑 2、 那陈扁柑实
生苗、 百色乌拉扁柑、 百色六鸡扁柑、 鸳鸯柑、 金
城江扁柑、 上思扁柑 1、 上思扁柑 2、 上思扁柑 3。
在这 23 份材料其中， 百色乌拉扁柑和那陈扁柑 2
未表现出差异性， 可能是同一种质。
（2）扁柑资源与其它柑橘植物的亲缘关系由近
到远依次为桔类→柑类→橙类→柚类→柠檬类→金
柑， 即扁柑资源与桔类亲缘关系最近， 初步证明扁
柑在分类地位上应属于桔类。 桔是基本种， 而柑是
桔与甜橙等其它柑橘的杂种。
（3）从越南引进的两个柑桔品种与扁柑资源聚
在了一起， 且遗传系数很高， 说明该柑桔资源与广
西扁柑资源可能有同样的起源， 该资源有待进一步
的研究。
对于扁柑种质资源的亲缘关系， 还需要结合形
态学、 细胞学等方法的研究， 才能为扁柑的种质资
源遗传背景提供更加全面的认识， 从而更好的创新
利用广西这一特有的资源。
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要分子性状[2]。 在本研究中， 发现鸳鸯柑有一条特
异性标记。 如图所示与其它的 21份扁柑资源相比，
812 引物中位于 1 200 bp 上有一条缺失带， 因此可
以确定为鸳鸯柑基于 812引物的特异带（图 1）。
图 2 聚类分析图
责任编辑： 沈德发
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