全 文 ：不同来源供体细胞及含羞草素对水牛
体细胞核移植的影响
李日聪 , 杨春艳 , 庞春英 , 黄右军 , 梁贤威＊
(中国农业科学院广西水牛研究所 , 广西 南宁　530001)
摘要:本文主要探讨供体细胞类型及含羞草素对水牛体细胞克隆的影响。结果如下:与成纤维细胞相比 , 卵丘 /颗粒细胞可以获得较高的融合率
和分裂率 , 但两者的囊胚率差异不显著;克隆水牛的成纤维细胞能用于核移植 , 而且对核移植结果没有影响;性别对重构胚的早期发育影响不
大;含羞草素处理可以替代血清饥饿处理。
关键词:水牛;核移植;供体细胞;含羞草素
中图分类号:S813　　　文献标识码:B　　　文章编号:0529-5130(2010)06-0049-03
　　哺乳动物的体细胞核移植技术是生物技术中极为
重要的一项技术 , 自从 1997年该技术首次获得成功
以来已经获得多种体细胞克隆动物 。体细胞核移植是
一个复杂过程 , 包括许多环节 , 每个环节对核移植效
果都会产生影响。供体细胞类型的选择是其中环节之
一。现有的资料表明卵丘 /颗粒细胞 [ 1] 、 输卵管 /子
宫上皮细胞 [ 2] 、 胎儿成纤维细胞[ 3] 、 乳腺上皮细
胞[ 4] 、 皮肤成纤维细胞 [ 5]等多种类型细胞可以进行
核移植并获得后代 。同时人们也了解到不同类型细胞
的核移植效果有所差别[ 6] 。至于哪种类型细胞作为
供体可获得最高核移植效率 , 目前并没有统一的认
识。本文对比了几种水牛体细胞的核移植效果 , 了解
其中的规律。
血清饥饿是体细胞核移植中常用的调控供体细胞
周期的方法。近年来有研究显示:经过血清饥饿处理
的细胞出现更多 DNA碎片 , 凋亡的细胞也明显增
加[ 7] , 这对于核移植结果会形成负面影响。寻找合
理有效的处理方法取代血清饥饿处理是必要的。含羞
　
收稿日期:2009-07-23
基金项目:农业部 948项目 (2004-T8和 2006-G49)。
作者简介:李日聪 (1979-), 男 , 助理研究员 , 硕士。
＊通讯作者。
草素是 DNA复制抑制剂 , 能有效阻止细胞的 DNA进
行复制 , 使细胞处于细胞周期中的 G1期 , 在解除含
羞草素的作用后 , 细胞周期可正常进行 [ 8] 。由此可
见含羞草素是一种细胞周期同期化的物质。本试验用
浓度为 0.5 mmol/L的含羞草素处理供体细胞并进行
核移植 , 探讨了其核移植效果与血清饥饿处理的
差异 。
1　材料与方法
1.1　供体细胞的培养
　　水牛皮肤成纤维细胞:水牛皮肤成纤维细胞取自
本单位刚出生的河流型水牛的耳部皮肤 , 采用组织块
培养方法培养原代细胞 , 当传到第 3代时冷冻保存。
卵丘 /颗粒细胞:对河流型水牛进行活采 , 所得
的活采液在捡去卵母细胞后收集其中的细胞并培养 、
传代 , 所得细胞即为颗粒 /卵丘细胞。
1.2　供体细胞的处理
血清饥饿处理:用含 0.5% FBS的 DMEM培养
体细胞 3 ～ 5 d, 消化收集细胞用于核移植。
含羞草素处理:用含羞草素浓度为 0.5 mmol/L
的 DMEM(含 10%的 FBS)培养体细胞 24 h, 然后
消化收集细胞用于核移植。
率的提高[ 2] 。在母牛不孕症的防治方面 , 除要实行
认真培养一批技术水平高的输精人员 、 严格按照冷配
操作规程认真操作 、对器具进行严密消毒 、 指导牛主
改善牧牛饲养 、提高营养水平等措施外 , 同时对患不
孕症的母牛认真检查其病因 , 采取针对性治疗 , 利用
促性腺激素 , 对长期不发情或卵巢囊肿 、排卵延迟 、
卵泡发育迟缓的母牛治疗 , 受胎率可明显提高。因此
对上一个发情期未配孕的母牛 , 要检查未孕原因 , 采
取相对措施抓好下一个发情的复配 , 以达到提高总受
胎率的目的。
参考文献:
[ 1] 　杜　军 , 王瑞军 , 刘海英.影响受胎率的因素与提高受胎率的
措施 [ J] .黑龙江动物繁殖 , 2002, (1):15-16.
[ 2] 　王根林.养牛学 [ M]. 2版.北京:中国农业出版社 , 2006.
·49·畜牧与兽医　2010年　第 42卷　第 6期
1.3　卵母细胞的成熟 、 去核 、 激活
收集屠宰场的本地水牛 (沼泽型)卵巢 , 将其
置于盛有生理盐水的保温瓶内 , 在 4 h内送回实验
室。用带有 12号针头的注射器穿刺抽吸卵巢表面卵
母细胞 , 在体视显微镜下挑选出具有完整卵丘细胞层
或部分致密卵丘细胞的卵子 (COC), 用洗卵液清洗
两次后 , 放入成熟培养液 (TCM199 +0.5 mmol/L
HEPES+5 mmol/L丙酮酸钠 +5 mg/mLFSH+10mg/
mLLH+10%FBS+0.5 mmol/L半胱氨酸 +1 μg/mL
E2 +50 ng/mLEGF), 在 39 ℃, 5%CO2和最大饱和
湿度的培养箱中体外成熟培养 22h。
成熟培养后用 100 μL的微量加样器反复抽打卵
母细胞 , 除去其周围卵丘细胞 , 然后移入含 0.1%的
透明质酸酶的培养液中轻轻反复抽打 , 除去剩余的卵
丘细胞。挑选具有第一极体的卵母细胞并将其移入显
微操作盘的去核操作微滴 (TCM199+10%FBS+7.5
μg/mLCB)中。用纺缍体观测仪去核。
用去核管吸准备好的供体细胞 , 然后沿着去核时
在透明带上留下的切口将成供体细胞注入卵母细胞的
卵周隙 , 使之与卵母细胞紧密接触 。本研究所用的电
融合仪是 ECM-2001, 融合液为 250 mmol/L山梨醇 +
0.1 mmol/L醋酸钙 +0.5 mmol/L醋酸镁 +0.5 mmol/
LHepes+0.1%BSA。电融合后卵母细胞-供体细胞复
合体移入胚胎培养液中 , 在 39℃的培养箱中培养 30
min, 然后在显微镜下检查其融合情况 。重构胚电融
合后 1 h, 先用 5 μmol/L离子霉素 (Ionomycin)激
活处理 5min, 然后用 2mmol/L的二甲氨基嘌呤 (6-
DMAP)培养处理 3 ～ 4 h。激活后的重构胚移入 50
μL培养液的微滴中 , 在 39 ℃、 5% CO2 、最大饱和
湿度的培养箱中培养 , 48h计其分裂率 。
1.4　试验设计
试验 1:不同来源供体细胞对水牛体细胞核移植
的影响。以血清饥饿处理调控供体细胞周期 , 以不同
来源体细胞 (卵丘 /颗粒细胞 , 新生克隆牛成纤维细
胞 , 新生小公牛成纤维细胞 , 新生小母牛成纤维细
胞)为供体细胞进行核移植 , 对比各组的融合率 、
分裂率及囊胚率。
试验 2:含羞草素对水牛体细胞核移植的影响 。
以卵丘 /颗粒细胞为供体细胞 , 分别以血清饥饿和
0.5 mmol/L含羞草素处理 , 对比这两组的融合率 、
分裂率及囊胚率。
各组重复 13次左右 。
所得实验数据均用 spss11.5进行单因素方差分
析 , 确定差异的显著性 。
2　结果
如表 1 所 示:卵 丘 /颗 粒 细 胞 在 融 合 率
(83.3%)和卵分裂率 (61.2%)上明显高于新生克
隆牛成纤维细胞 、 新生小公牛成纤维细胞及新生小母
牛成纤维细胞 (77.2%, 76.8%, 76.5%;51.8%,
51.2%, 50.3%)(P<0.05), 后三者的融合率和卵
分裂率无明显差别 (P>0.05)。这四组的囊胚率的
无明显差异 (12.0%, 7.9%, 11.4%, 9.9%) (P
>0.05)。
表 1　不同来源供体细胞对水牛体细胞核移植的影响
体细胞来源 NT卵数 融合卵数 卵分裂数 囊胚数
卵丘 /颗粒细胞 498 415 (83.3%)a 254 (61.2%)a 50 (12.0%)a
新生克隆牛成纤维细胞 478 369 (77.2%)b 191 (51.8%)b 29 (7.9%)a
新生小公牛成纤维细胞 654 502 (76.8%)b 257 (51.2%)b 57 (11.4%)a
新生小母牛成纤维细胞 728 557 (76.5%)b 280 (50.3%)b 55 (9.9%)a
　　注:a, b列内具不同上标的值差异显著 (P<0.05)。
　　从表 2得知:以卵丘 /颗粒细胞为核供体时 , 血
清饥饿组和 0.5 mmol/L含羞草素组在分裂率上有显
著差异外 (61.2%, 48.2%)(P<0.05), 融合率和
囊 胚 率 没 有 差 异 (83.3%, 82.6%; 12.0%,
11.8%)(P>0.05)。
表 2　含羞草素对水牛体细胞核移植的影响
组　别 NT卵数 融合卵数 卵分裂数 囊胚数
血清饥饿组 498 415 (83.3%)a 254 (61.2%)a 50 (12.0%)a
0.5mmol/L含羞草素组 545 450 (82.6%)a 217 (48.2%)b 53 (11.8%)a
　　注:a, b列内具不同上标的值差异显著 (P<0.05)。
·50· AnimalHusbandry＆VeterinaryMedicine　2010　Vol.42　No.6
3　讨论
哺乳动物的绝大多数体细胞都有细胞核 , 每个细
胞核里都有全部的遗传信息 , 只是在分化过程中有选
择地关闭和开启某些基因 , 因此 , 在理论上各种类型
的体细胞经过核移植都能获得发育的全能性 。通过对
体细胞核移植十几年的研究 , 人们了解到不同类型体
细胞的核移植效果有所不同[ 6] 。有许多研究结果表
明以卵丘 /颗粒细胞为供体进行核移植 , 可以获得较
高的核移植效率[ 2, 6, 9] , 人们推测其中的原因是:(1)
卵丘 /颗粒细胞是自然静止于 G0 /G1期的细胞; (2)
卵丘细胞是包围在卵母细胞周围的细胞 , 在卵母细胞
生长发育过程中卵丘细胞上存在着与卵母细胞紧密联
系的胞质微绒毛桥 , 它们将可能有助于供体核同受体
胞质间相关因子的交换 , 核移植后二者胞质更易互
融;(3)卵丘细胞内端粒酶活性较高 , 不会由于染
色体端粒变短而使细胞老化 。本文比较了卵丘 /颗粒
和皮肤成纤维细胞的核移植效果差异 , 结果显示卵丘
/颗粒在融合率和分裂率方面高于皮肤成纤维细胞 ,
但两者的囊胚率并无明显差别。这与别人的结果有所
差别 , 可能是技术条件差异的原因。卵丘 /颗粒细胞
在培养传代过程中明显比皮肤成纤维细胞的直径要
大 , 这对融合十分有利 , 所以融合率要比后者高 。
本研究还探讨了体细胞克隆水牛的体细胞对核移
植效果的影响 。克隆水牛成纤维细胞的核移植结果如
下:融合率 77.2%、 分裂率 51.8%、 囊胚率 7.9%,
经统计表明其结果与一般成纤维细胞的结果并无差
异。这说明在本实验室的条件下克隆水牛的成纤维细
胞能用于核移植 , 而且对核移植结果没有影响。但其
对着床之后的囊胚发育有何影响有待进一步研究 。
有些研究证实性别对核移植效果有影响 , 虽然性
别对重构胚的早期发育影响不大 , 但雌性动物的体细
胞似乎更有利于重构胚的后期发育 [ 10-11] 。在本次试
验中也发现性别对重构胚的早期发育影响不明显 , 至
于性别对重构胚后期发育的影响有待我们进行胚胎移
植比较。
血清饥饿是体细胞核移植中常用的调控供体细胞
周期的方法。有研究显示:经过血清饥饿处理的细胞
出现更多 DNA碎片 , 凋亡的细胞也明显增加 [ 7] , 这
对于核移植结果会产生负面影响。寻找合理有效的处
理方法取代血清饥饿处理是必要的。含羞草素是
DNA复制抑制剂 , 能有效阻止细胞的 DNA进行复
制 , 使细胞处于细胞周期中的 G1期 , 在去除含羞草
素后 , 细胞正常生长 [ 8] 。由此可见含羞草素是一种
细胞周期同期化的物质 。本实验用浓度为 0.5 mmol/
L的含羞草素处理卵丘 /颗粒细胞并进行核移植 , 其
结果与血清饥饿处理的囊胚率不存在明显差异。这表
明含羞草素处理可以替代血清饥饿处理 。含羞草素能
否提高重构胚的受胎率 , 减少流产率及出生个体的死
亡率还需我们进行探讨 。
4　结论
与成纤维细胞相比 , 卵丘 /颗粒细胞可以获得较
高的融合率和分裂率 , 但两者的囊胚发育率差异不显
著;克隆水牛的成纤维细胞能用于核移植 , 而且对核
移植结果没有影响;性别对重构胚的早期发育影响不
大;含羞草素处理可以替代血清饥饿处理。
参考文献:
[ 1] 　ZouX, ChenY, WangY, etal.Productionofclonedgoatsfrome-
nucleatedoocytesinjectedwithcumuluscelnucleiorfusedwithcu-
muluscels[ J] .Cloning, 2001, 3(1):31.
[ 2] 　KatoY, TaniT, SotomaruY, etal.Eightcalvesclonedfromsomat-
iccelsofasingleadult[ J] .Science, 1998, 282(5396):2095.
[ 3] 　OnishiA, IwamotoM, AkitaT, etal.Pigcloningbymicroinjection
offetalfibroblastnuclei[ J].Science, 2000, 289:1188-1190.
[ 4] 　WilmutI, SchniekeAE, McWhirJ, etal.Viableofspringderived
fromfetalandadultmammaliancels[ J].Nature, 1997, 385:
810-813.
[ 5] 　郭继彤.成年体细胞克隆山羊研究 [ D] .西安:西北农林科
技大学博士学位论文.2000.
[ 6] 　BeyhanZ, MitalipovaM, ChangT, etal.Developmentalpotential
ofbovinenucleartransferembryosproducedusingdiferenttypesof
adultdonorcels[ J] .Theriogenology, 2000, 53:210.
[ 7] 　KuesWA, AngerM, CarnwathJW, etal.Celsynchronizationof
porcinefetalfibroblasts:Efectsofserumdeprivationandreverible
celcycleinhibitors[J].BiolReprod, 2000, 62:412-419.
[ 8] 　VackovaI, EngelovaM, MarinovI, etal.Celcyclesynchronization
ofporcinegranulosacellsinG1stagewithmimosine[ J] .Animal
ReproductionScience, 2003(77) 235-245.
[ 9] 　SkrzyzonskaM, ShioyaY, NagaiT, etal.Developmentofcloned
bovingEmbryosfromnucleiofcumulusandmusclecelorigin[ J] .
Theriogenology, 2000, 53(1):244.
[ 10] 陈大元 , 李劲松 , 韩之明 , 等.体细胞克隆牛:供体细胞和受
体的影响 [ J].科学通报 , 2003, 48: 768-773.
[ 11] ShinT, KraemerD, PryorJ, etal.Acatclonedbynucleartrans-
plantatio[J] .Nature, 2002, 415:859.
·51·畜牧与兽医　2010年　第 42卷　第 6期