全 文 ：微生物学报 3 4 ( 5 ) : 3 7 9一 3 8 4 , 1 9 9 4
A e t a M i
e r o b i o l o g ie a S i n i e a
降解有毒的含羞草素和二经基毗咤
化合物的瘤胃细菌
口
谭蓓英 王旭明’
(
L卜国科学院微生物研究所 北京 一0 0 0 8 0 )
汪 傲
(中国农业科学院畜牧研究所 北京 1 0 00 94 )
摘 要 从采食银合欢不引起中毒症状的我国广西北海市涸洲岛的黄牛瘤胃中 ,分离出 4 株
厌氧细菌 。 经高效液相色谱分析证实 ,菌株 B R 一 1 , B R 一 2 , B R 一 5 和 B R 一 7 能降解有毒的含羞草
素 (m i m o s i n e ) 、 3一轻基一 4 ( l 氢 )毗陡酮 ( 3 , 4 D H P )和 2 , 3 一二经基 p比陡 ( 2 , 3D H P ) 。 在宿主体外
进行纯菌和混菌液体培养 , 3 天分别降解含羞草素 4 一 59 % , 3 , 4 D H P 30 一 47 %和 2 , 3D H P
58 一 6。% 。 经分类鉴定 , 确定为三个种 : B R 一 1和 B R 一 2 很相似 , 为乳杆菌属 ( L ac t ob ac lz u 、 ) ,可
能是 一个新种 。 B R 一 5 为牛链球菌 ( s t r eP z , , c o e `一 u : 占o v i s )和 B R 一 7 为生饱梭菌 ( (沱。 s tidr iu m
护 o or g。 。 ) 。 上述这些兼性和严格厌氧的革兰氏阳性细菌对含羞草素和二轻基毗陡类毒素具
有降解活性 , 这是以前没有报道过的 。 由于这些脱毒细菌栖居于瘤胃的微生态系统中 ,从而保
护宿主动物免受银合欢的毒害 口
关键词 瘤胃细菌 , 脱毒 ,银合欢 ,含羞草素 ,二经基毗陡
含 羞 草 素是 一 种 氨 基 酸类 毒素印一 ( 3 一h y d r o x y 一 4一 o x o p y r id y l ) 。 一 a m i n o 一 p r o p i o n i e
ac id ]
。 它存 在于 一 种 在热 带 、 亚 热带地 区 生长 的豆 科灌木 植物 银合欢 ( eL cu ae an
le u co
` eP h al a) 中 。 当反当动物采食银合欢以后 ,在其瘤胃中产生另外两种有毒的中间代谢
产物 3 , 4D H P 和它的异构体 2 , 3 D H P 。 这些毒素物质会致使动物 出现甲状腺肿大 , 脱毛 ,
体衰和生育力减退等中毒症状 。 在世界上有些地区中毒情况是严重的 ,从而限制了富含蛋
白质达 25 %的银合欢作为饲料的开发利用 仁`〕 。 然而 ,在夏威夷 、 印度尼西亚 , 委内瑞拉以
及我国广西涸洲岛等地区的反当动物采食银合欢以后 ,并不出现中毒症状 叶一 6 〕 。 经研究发
现 ,在其瘤胃中生存着降解这些毒素的瘤 胃细菌 ,通过从不中毒向中毒的反色动物转灌瘤
胃液后能克服银合欢的毒性这一试验得到了证实〔6一 9 〕 。 lA h s on 首先从瘤胃中分离出具有
这种脱毒能力 的细菌 仁` 。〕 。 D o m i n g ue z 一B e l 。 研究了银合欢对瘤胃微生态的影响并分离出
形态不同的毒素降解菌 , `〕 。 然而 ,对脱毒细菌的种类报道的不多 ,仅有一个新属新种和一
株梭菌仁1 2 , 13 ] 。
银合欢在我国南方有广泛的种植 , 当地的草食动物对其有不 同程度的中毒反应 。 经
寻找发现涸洲岛的黄牛是不会因银合欢中毒的困 。 本文报道了从具有脱毒能力的涸洲岛的
现在地址 中囚 人民解放炭农牧大学 , 长春 13 f o O 6 2
本 夕 ! ,叩忿年 I 。 月 比 日收到
DOI : 10. 13343 /j . cnki . wsxb. 1994. 05. 008
微 生 物 学 报 4 3卷
黄牛瘤胃中 , 分离脱毒菌株和进行分离株的鉴定 。这对脱毒的瘤 胃微生物的研究 , 银合欢
的开发利用以及毗吮类化合物的厌氧降解的研究具有一定的价值 。
1 材料和方法
1
.
1 厌级方法
瘤胃细菌一般是厌氧的 。对严格厌氧菌的培养用亨格特 ( H u n ga t e ) 厌氧技术 , 具体
内容请参看作者以前的工作 〔“ 一 ` 6〕 。试验中的气相是无氧的 C 0 2 。
1
.
2 培养墓
1
.
2
.
1 F e
一
ZY 培养基 : 见 F e 一 2培养基 〔` , 〕 。补加酵母粉 (O x o id ) 0 . 0 5% . 1 1 3 `C 3 o分钟灭
菌 。
1
.
2
.
2 C P Y 基础培养基 : 近似酪脉培养基 〔川 。每 l o o m l 加酪陈 ( D i f e o ) 1 9 , 蛋白陈 (大
豆 ) 19 , 酵母粉 ( O x o id ) 0 . 2 59 , 盐溶液 I 、 I (见 F e 一 2培养基 ) 各 7m l , 瘤胃液一sm l ,
(琼脂 1 . 4 9 ) , 半胧氨酸盐酸盐 0 . 0 5 9 , N a ZC O 3 o . 4 9 , 刃天青溶液 ( 0 . 1% ) 0 . l m l 。 m C p Y ,
ZC P Y 和 3C P Y 培养基分别为在 C p Y 中加 m im o s i n e ( S i g m a C h e m i e a l C o . U S A ) 4 0 m g /
l o o m l
,
2
,
3 D H P ( A ld r i e h e h e m i e a l C o
.
I n e
.
M i lw a u k e e
,
W i
s U S A ) 5 0 m g / l o om l 和
3
,
4 D H P (用 m im o s i n e 水解制备 ) 〔`吕〕 s o m g八 o o m l 。 1 13 ℃ 3 0分钟灭菌 。 (瘤胃液 : 做培养
基用 , 采自北京农业大学带胃插管的实验牛 , 平时喂干草和粮食 。 )
1
.
2
.
3 P Y G 培养基 : 细菌鉴定用 , 按照 H ol de m a n 等人编著的一书 〔, ” 。
1
.
3 菌株的分离
分离用的瘤胃液样品来自涸洲岛的黄牛 , 用胃管采样 , 装满厌氧管 , 带到实验室 。用
F e
一
ZY 和 m C P Y 固体培养基做滚管分离单菌落和进行纯化 。 F e 一 ZY 培养基在初筛时有
用 , 因为具有降解含羞草素能力的细菌有可能在这个培养基中长出黑色菌落 〔 , 7〕 。真正的
筛选用 比色法和高效液相色谱法 〔20, 2` , 。培养温度 38 ’ C 。
1
.
4 菌株的鉴定
请参看作者以前的工作 〔“ 一 ` 6〕 。 乳酸旋光性的测定用 Ske r m a n 的方法 〔 2j , 用 L ( + ) -
和 D L 一乳酸试剂 ( lF u k a ) 作标样 , 所用仪器为岛津一 D 型旋光仪 。抗生素敏感性试验参照
戴自英编著一书的方法 ` , 3 , 。
1
.
5 测定毒紊的降解
将各毒素配成 0 . 4%水溶液 , 用 0 . 2 拜m 孔经的滤膜过滤灭菌 , 接种前加至 C P Y 培养
基中 , 测定培养一段时间的毒素降解率 。毒素的常规测定用比色法〔川 。决定性测定用高效
液相色谱法 〔21 〕 。两种方法都要先离心培养液 , 取其上清液进行分析 。高效液相色谱仪为
W
a t e r s 2 4 4型 , 柱子 N o v a p a k C l s ( 0 . 4 又 15 e m ) , 流动相 0 . 1%正磷酸水溶液 , 流速 0 . 7 m l /
m in
, 柱温为室温 , 紫外检测器波长 2 5 4 n m 。
2 结果
瘤胃细菌的种群之间关系密切 , 在分离纯化过程中比需氧菌困难得多 , 必须经过多
次纯化才能得到纯培养物 , 而且要善于识别具有多形态的纯培养物 。
5 期 谭蓓英等: 降解有毒的含羞草素和 二轻基毗陡化合物的瘤胃细菌
. 2 1分离菌株对毒素的降解
高效液相色谱的分析结果表明 , 菌株 B R 一 1 、 B R 一 2 、 B R 一 5和 B R 一 7能降解含羞草素 , 3 ,
4 D H P 和 2 , 3 D H P 。
一将这 4株菌分别进行纯菌培养 , 3天降解含羞草素 4 4一 59 % , 3 , 4 D H P 3。一 47 %和 2 ,
3 D H P 58 一 60 % 。其中 B R 一 5降解活性较高 。将这 4株菌进行混菌培养 ,混菌并没有高于单菌
的降解率 (表 1 ) 。
表 1 分离菌株对不同 . 素的降解率
T a b le l eD
g r a d a t i o n r a t e s o f i s o la t e s a g a in s t di ffe r e n t t o x in s
分离菌株
I s o la t e s
毒素降解率 (
eD g
r a d a t i o n r a t e s要) .t 0 X I D S
含羞草素
M II n o s i n e 3
,
4 D H P 2
,
3 D H P
B R
一
l
B R
一
2
B R
一
5
4 6
5 8
3 0
.
0
3 5
.
7
5 9
5 9
B R
一
7
BR
一
l
,
2
,
5
,
7混合
M i x e d
4 4
5 4
4 6
3 2
5 9
5 7
, 培养3天的降解率 。在 c p y 培养基中加含羞草素 , 3 , 4D H p 和 2 , 3 D H P 的终浓度分别为 4 0 、 5 0 、 5 0 ( m g /
l o o m l )
。 “
N D
, ’ 未测 。
D e g r a d a t l o n r a t e s s h o w i n 3 d a y s
.
F i n a l e o n e e n t r a t i o n s o f m i r n o s in e
,
3
,
4 1) H P a n d Z
,
3 D H P in C P Y m e d i u m w e r e
40 , 5 0
,
5 0 ( m g / 1 0 0m l ) r e s p e e t i v e ly
. “
N l )
n o t d e t e ` t e d
.
.2 2 菌株的鉴定
2
.
.2 1 B R
一
1和 B R 一 2菌株 : 来自初筛的黑色菌落 。在含毒素的培养基中细胞呈多形态 , 球
或球杆状 , 偶见棒骨状和退化的分支 。在 P Y G 培养基中细胞杆状 , 长短可变 (图 1一 1 , a2 ,
Zb )
, 在严格厌氧条件下常呈短杆或球杆状 , 。 . 7一 0 . 9 x 1 . 2一 2 . 2拜m , 在有氧情况下 , 一
些 细胞可伸长至 9一 5。拌m 。革兰氏阳性 , 不运动 , 不形成芽抱 , 巧℃和 45 ℃能生长 , 异型
乳酸发酵产 D (一 ) 一乳酸 、 乙酸 、 C O Z和 N H 3 。 发酵终 p H 4 . 5一 5 . 0 。 D N A 的 G + C 含量
分别为 51 . 5和 51 . 7 m ol % ( T m ) 。除了能还原硝酸盐是乳杆菌属的少见特征以外 , 它们具
备这个属的其它典型特性 。 B R 一 1和 B R 一 2菌株特性几乎相同 (尽管对含羞草素的降解能力
曾有不同 ) , 认为它们是同一个种 , 并鉴定为乳杆菌属 ( aL ct O ba c z’l “ : ) 〔24) 。这个种与 .L
fe mr en ut m, .L ber vis 和 L
.
de l b成 eC ik i三个种接近 , 但又不同 , 可能是一个新种 。
2
.
2
.
2 B R
一
5菌株 : 细胞球形 , 直径 0 . 6一 。 . 9拼m , 成对 , 成链或成堆 (图 1一 3) , 革兰氏阳
性 , 不运动 , 不形成芽袍 , 兼性和严格厌氧 , D N A 的 G + C 含量为 36 . Zm ol % ( T m ) , 鉴
定为牛链球菌 ( tS r ` P t oc oc cu : bo vi , ) , 各项特性与标准菌株的描述相同〔24) 。在该种的可变
特性中 , B R 一 5的特性是发酵阿拉伯糖 、 菊糖 、 蜜二糖 、 棉子糖 , 不发酵甘露醇 、 山梨醉 、
海藻糖和木糖 。该菌株耐热 , 经 80 ℃ 10 分钟处理后仍能生长 。对青霉素 G 敏感 (最低抑制
浓度 M ?(I < 0 . 4 u/ m l ) , 对 a 一氨基节青霉素具有抗性 (M CI > 4 0 0 u /m l ) 。

5期 谭蓓英等 :降解有毒的含 羞草素和二轻基毗吮化合物的瘤胃细菌 38 3
参 考 文 献
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W i l l i a m s a n d W i lk i n
于飞 , 香` 盔趋呀
38 4 微 生 物 学 报 3 4卷
RU MA E B NCI E R TA DE G RAI DNG TOI X C MI MO
-
SI I A E N N D DH Y DROX YI R P YI DE N
C O MU O S P N DI NCHI NA
’
Tan e Pi yi
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an gX umi n g什
(几 s ti t u t ef o M八 :r obi。翻舒 , A c a de , 讯 S认 cat , 刀己红云, 9 1 0 0 8 0 )
W a n g Ji n g
( I , s t it u t e of A爪ma l S c`~ e
,
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, e s e A ca de 柳 oJ 一 A g八 c u lt u ar l S e ie , c , s , Be 之万” 9 10 0 0 9 4 )
A b s t r a e t F o u r a n a e r o b i e s t r a i n s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e r u m e n o f t h e e a t t le w h i e h n o
s p e e i f i e t o x i e s y m P t o m s w e r e s e e n w h e n 及 u e a e n a w a s f e d i n W e i z h o u i s l a n d B e ih a i e i t y ,
G u a n g x i P r o v i n e e
,
C h i n a
.
A l l o f t h e s e s t r a i n s ( B R
一
1
,
B R
一
2
,
B R
一
5 a n d B R
一
7 ) p o s s e s s
d e g r a d a t i v e a e t i v i t i e s t o t o x i e m im o s i n e
,
3
一
h y d r o x y
一
4 ( I H )
一
p y r id o n e ( 3
,
4
一
D H P ) a n d
2
,
3
一
d ih y d r o x y P y r i d i n e ( 2
,
3D H P ) f r o m L o u e a e n a
,
t h a t w e r e e o n f i r m e d b y a n a l y s i s o f
H P I
J
C
.
P u r e a n d m i x e d e u l t u r e s o f t h e s e f o u r s t r a i n s i n v i t r o d e g r a d e d 4 4 一 5 9% ( ) f
tn im o s i n e
,
3 0一 4 7% o f 3 , 4 D H P , a n d 5 8一 6 0% o f Z , 3 D H P r e s p e e t iv e l y i n 3 〔l a y s .
S t r 口 i n s o f B o t h B R 一 1 a n d B R
一
2 w e r e a lm o s t id e n t i e a l a n d w e r e e h a r a e t e r ; Z
e
d a s
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e r o如 e i l l u s , m a y b e a n e w s P e e i e s . S t r a i n s o f B R 一 5 a n d B R 一 7 w e r e e h a r a 。 : 。 , : `: ` · `1 a s
S t r e户t o c oc e u s bvo i s a n d lC o s t r i d i u m sP 伪 1 〕g e ” e s r e s p e e t i v e l y . I t h a s n o l y 十 , 卜一 e n r e r) o r t e d
t h a t t h e s e G r a m p o s i t i v e f a e u l t a t i v e l y a n d o b l i g a t e l y a n a e r o b i e l
)一十 。 , ,。 w o r e a b l e t o
d e g r a d e m im o s i n e
,
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,
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,
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.
T h e s e d e t o x i e b a e t
( 。 : 、 · e 又 ;公 t i n g i n t h e
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u e a e n a t o x ie i t y
.
K e y w o r d s R u m e n b a e t e r ia
,
D e t o x i n
,
L e z一。 a e趁 a , M im ,) 、 i n 。
, 星一 、、 h y d r ( ) x y P y r id i一, 、 ·
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:
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,
W
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w a n t t o e x p
r e s s o u 艺 g r a t i亡tj d o l o w a r t l s 里〕卜. 孙 M 击 m月 . 八il1 夕 、 n 南口 卜 石则
h e lP o f m a n u s e r iP t
, Pa p e sr a n d c u l t u r e
二 P r e s e n t a d d r e s s : A g r i e u l t u r e a n d H u s b a n击 y U n i v e r s i t y o f C P I A . C h 扭n g 仁卜; n i : ,目。` 2 .