全 文 ：19 3 8年 吉 林 大 学 自 然 科 学 学 报 第 4欺
五汗究简报
用 荧 光 法 研 究 各 种 因 素 对 赤 豆
a
一 球 蛋 白 构 象 的 影 响
姜涌明 杨世忱 赵 荧 罗 速 ·
朱永宁` 王雅茹 ”
(化学系生化教研室 )
研究蛋白质变性 , 虽然已有五十多年的历史 , 但至今仍然是一个重要的研究课题 .
过 去 , 对蛋白质变性的研究 , 多偏重于动物及微生物的蛋白 , 对植物蛋白的变性研究不
多 . 用荧光法研究一些变性因素对赤豆 a 一球蛋白分子构象的影响 , 讫今未见 报道 . 本
文报道了这方面的研究结果 .
一 、 材料与方法
赤豆 a 一球蛋白制备 : 按文献 〔幻的方法稍加改进 , 从赤豆粉中制取 . 用 D ls C 电泳
法 〔幻鉴定蛋白纯度 , 用 L o w r y 法 〔 3 〕测定蛋白质浓度 。
实验所用的试剂 : K l 、 N a C I 、 H C I 、 T ir “ 、 睬素以及琉基乙酸均是二级纯 . 实验
使用重蒸馏水 。
用 o . o 2 5M p H 7 . 2 T r i s 一 H C I 缓冲液 (内含 5% N a C I ) 配置 l oM 脉 、 0 . 3 3%统基
乙酸 、 10 M 脉 一 0 . 3 % 琉基乙酸以及 o . 7M K I 溶液 . 其中 , 0 . 3 % 琉基乙酸及 10 M 腮
一 0 . 3 % 琉基乙酸用 4N N a O H 调 p H 二 7 . 2 , 抽真空 , 充氨气 , 备用 。 上述所有的溶液
在 2 80 一 S O0n m 波长范围内均无荧光 .
赤豆 a 一 球蛋白溶液 (粉红色 、 透 明 ) 在 p H 7 . 2 、 35 ℃下 , 分别用 SM 脉 、 。 。 26 %
琉基乙酸以及 SM 脉一 。 . 26 %筑基乙酸作用四小时以上 , 然后加等体积的 0 . o 25 M p H 7。 2
T ir s
一
H CI 缓冲液 , 或 0 . 7M K l , 测定其荧光光谱 .
赤豆 a 一球蛋白在含 5% N a C I的 o . o 2 5M p H 7 . 2的 T r i s 一 H C I缓冲液中 ,分别经过 6 0 。 、
70
。 、
80 ℃水浴加热二分钟 , 然后加等体积的上述缓冲液 , 或 。 . 7M K l , 测定其荧光光
谱。
蛋白质荧光光谱 : 用 R F 一 5 10 荧光分光光度计及 l o m m 正方形池 , 于室温下测定 。
激发和发射狭缝均为 s o m . 全部实验用 2 8 0n m 波长的光 激发 . 扫描波长范围是 2 80 一
5 0 0 n m
。
二 、 结果与讨论
经 D IS C 电泳鉴定 , 发现赤豆 a 一球蛋白制剂含有一条深色的区带和三条痕迹盆的细
本文于 19 83 年 4 月 21 日收到 .
甘 生化毕业生 ; ” 催化动力研究室 .
吉 林 大 学 自 然 科 学 学 报 19 83 年
带 。
1
.赤豆 a一球蛋白 和 自由 L一 T r p的 荧 光
光谱
赤豆 a一球蛋白有一个对称的荧光 峰 , 其峰
位在 3 4 0一 3 4 4 n m 见图 1 ( 4 ) 。
蛋白质内源性荧光主 要是由 T印 和 T y r 残
基所发射的 . 但是对于含 T r p 和 T y r 残基的 B
类球蛋白而言 , 由于其分子中从 T y r 残基到 T r p
残基之间发生了能量转 移 , 从而导 致了 T y r 残
基的荧光淬灭和 T rP 残基 的 荧光 增 加 〔 4〕 。 因
此 , B 类球蛋 白的荧 光峰实际上是 T rP 残基的
的荧光峰 , 其峰位一般在 32 5一 3 50n m 之间 . 赤
豆 a 一球蛋白分子含有 2 个 ` r r p 残基 、 ,l5 个 T y r
残基〔 1〕 , 属于 B 类球蛋 白 。 由此推测 , 赤豆 a -
球蛋白的 3 4 0一 3 4扭m 荧光峰是 T r p 残 基 的 荧
光峰 。
自由 L 一 1’ r p 水溶液有一个对称的荧 光 峰 ,
其峰位是 3 5 6 n m ( 图 1 (2 ) ) . 与大致相同浓度 的
自由 L 一 T r p 残基的荧光峰 相 比 , 赤豆 a 一球 蛋
白分子中 T r p 残基的 荧 光 峰 峰 位从 35 6n m 移
至 3 40 一 3 4 4n m , 其荧光强度大大提高 ( 图 1 ( 2) 与
波 一长 ( n m )
图 1 赤豆 a 一球蛋白与 L 一 T rP 的
荧光光谱比较
蛋白浓度 : s x l o 一 7肚 ; L 一 T印浓度 :
工 . 6 x 1 o 一 6刃 ; K l 浓度 3 50 m 肚 ; 灵敏度 :
10 4
; 测定温度 : 24 “ C .
1
.
L
一
T r p + K l : 2
.
L
一
T
r p :
3
. 蛋白+ K ;l 4 . 蛋白 .
1 (楼) 比较 ) 。 根据蛋白质荧光的经验性规律〔 ” , 我们推测 , 一部分 T r p 残基埋藏在赤豆
a 一球蛋白分子内部的疏水 区 . 35 o m M K I 能完全淬灭自由 L 一 T r p 的荧光 , 但只能使赤
豆 a 一球蛋白的荧光淬灭 3 % ( 图 1 ( 3 ) ) . 能被 I 一 淬灭荧光的芳香族氨基酸残基一定位
于蛋白分子表面上〔 4 〕 . 由此推测 , 有一部分 T r p 残基暴露在赤豆 a 一球蛋白分 子 的 表
面上 。
2
.
S M 眠对赤豆 a 一球蛋白分子构象的影响
SM 脉能使一般的蛋白质发生变性 . 赤豆 a 一 球蛋 白经 SM 脉作用 4 小 时以 上 , 其
荧光峰位红移 , 荧光强度大增 , I 一 淬灭荧光百分率从 3 . 6 % 增加到 4 2 . 4% (表 1 ) 。 这
表明 SM 腺使赤豆 a 一球蛋白分子发生了明显的构象变化 .
表 1 脉 、 琉基乙酸及热对赤豆 a 一球蛋白构象的影响
2分钟
荧光峰位 ( n m )
相对荧光强度
I 一 淬灭百分率 *
3 4 0一 3 4 4
1 5 6
3 3
.
6士2 . 9
3 50
18 0
4 2
.
4士1 . 6
琉基乙酸
3 5 0
4 8
2 4
.
2士0 . ]
疏基乙酸
3 5 6
2 5
心5 . 7士 1 . 7
3 4 0
1 4 8
2 1
.
0士 1 . 5
蛋白浓度 : 0 . 10 、 0 . 17 m g / lm ; 〔K l〕 : 3 50 m脸 ; pH 7 . 2 ; 放大 : 1 0 ` ; 测定温度 : 室温 .
五次实验平均值 .
第 4期 用荧光法研究各种因素对赤豆 “ 一球蛋白构象的影响
3
.
0
.
26 % 琉基乙酸对赤豆 a 一球蛋白分子构象的影响
赤豆 a 一球蛋白经 。 .26 %琉基乙酸作用 4小时以上 , 其荧光峰亦发生红移 , 荧光强 度
大大下降 , I 一淬灭荧光百分率从 3 3 . 6 %下降到 24 % (表 1 ) . 这表明琉基乙酸亦使 赤
豆 a 一球蛋白分子发生了较大的构象变化 . 但这种构象变化不同于 SM 脉所引起 的 构 象
变化 . 琉基乙酸能够破坏蛋白分子中的二硫键 〔 6〕 . 上述现象是否说明该蛋白分子 中存
在一些二硫键以及二硫键对维持该蛋白分子构象起一定作用 。 这些问题有待于今后深入
研究 。
4
.
S M 睬 一 。 . 29 %流基乙酸对赤豆 a 一球蛋白分子构象的影响
赤豆 a 一球蛋白经 SM 脉 一 0 . 26 %琉基乙酸共同作用 4 小时以上 . 与脉 、 琉的 单独作
用相比 , 其荧光峰位进一步红移 , 其荧光强度 , 不是象脉作用那样的增加 , 而是象琉作
用那样的下降 , 但下降的更大 , 其 I一 淬灭荧光百分率 , 不是象琉作用那样的 减小 , 而
是象脉作用那样的增加 , 但增加的更大 (表 1 ) 。 这表明脉 、 琉的共 同作 用使 赤豆 a -
球蛋白分子发生了明显的构象松散。 这种构象变化既不同于豚的 , 也不同于统的 。
5
。 热对赤豆 a 一球蛋白分子构象的影响
经 60 ℃加热 2 分钟 , 赤豆 a 一 球蛋白出现轻度的乳白色 , 其荧光峰位和荧光 强度 ,
变化不明显 , 但 I 一 淬灭荧光百分率大大减小 (表 1 ) . 这表明 60 ℃的热使赤 豆 a 一球蛋
白分子发生了构象变化 , 但这种变化不同于上述任何 因素所引起的构象变化。
SM 脉 、 。 . 26 % 琉基乙酸 、 SM 脉 一 0 . 26 % 琉基乙酸以及 60 ℃ 的热 , 使赤豆 a 一球蛋
白的荧光光谱发生了不同的变化 . 这表明 : 上述 因素都能使赤豆 a 一球蛋白分子 构象 发
生变化。 但不同的因素使赤豆 a 一球蛋白分子产生不同的构象状态 。
参 考 文 献
〔 1〕 林永齐等 , 吉林大学自然科学学报 , 4 , 阶 , ( 1 964) .
〔 2 〕 莽克强等 , 聚丙烯酞胺凝胶电泳 , 26 , 科学出版社 . 1 9 7 5年 .
〔 3 〕 C o o p e r . T . G . , T h e T o o l s o f B空o e h e m i s t r 了 , P . 与1 , 1 9 7 7 .
〔 4 〕 K h a n , 5 . M . , e t a 名. , 刀落o c h艺, . B艺。 尸 h , “ . A c t a 二 6 2 4 , 1 ( 19 8 0 )
.
〔 5 〕 F r e i f e l d e r , D . , P h y s i e a l B i o e h e m i s t r y , P . 4 10 . S a n F r a n e i s e e , 197 6 .
〔 6 〕 陶慰荪等 , 蛋白质分子基础 , 人民教育出版社 , 1 6 , 1 982 年 ,
S T U DY OF T H E E F F E C T S OF V A R IOU S D E N A T U R I N G
F A C TOR S ON T H E COM F ORM A T OI N OF 氏一G L OB U L IN
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( D e P a r t o e n才 o f C h e m i s t r y , J i l f o U n f v e r s i t夕 )