全 文 ：HPLC －荧光检测法测定犬血中紫花前胡苷
的浓度及其药代动力学初步研究*
李婧1，孙文霞2＊＊
(1．西南民族大学化学与环境保护工程学院，成都 610041;
2．四川抗菌素研究所有限公司，成都 610051)
摘要 目的:建立 HPLC －荧光法测定犬血浆中紫花前胡苷的浓度，初步研究紫花前胡苷在犬体内的药代动力学特征。方法:
以乙腈为蛋白沉淀剂，以 Hypersil BDS C18柱(200 mm #4． 6 mm，5 $m)为色谱柱，流动相为甲醇 － 0． 1% 磷酸溶液(45∶ 55) ;激
发波长为 360 nm;发射波长为 395 nm。Beagle犬 4 只，单次静脉注射紫花前胡苷 30 mg· kg －1，后肢静脉取血，采用 HPLC测
定血药浓度，并用 DAS 2． 0 程序计算药代学参数。结果:Beagle犬血浆中内源性成分对测定无干扰，紫花前胡苷的线性范围
为 0． 1 ～ 40． 0 $g·mL －1(r = 0． 9993) ，平均相对回收率为 89． 8% ～ 100． 7%，日内和日间 RSD均 ＜ 10%。紫花前胡苷在犬体内
的药代动力学过程符合开放二房室模型，主要药代动力学参数 t1 /2α、t1 /2β、V1、CL 和 AUC(0 － t)分别为(0． 536 ± 0． 085)h、
(3． 048 ± 0． 826)h、(0． 446 ± 0． 038)L·kg －1、(0． 417 ± 0． 108)L·h －1·kg －1和(68． 966 ± 16． 181)mg·L －1·h。结论:本方法
准确、灵敏、快速，适用于紫花前胡苷的血药浓度测定和药代动力学研究，为紫花前胡苷的开发和临床应用提供参考。
关键词:紫花前胡苷;高效液相色谱法;荧光法检测法;比格犬;血浆样品;药代动力学
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2013)03 － 0367 － 04
Determination of nodakenin in Beagle dogs plasma by
HPLC and its pharmacokinetics*
LI Jing1，SUN Wen － xia2＊＊
(1． College of Chemistry ＆ Environment Protection Engineering，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China;
2． Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu 610051，China)
* 西南民族大学 2011 中央高校基本科研业务费专项资金项目(No:11NZYTD06)
＊＊ 通讯作者 Tel:(028)84216049;E － mail:27918716@ qq． com
Abstract Objective:To establish a sensitive and reliable HPLC － fluorescence method to determine the concentra-
tion of nodakenin in Beagle dogs’plasma，and to investigate its pharmacokinetics． Methods:The plasma samples
were pretreated by acetonitrile for protein precipitation and were analyzed by HPLC． Separation and determination
were achieved on a Hypersil BDS column(200 mm × 4． 6 mm，5 μm)with the mobile phase consisting of 0． 1%
phosphoric acid － methanol(55∶ 45)． The excitation wavelength and the emission wavelength were set at 360 nm and
395 nm，respectively． Four dogs were administered with nodakenin by intravenous injection at a single dose of
30 mg·kg －1 ． The blood for test was taken from the vein on the posterior limb，and the plasma concentration was
determined by HPLC． The main parameters of pharmacokinetics were calculated by DAS 2． 0 software． Results:The
endogenous ingredients in the Beagle dog blood showed no interference to the determination． The range of linearity
was 0． 1 － 40． 0 $g·mL －1(r = 0． 9993)． And the mean recovery rate was 89． 8% － 100． 7% ． Both the intra － day
and inter － day RSDs were less than 10% ． The plasma concentration － time curve of nodakenin was conformed to be
a two － compartment open model． The main pharmacokinetic parameters t1 /2α，t1 /2β，V1，CL and AUC(0 － t) were
(0． 536 ± 0． 085)h，(3． 048 ± 0． 826)h，(0． 446 ± 0． 038)L·kg －1，(0． 417 ± 0． 108)L·h －1·kg －1 and(68． 966
± 16． 181)mg·L －1·h，respectively． Conclusion:This method is accurate，sensitive，rapid，and suitable for plas-
ma concentration determination and pharmacokinetic research of nodakenin，providing reference for its development
—763—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(3)
and application．
Key words:nodakenin;HPLC;fluorescence detection;Beagle dog;plasma sample;pharmacokinetics
紫花前胡苷(nodakenin，NDK) ，别名含紫花前
胡甙(结构式见图 1) ，是传统中药羌活 Notopterygi-
um incisum Tingex H． T． Chang 和紫花前胡 Peuceda-
num decursivum 中的主要药效成分之一，具有抗血小
板聚集、抗炎、镇痛、祛痰等功效［1 － 3］，近年来还有学
者研究表明紫花前胡苷具有一定改善学习记忆障碍
功效以及神经保护作用［4］。2010 年版中国药典新
增紫花前胡苷为羌活和紫花前胡的鉴别指标，并将
紫花前胡苷作为紫花前胡的质量控制指标［5］。紫
花前胡素具有广阔的开发前景，但是目前国内外对
紫花前胡苷的研究多集中在药效、含量测定等方
面［6 － 7］，对其药代动力学研究较少［8］。因此笔者建
立了灵敏的 HPLC －荧光法测定 Beagle 犬血浆中紫
花前胡苷的含量，为羌活和紫花前胡的合理用药以
及紫花前胡的新药开发提供参考。
图 1 紫花前胡苷的结构式
Fig1 Structural formula of nodakenin
1 仪器、试药与动物
日本岛津 LC －2010A型高效液相色谱仪;岛津
荧光检测器 RF － 10A;岛津 LC － solution 色谱工作
站;德国赛多利斯 BS224S 万分之一电子天平;
TGL －16B台式高速离心沉淀器，上海安亭科学仪器厂
生产;XW －80 型旋涡混合器，上海医科大学实验仪
器厂生产。紫花前胡苷原料药(含量 98． 5%，批号
20080711，上海华壹生物科技有限公司提供) ;乙腈
为色谱纯，美国 Fisher 公司;水为双蒸水;其余试剂
均为分析纯。Beagle犬普通级，雌雄各半，体重 8 ～
10 kg，由广州市医药工业研究所，生产许可证号为
SCXK(粤)2003 － 0007。
2 方法与结果
2． 1 色谱条件 色谱柱为 Hypersil BDS C18柱(200
mm #4． 6 mm，5 $m，美国热电有限公司) ;激发波
长:360 nm;发射波长:395 nm;流动相:甲醇 － 0． 1%
磷酸溶液(45 ∶ 55) ;流速:1． 0 mL·min －1;进样量:
10 μL;柱温:40 ℃。
2． 2 溶液的配制 取紫花前胡苷原料药适量，精密
称定，用甲醇配制成浓度为 1 mg·mL －1的溶液作为
储备液，临用前流动相稀释成相应浓度的工作对照
品溶液。
2． 3 血浆样品的测定方法 取血浆 0． 2 mL，加入
乙腈 0． 4 mL，旋涡沉淀蛋白 1 min，10000 r·min －1
离心 10 min，取上清液进样 10 μL，记录色谱图和峰
面积，以外标法按标准曲线计算血浆中紫花前胡苷
的浓度。
2． 4 方法的专属性 空白血浆、空白血浆 +对照品
按照“2． 3”项下方法测定，色谱图见图 2。紫花前胡
苷的保留时间约为 7． 2 min。血浆内源性物质及其
他杂质不干扰样品的分离测定。
图 2 紫花前胡苷的 HPLC色谱图
Fig 2 HPLC chromatograms of nodakenin
A．空白血浆(blank plasma of Beagle dog) B．空白血浆 +紫花前胡苷(blank plasma spiked with nodakenin)
1．紫花前胡苷(nodakenin)
—863— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(3)
2． 5 线性范围及定量限 精密吸取不同浓度的对
照品溶液 20 μL，加空白血浆 0． 2 mL，漩涡混合 1
min，使血浆中含紫花前胡苷浓度依次为 0． 1、0． 2、
0． 5、2． 0、5． 0、10． 0、20． 0、40． 0 $g·mL －1，照“2． 3”
项下方法处理，记录色谱图。以紫花前胡苷峰面积
A为纵坐标，以浓度 C 为横坐标进行加权(W = 1 /
C2)线性回归，得标准曲线方程为:
A = 5． 0153 × 105C + 1． 179 × 104 r = 0． 9993
在0． 1 ～40． 0 $g·mL －1范围内，紫花前胡苷的峰面积
与浓度线性关系良好，定量下限为 0． 1 $g·mL －1(S /
N≥10)。最低检测限为 0． 02 mg·L －1(S /N =3)。
2． 6 方法精密度 取空白犬血浆 0． 2 mL，配制低、
中、高 3 种不同浓度(0． 2、10． 0、40． 0 mg·L －1)的
标准血浆样品各 5 份，照“2． 3”项下方法操作。分
别在同一日内测定以及连续测定 3 d，考察日内和
日间精密度。结果见表 1。
表 1 精密度和回收率实验结果(n =5)
Tab 1 Results of precision and recovery
浓度
(concentration)
/ mg·L －1
日内精密度
(intra － day)
RSD /%
日间精密度
(inter － day)
RSD /%
提取回收率
(extraction rate)
/%
0． 2 6． 9 7． 1 60． 8
10． 0 8． 7 5． 5 58． 2
40． 0 1． 4 9． 8 69． 5
2． 7 回收率
2． 7． 1 提取回收率 取空白犬血浆 0． 2 mL，分别
配制成低、中、高浓度(0． 2、10． 0、40． 0 mg·L －1)的
标准苷血浆样品各 1 份，按“2． 3”项下方法操作记
录峰面积，每个浓度进样 3 次，计算各浓度的平均峰
面积 Ar。另以蒸馏水代替空白血浆，同法操作，计
算平均峰面积 As。以前后 2 种处理得到的峰面积
之比(Ar /As)计算提取回收率。结果 3 个浓度的平
均提取回收率为 62． 8%，RSD 为 9． 8%。结果见表
1。
2． 7． 2 方法回收率 取空白犬血浆 0． 2 mL，配制
低、中、高 3 种不同浓度的标准血浆样品各 5 份，照
“2． 3”项下方法测定，考察相对回收率。结果见表
1。
2． 8 稳定性试验 取空白血浆 0． 2 mL，配制高、
中、低 3 种不同浓度的标准血浆样品(40． 0、10． 0、
0． 2 mg·L －1) ，分别于室温放置 8 h，样品处理后于
样品室中 (4 ℃)放置 12 h，反复冻融 3 次，
－ 20 ℃冰箱冷冻 30 d，考察血浆样品的稳定性。测
定高、中、低 3 个浓度于室温放置 0、l、2、5、8 h 的浓
度，其 RSD分别为 3． 5%、8． 7%、5． 1%;测定样品室
中(4 ℃)放置 1、2、4、8、12 h的浓度，其 RSD分别为
2． 2%、3． 9%、1． 4%;反复冻融 3 次测得的 RSD 分
别为 9． 2%、5． 6%、5． 0%;－ 20℃放置 5、10、15、30
d测得的 RSD分别为 7． 2%、6． 3%、9． 8%。
3 动物实验
比格犬 4 只，圈养 1 周，实验前禁食 10 h。分别
于后肢静脉单剂量注射紫花前胡苷 30 mg·kg －1，
于给药前及给药后 0． 083、0． 25、0． 5、0． 75、1、2、3、
4、6、8、12、24 h 后肢静脉取血 2 mL，置肝素钠抗凝
管中，3000 r·min －1离心 10 min，分离血浆，－ 20 ℃
冰箱冷冻。
按照“2． 3”项下方法测定犬血浆中紫花前胡苷
的浓度。采用 DAS 2． 0 程序对血药浓度数据进行
药代动力学参数计算，拟合的药 －时曲线符合二室
开放模型，权重系数为 1 /C2。静脉给药后紫花前胡
苷在犬体内的药代动力学过程表现为一级动力学特
征。结果见图 3 和表 2。
图 3 紫花前胡苷犬单次静脉给药后的平均药时曲线图
Fig 3 Mean plasma concentration － time profile of nodakenin in Beagle
dogs after a single dose of intravenous administration
表 2 主要药代动力学参数(n =4)
Tab 2 Main pharmacokinetic parameters
of nodakenin in Beagle dogs
参数
(parameter)
单位
(unit)
平均值 ± SD
(mean ± SD)
t1 /2α h 0． 536 ± 0． 085
t1 /2β h 3． 048 ± 0． 826
V1 L·kg － 1 0． 446 ± 0． 038
CL L·h － 1·kg － 1 0． 417 ± 0． 108
AUC(0 － t) mg·L －1·h 68． 966 ± 16． 181
AUC(0 － ∞) mg·L －1·h 75． 285 ± 17． 513
K10 h － 1 0． 926 ± 0． 163
K12 h － 1 0． 433 ± 0． 138
K21 h － 1 0． 297 ± 0． 073
MRT(0 － t) h 1． 347 ± 0． 283
—963—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(3)
4 讨论
目前测定紫花前胡苷浓度的方法主要为
HPLC － UV法、气相色谱法［9］和荧光分析法［10］，其中
以 HPLC － UV 法最为普遍。张鹏等［11］采用 RP －
HPLC法对紫花前胡苷在大鼠体内的药代动力学进
行了研究，发现大鼠口服紫花前胡苷后，紫花前胡苷
的吸收程度很低，血药浓度非常低;通过体外实验［12］
将紫花前胡苷与人肠道菌群进行孵育，发现紫花前胡
苷在菌群的作用下进行了生物转化，主要代谢为紫花
前胡内酯。因此笔者在进行研究时采取静脉给药方
式。秦彩玲等［13］研究表明小鼠口服紫花前胡苷 10、
40、80 mg· kg －1都有明显的镇痛作用;张鹏等大鼠
单剂量静脉注射紫花前胡苷的药代动力学研究的剂
量为80 mg· kg －1，根据动物每公斤体重剂量折算系
数计算，笔者采用的给药剂量为30 mg· kg －1。犬静
脉注射紫花前胡苷后，其分布半衰期 t1 /2α和消除半衰
期 t1 /2β分别为(0． 536 ±0． 085)h和(3． 048 ±0． 826)h，
表明紫花前胡苷在犬体内分布和消除均较快;稳态表
观分布容积为1． 145 L·kg －1，中央室分布容积为
0． 466 L·kg －1，占总表观分布容积的 40． 7%，说明
药物主要分布在大循环和血流丰富的器官中。
考虑到血浆样品中药物浓度低、干扰大等因素，
笔者建立了HPLC －荧光检测法测定紫花前胡苷的血
药浓度，灵敏度较 HPLC － UV 法高，最低定量限为
0． 1 mg·L －1，满足血药浓度测定要求;采用乙腈直接
沉淀蛋白处理血浆样品，具有前处理简单，成本较低
等优点。结合紫花前胡苷的结构特点和理化性质，紫
花前胡苷母核上有较多羟基，pH 对其保留时间和峰
形具有一定影响，笔者对甲醇的比例以及流动相 pH
进行了筛选，对 0%、0． 05%、0． 1%、0． 5%、1%的磷酸
溶液进行比较，随着酸浓度的增加拖尾改善，0． 1%、
0． 5%、1%磷酸的分离效果均较好，考虑到色谱柱使
用寿命的影响选择 0． 1%磷酸溶液。对 20%、30%、
45%、60%的甲醇比例进行比较，结果在甲醇 － 0． 1%
磷酸溶液(45∶ 55)条件下，紫花前胡苷的出峰时间、峰
对称性较优，而且不受内源性成分的干扰，因此选择
甲醇 －0． 1%磷酸溶液(45∶ 55)为流动相。
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(本文于 2012 年 5 月 29 日收到)
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