全 文 ：·试验研究·
正交试验优化超声波辅助法提取赤小豆黄酮技术研究
收稿日期:2015-06-15 修回日期:2015-06-27
基金项目:山西省科技攻关项目(20140311005 － 3)。
第一作者简介:刘建霞(1977-) ，女，山西山阴人，讲师，硕士，食用豆种质资源研究与利用。
刘建霞1，王润梅1，温日宇2
(1．山西大同大学，山西 大同 037009;2．山西省农业科学院 玉米研究所，山西 忻州 034000)
摘 要:以赤小豆黄酮的提取率为指标，采用单因素和正交试验对超声波辅助提取工艺条件进行优选。结果
表明:赤小豆黄酮最佳提取工艺条件为料液比 1∶ 50(g·mL －1) ，乙醇的体积分数 70%，超声时间 70 min，超声
功率 100W，在此条件下黄酮提取率为 0． 581%，4 个因素对赤小豆黄酮提取效果的影响大小为乙醇体积分数
＞料液比 ＞超声功率 ＞超声时间。
关键词:赤小豆;黄酮;提取;超声波辅助法
赤小豆，豆科植物，别名赤豆、赤小豆，是亚洲
的主要豆类作物之一，以我国种植最多［1］。赤小
豆含丰富的营养，其中蛋白质含量 17． 5% ～
23． 3%，淀粉 48． 2% ～60． 1%，食物纤维 5． 6% ～
18． 6%［2］，同时，中医认为赤小豆特质甘平，能够
补血、利小便、消胀满、通乳、解毒，对风湿、黄疸尿
赤、脚气浮肿都有很好的治疗作用。
黄酮类物质于植物、果浆等物质中含量丰富。
它是一种抗氧化剂，能够很好地消除人体内的氧
自由基，这样可以有效地阻止细胞的衰老，并在预
防癌症方面有很重要的意义。黄酮也可以改善血
液循环、大大降低心脑血管疾病的发病率、亦能降
低胆固醇。同时对糖尿病引发的视网膜病有很好
的疗效。黄酮含量的高低对评价赤小豆药效价值
很重要，对赤小豆的药理作用，药理活性的研究有
极其重要的理论意义和实用价值［3 ～ 4］。
目前，我国对很多植物黄酮的研究已经相对
成熟，常用的提取黄酮的方法有超声波辅助提取
法、乙醇浸提法、微波加热提取法［5 ～ 11］等。但并
未发现赤小豆黄酮含量的研究及相关论文。超声
波辅助提取法可以破坏细胞组织从而强化浸提效
果，具有提取时间短、效率高等优点［12］，笔者实验
以赤小豆为材料，研究超声波辅助法提取总黄酮
最佳提取工艺条件，为今后更好的利用赤小豆资
源提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
山西忻州赤小豆种子，由山西省农科院玉米
研究所提供。
无水乙醇(天津市化学试剂供销公司) :分别
配制体积分数为 50%、60%、70%、80%、90%的
乙醇溶液。
氢氧化钠(NaOH 天津市北方天医化学试剂
厂) :配制 4%的 NaOH溶液。
亚硝酸钠(天津市化学试剂供销公司) :配制
5%的 NaNO2 溶液。
硝酸 铝 (北 京 化 工 厂) :配 制 10% 的
Al(NO3)3溶液;
芦丁标准品(都莱生物) :含量≥95%。
1． 2 仪器与设备
JA5003B型 千分之一电子天平(上海精科天
美科学仪器有限公司)
UV －1200 型 紫外可见分光光度计(上海美
国谱达仪器有限公司) ;
KQ － 400KDE 型 高功率数控超声波清洗器
(昆山市超声仪器有限公司) ;
XFB － 500 型 新型密封式摇摆高速粉碎机
(吉首市中诚制药机械厂)功率 1． 5 KW。
DHG － 9023 型 电热鼓风干燥箱(金坛市国
旺实验仪器)
1． 3 实验方法
1． 3． 1 芦丁标准曲线的制作 把芦丁放在
101 ℃干燥箱中烘 1． 5 h，达到恒重后取出。用分
析天平称取 0． 005 g 芦丁放入 50 mL 容量瓶中，
用无水乙醇配制体积分数为 60%的乙醇溶液，然
后将其加入放有芦丁的 50 mL 的容量瓶中，得到
质量浓度为 0． 1 mg·mL －1芦丁标准液，放入冰箱
里冷藏保存，以备用。
取两支 10． 00 mL的具塞试管 A、B 洗净。在
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A试管精确加入 0． 50 mL 芦丁标准溶液，B 试管
精确加入 0． 50 mL 赤小豆黄酮提取液。A、B 试
管分别加入配好的 60%乙醇至 5． 00 mL ，再加入
0． 30 mL 5%的 NaNO2 溶液，摇匀后静置等待 6
min;然后加入 0． 30 mL10% Al(NO3)3 溶液，摇
匀之后静置再等待 6 min;再加入 4． 00 mL 4%的
NaOH溶液，连续滴加蒸馏水至 10． 00 mL 刻度，
摇匀后，静置等待 20 min 后，用实验室的紫外扫
描仪检测芦丁和赤小豆黄酮的共同最大吸收波
长。结果显示:波长为 300 nm时芦丁和赤小豆黄
酮的吸光度同时很高，所以用选择 300 nm作为建
立标准曲线的波长。取六支 10． 00 mL 的刻度试
管，洗净，贴上标签，准确滴加芦丁标准溶液，分别
滴加 0． 00、1． 00、2． 00、3． 00、4． 00、5． 00 mL，重复
NaNO2 － Al(NO3)3 法的步骤，摇匀后开始测定六
支试管中芦丁液的吸光度，得到芦丁标准液浓度
与吸光度值见表 1，按一贯的画坐标的方式，然后
以芦丁标准溶液的浓度为横坐标，芦丁的吸光度
值为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方
程为:y = 0． 2513x + 0． 1615，Ｒ2 = 0． 9914。
表 1 芦丁标准液浓度与吸光度值
标准液体积 /mL 0． 0 1． 0 2． 0 3． 0 4． 0 5． 0
标准液浓度 /(mg·mL －1) 0． 000 0． 010 0． 020 0． 030 0． 040 0． 050
吸光度(A) 0． 000 0． 400 0． 604 0． 943 1． 183 1． 407
图 1 芦丁标准曲线
1． 3． 2 赤小豆粉的制备 赤小豆种子在干燥、阴
凉处保存，先用手去除一些相对较大的杂质，挑选
出大小均等、颗粒饱满的种子。用新型密封式摇
摆高速粉碎机将赤小豆种子粉碎，于 60 ℃烘箱里
烘干 3 h，达到恒重后取出。将最终得到的粉末用
纸包好，贴上标签，以区分不同品系。
1． 3． 3 赤小豆黄酮的提取和含量测定工艺 取
七个烧杯洗净，将高速旋转粉碎机研磨好的赤小
豆粉分别放在七个烧杯中，于 60 ℃烘箱中烘干 3
h到恒重。再准备 21 个洗净的 100 mL 的烧杯，
每个品系的赤小豆做三组重复实验。贴上标签，
以将其区分开来。将每种赤小豆粉准确称量 2． 5
mg放到相应烧杯，按固液比 1∶ 40 配比，即向每个
烧杯加入酒精 100 mL，所用酒精为用无水乙醇配
置的 70%的酒精。采用超声辅助法对黄酮进行
提取，由于实验室条件的限制，超声清洗仪不能调
节温度，所以整个实验过程温度不变，恒为 33 ℃，
超声功率为 100 W，超声震荡 1． 5 h 以后，冷却至
室温。
将震荡完毕的提取液离心处理后吸取 0． 50
mL滤液于 10． 00 mL 刻度试管中。按照上述的
NaNO2 － Al(NO3)3 法的步骤继续添加试剂，使用
紫外可见分光光度计于 300 nm 下测量黄酮的吸
光度值。
1． 3． 4 赤小豆黄酮含量和提取率的计算
赤小豆黄酮含量计算方法:
Ｒ = ρ × 10 × 40 ÷(m ×1000)
Ｒ ─赤小豆种子中黄酮含量(mg·L －1) ;ρ─
由标准曲线算得的黄酮含量(mg· mL －1) ;
m ─赤小豆种子的质量(g)。
赤小豆黄酮提取率计算方法:
黄酮提取率% =总黄酮质量 /样品质量 × 100
1． 3． 5 黄酮提取工艺的优化 主要有:
(1)乙醇体积分数对提取的影响。准确秤取
山西忻州赤小豆粉 5 份，各 0． 50 g，置于 5 支 10
mL刻度试管中。用 50%、60%、70%、80%、90%
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的乙醇溶液，均至 10． 00 mL处，待乙醇提取 0． 5 h
后，将 5 支装有待测液的试管放置在 33 ℃的超声
波清洗器中进行震荡 1． 5 h，最后重复 NaNO2 －
Al(NO3)3法添加试剂，利用紫外可见分光光度计
测量 5 支试管中溶液的吸光度。
(2)超时时间对提取的影响。准确秤取山西
忻州赤小豆粉 5 份，置于 10． 00 mL 试管中，将配
置好的 70%的酒精滴加至 10． 00 mL 处，待乙醇
提取 0． 5 h后，将 5 支装有待测液的试管放置在
33 ℃的超声波清洗器中进行震荡。震荡 0． 5 h、1
h、1． 5 h、2 h、2． 5 h 后重复 NaNO2 － Al(NO3)3 法
添加试剂，测量各待测液的吸光度。
(3)料液比对提取的影响。准确秤取山西忻
州赤小豆粉 5 份，各 0． 5g，分别置于 15． 00 mL、
20． 00 mL、25． 00 mL、30． 00 mL、35． 00 mL 试管
中，将配好的 70%的酒精溶液滴加至相应刻度
处，浸提 0． 5 h 后，分别置于 33 ℃超声波清洗器
中进行超声波震荡。震荡 0． 5 h 后重复 NaNO2 －
Al(NO3)3 法的步骤，测量各待测液的吸光度。
(4)超声功率对提取的影响。洗净五支
10． 00 mL刻度试管，将每支试管加入山西忻州赤
小豆粉 0． 50 g。然后将配制好的 70%的乙醇溶
液滴加至刻度 10 mL，待乙醇提取 0． 5 h 后，将 5
支装有待测液的试管放置在 33 ℃的超声波清洗
器中进行震荡。震荡功率分别为 60 W、70 W、80
W、90 W、100 W 震荡 1． 5 h 后重复 NaNO2 －
Al(NO3)3法的步骤，测量各待测液的吸光度。
1． 3． 6 正交试验 根据单因素的试验结果，选择
乙醇体积分数、超声时间、料液比、超声功率四因
素进行 L9(3
4)正交试验，正交试验因素水平见表
1。以提取液吸光度为考察指标，研究各因素对提
取率的影响，从而确定最佳的提取工艺条件。
表 2 正交试验因素与水平
水平
因 素
A乙醇体积分数 /% B超声时间 /min C料液比(g∶ mL) D超声功率 /W
1 60 50 1∶ 40 80
2 70 70 1∶ 50 90
3 80 90 1∶ 60 100
2 结果与分析
图 2 乙醇体积分数对提取效果的影响
2． 1 乙醇体积分数对提取的影响
由图 2 可知，随着乙醇体积分数的增加，黄酮
提取率稍有增加。当乙醇体积分数达到 70%时，
黄酮提取率最高，随后随着乙醇体积分数的继续
增加，黄酮提取率有所下降。可能是不同体积分
数乙醇极性不同，导致对黄酮物质的溶解能力不
同，当体积分数过高时，对黄酮物质本身结构有影
响［13 ～ 15］，使其结构被破坏。
2． 2 超声时间对提取的影响
图 3 超声时间对提取的影响
由图 3 可知，随着超声时间的增加黄酮提取 率增大，超声时间在 50 ～ 90min 时总黄酮提取率
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刘建霞，等:正交试验优化超声波辅助法提取赤小豆黄酮技术研究
较大，但当超声时间从 30min 增加到 50min 时，总
黄酮提取率急剧增加，随后再继续增加到 90 min
时，总黄酮提取率相差不大，当超声时间超过
90min 后总黄酮提取率开始减少，可能因为时间
延长，黄酮物质会不稳定，随后发生分解或可能转
化为其它的物质，不利于总黄酮的提取。
2． 3 料液比对提取的影响
从图 4 可以看出，随着提取液用量的增加，黄
酮提取率有所增大，当达到 1 ∶ 60(g·mL －1)时，
黄酮提取率达到最大，然后随着提取液的继续增
加，黄酮提取量呈下降趋势，料液比的多少，体现
的是其与黄酮的接触面积，以及溶解黄酮的多少，
当达到最高，呈平稳趋势，说明黄酮已经被全部溶
解，故不再增加。
2． 4 最佳超声功率的研究
由图 5 可知，随着超声功率增加，黄酮提取率
逐渐升高，当超声功率达到 80W 时，黄酮提取率
最大，而后基本达到稳定状态。可能是超声功率
小时，不能使物料充分受到超声的作用，类黄酮提
取不完全［16］。
图 4 料液比对提取效果的影响
图 5 超声功率对提取效果的影响
2． 5 正交试验优化超声波辅助法提取黄酮条件
根据单因素试验得到的提取条件用正交试验
优化乙醇体积分数、超声功率、超声时间、料液比
等提取条件，确定影响因素并设计正交试验。表
3 为正交试验结果，表 4 为正交试验方差分析
结果。
表 3 正交试验设计与结果
编号 A B C D 黄酮提取率 /%
1 1 1 1 1 0． 424
2 1 2 2 2 0． 49
3 1 3 3 3 0． 218
4 2 1 2 3 0． 594
5 2 2 3 1 0． 406
6 2 3 1 2 0． 428
7 3 1 3 2 0． 274
8 3 2 1 3 0． 21
9 3 3 2 1 0． 206
K1 0． 306 0． 360 0． 284 0． 274
K2 0． 476 0． 368 0． 430 0． 398
K3 0． 230 0． 284 0． 300 0． 340
Ｒ 0． 246 0． 084 0． 130 0． 124
因素顺序 A ＞ C ＞ D ＞ B
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陕西农业科学 2015 年第 61 卷第 11 期
表 4 正交试验方差分析
方差来源 平方和 S^2 自由度 f 均方 S F值
A 0． 102 2 0． 059 2． 083＊＊
B 0． 089 2 0． 038 1． 886*
C 0． 106 2 0． 092 2． 845＊＊
D 0． 026 2 0． 000 0． 000
总和 0． 323 8
采用直观分析法，对各因素的 k 及 Ｒ(极差)
值的大小进行分析。从试验结果可以看出:极差
Ｒ由大到小的顺序是 A ＞ C ＞ D ＞ B，极差值越大，
说明该因素对指标值的影响越大，所以在提取过
程中影响赤小豆总黄酮提取的主要因素是乙醇体
积分数，其次是料液比、超声功率，影响最小的是
超声时间。从方差分析结果看出，乙醇体积分数
和料液比对赤小豆总黄酮提取率影响达到极显
著，超声时间达到显著水平，综合以上单因素试
验、正交试验结果选择 A2B1C2D3 为最佳提取工
艺条件，即用超声波辅助法提取赤小豆总黄酮的
最优提取条件为乙醇体积分数 70%、超声时间 70
min、料液比 1∶ 50 (g·mL －1)、超声功率 100 W，
在最佳提取条件下进行验证实验，赤小豆总黄酮
提取率为0． 581%，与正交试验结果基本一致。
3 结论与讨论
笔者研究利用超声集成丙醇 － 硫酸铵双水
相体系对紫菜中总黄酮进行提取分离。结果表
明，本方法可有效地从紫菜中提取总黄酮，紫菜总
黄酮提取率为 0． 148%，明显高于乙醇 － 水回流
提取法。最优提取条件是醇水比 0． 6、硫酸铵质
量浓度 0． 30 g·mL －1、超声时间 20 min、料液比
0． 04。实验表明紫菜中含有较丰富的黄酮类物
质，提取物对·OH 具有良好的抑制作用，是一种
有效的天然自由基清除剂，具有很大的开发利用
前景。但所提取的黄酮类物质的组份结构目前还
不清楚，需要进一步的研究确定。
经过单因素试验和正交验证性试验，用超声
波辅助提取法提取对赤小豆中黄酮进行提取分
离，得出最优并且可行的赤小豆黄酮提取条件是:
在温度为 33 ℃时，超声时间 70 min，乙醇体积分
数为 70%，料液比为 1∶ 50 (g·mL －1) ，超声功率
100 W。在该提取条件下赤小豆黄酮提取率达到
0． 581%。
在上述研究中，存在很多待分析的问题，比如
在烘干过程中黄酮是否有损失;所提取的黄酮类
物质的组份结构目前还不清楚;测量吸光度时的
比色皿是否用乙醇润洗，若没有润洗将会影响待
测液的吸光程度以及其它方法提取和测定结果是
否会比笔者实验的方法更优，在后续的研究中，为
提高黄酮提取率，还需要对提取工艺方法进一步
优化。
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