全 文 ：第 10 卷第 1 期
2 0 1 4 年 2 月
南 方 水 产 科 学
South China Fisheries Science
Vol. 10，No. 1
Feb.，2014
doi:10. 3969 / j. issn. 2095 － 0780. 2014. 01. 012
收稿日期:2013-10-08;修回日期:2013-10-30
资助项目:国家自然科学基金项目(21205138) ;公益性行业(农业)科研专项经费项目(200903030) ;海洋公益性行业科研专项(201005020-
7)
作者简介:牛改改(1989 －) ，女，硕士研究生，从事水产品加工与质量安全研究。E-mail:gaigainiu@ 163. com
通信作者:李来好(1963 －) ，男，研究员，博士，从事水产品加工与质量安全研究。E-mail:laihaoli@ 163. com
加速溶剂萃取技术提取海刀豆中总黄酮的工艺研究
牛改改1，2，邓建朝2，李来好2，杨贤庆2，邓用川3，
吴燕燕2，郝淑贤2，戚 勃2
(1. 中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266000;2. 中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工
重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州 510300;3. 海南大学农学院，海南 海口 570228)
摘要:运用加速溶剂萃取技术(accelerated solvent extraction，ASE) ，通过单因素试验和响应面分析法优化海刀豆
(Canavalia maritima)中总黄酮的提取工艺。在单因素试验的基础上，选取萃取温度、萃取时间和甲醇体积分数 3
个因素为自变量，总黄酮提取率为响应值，采用 Box-Behnken试验设计方法，研究各因素的显著性及其交互作用
对总黄酮提取率的影响。利用 Design Expert软件，建立了提取率与各因素的二次多项式数学模型，得到了海刀
豆中总黄酮的最佳提取条件:萃取压力 10. 3 MPa，萃取温度 130 ℃，萃取时间 16 min，甲醇体积分数 66%，循
环次数 2 次，总黄酮提取率为 83. 43%，与理论值相对偏差 － 1. 63%。
关键词:海刀豆;黄酮;加速溶剂萃取;响应面分析
中图分类号:TS 254. 9 文献标志码:A 文章编号:2095 － 0780 －(2014)01 － 0078 － 08
Extraction of flavonoids from Canavalia maritima by
accelerated solvent extraction
NIU Gaigai1，2，DENG Jianchao2，LI Laihao2，YANG Xianqing2，
DENG Yongchuan3，WU Yanyan2，HAO Shuxian2，QI Bo2
(1. College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266000，China;2. Key Lab. of
Aquatic Product Processing，Ministry of Agriculture;National Ｒ＆D Center for Aquatic Product Processing;South
China Sea Fisheries Ｒesearch Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300，China;
3. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228，China)
Abstract:Based on a single-factor analysis，we used Ｒesponse Surface Methodology (ＲSM)to optimize the method for extraction of
flavonoids by accelerated solvent extraction (ASE)technology from Canavalia maritima. The extraction temperature，static extraction
time and methanol concentration were chosen as independent variables and the flavonoids extraction rate was selected as response val-
ue;Box-Behnken method was adopted for the designment of the experiment to study the significance of each factor and its mutual influ-
ence on extraction rate. Then we utilized Design Expert software to establish the mathematical model of polynomial quadratic equation.
The optimum conditions of flavonoids extraction were as follows:130 ℃ of extraction temperature，16 min of extraction time，66% of
methanol concentration and static circulate twice. The extraction rate was 83. 43% at the optimum conditions and the relative error be-
tween the actual and predicted values was only 1. 63% .
第 1 期 牛改改等:加速溶剂萃取技术提取海刀豆中总黄酮的工艺研究 79
Key words:Canavalia maritima;flavonoids;accelerated solvent extraction;response surface methodology
海刀豆(Canavalia maritima)属于豆科刀豆属，
在中国沿海滩涂有广泛分布，其主要成分为黄酮、
黄烷类、甾醇类化合物［1 － 3］。总黄酮广泛存在于各
种植物和大型真菌中，具有多种生物活性［4］。近
年来，槲皮素、芦丁等物质用于临床使得总黄酮的
研究日益活跃，研究发现相当一部分总黄酮具有显
著的生理及药理活性，例如抗氧化、抗病毒、抗肿
瘤、抗炎、抗抑郁、抗焦虑、调节血管渗透性、改
善记忆、中枢抑制、神经保护等功能，这些生理和
药理特性使其广泛应用于食品、医药等领域［5 － 6］。
加速溶剂萃取是利用升高温度和压力来增加物质溶
解度与溶质扩散速率，从而提高萃取率的一种样品
前处理方法［7 － 8］。ASE 具有比传统萃取方法耗时
短、使用溶剂量低、自动化高的优势［9］，现已成
为较好的样品前处理方法之一，广泛应用于食品、
环境、药物等行业。响应面分析法(response sur-
face methodology，ＲSM)是以多元二次回归方程式
的形式将多因子试验中因素与指标的相互关系近似
拟合，依此对函数的响应面和等高线进行分析，研
究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关
系［10 － 11］。与过去广泛使用的“正交试验设计法”不
同的是，ＲSM 具有试验周期短，求得的回归方程
精度高，能研究几种因素间交互作用等优点［12 － 13］。
目前，中国对海刀豆中总黄酮的提取工艺研究
较少，其他原料中总黄酮的提取多采用机械振荡
法［14］、微波辅助萃取法［15］、超声提取法［16］、索
氏提取法［17］等。笔者研究采用加速溶剂萃取法提
取海刀豆中总黄酮，并采用响应面分析法对其工艺
条件进行了优化，为之后海刀豆中总黄酮的分离纯
化及其性质的研究奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
海刀豆(采于海南沿海滩涂) ;硅藻土，芦丁
标准品(广州市奇云生物技术有限公司出品) ;甲
醇为分析纯;试验用水均符合 GB /T 6682 一级水
的标准。
1. 2 仪器
ASE300 加速溶剂萃取仪(美国 Dionex 公司出
品) ;分析天平(瑞士 Mettler-Toledo公司出品) ;紫
外-可见分光光度计(上海元析仪器有限公司出品) ;
超声波清洗仪(德国 Elma 公司出品) ;高速万能粉
碎机(天津市泰斯特仪器有限公司出品)。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 总黄酮提取率的测定
1)配制芦丁标准溶液。准确称取充分干燥后
的芦丁标准品 5. 00 mg，用 30%的乙醇溶解，并定
容至 25 mL，摇匀，即得到质量浓度为 0. 2 mg·
mL －1的标准溶液。
2)标准曲线的建立［18］。准确吸芦丁标准液 0、
1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL和 6 mL，分别置
于 25 mL容量瓶中，各加入 5%亚硝酸钠(NaNO2)
溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min。加入 10%硝酸铝
［Al(NO3)3］溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min，加入
10 mL 5%氢氧化钠(NaOH)溶液，用 30%乙醇稀
释至刻度，摇匀放置 10 min，以空白溶液为参比，
用分光光度计在 510 nm处测定吸光值(OD)。作芦
丁浓度-吸光度标准曲线，得回归方程。
3)海刀豆总黄酮含量的测定。经过单因素及
响应面试验分析得出 ASE 提取海刀豆中总黄酮的
最优条件为萃取压力 10. 3 MPa，萃取温度 130 ℃，
萃取时间 16 min，甲醇体积分数 66%，循环次数 2
次，且在该条件下多次提取后分别按照芦丁标准曲
线测定法测定吸光值，直至吸光值稳定不变代表总
黄酮提取完全，代入回归方程得出质量浓度，计算
出各提取液中总黄酮的质量;多次提取出的总黄酮
质量之和即为海刀豆中总黄酮的总质量 M。
将各试验所得提取物用 30%的乙醇溶解并定
容于 50 mL容量瓶中，取 0. 5 mL 移入 25 mL 容量
瓶中，按照芦丁标准曲线测定法测定吸光度，代入
回归方程得出质量浓度 C，计算出提取率［19］。
提取率(%)= 100 × C (mg·mL
－1)× 10 －3
总黄酮质量 M(g)
×
100
1. 3. 2 ASE 提取海刀豆中总黄酮 新采集到的
海刀豆经过清洗，干燥后用粉碎机粉碎待用;分别
精确称量 5. 00 g 海刀豆粉末与硅藻土，混匀后装
于底部放有玻璃纤维素滤纸片的 34 mL的不锈钢萃
取池中，在一定的萃取温度、萃取压力、萃取时
间、甲醇体积分数和循环次数下，进行加速溶剂萃
取。萃取液经过减压浓缩后按照上述方法测定吸光
值，计算提取率。
80 南 方 水 产 科 学 第 10 卷
1. 3. 3 单因素试验 影响总黄酮提取率的因
素主要有萃取温度、萃取时间、甲醇体积分数、
循环次数、萃取池体积。该试验分别对各个因素
选取 5 个水平，进行单因素试验［20］，来考察各因
素对总黄酮提取率的影响。单因素试验因素水平
表见表 1。
1. 3. 4 响应面分析法试验设计 在单因素试验
基础上，根据 Box-Behnken的中心组合试验设计原
理［21］，选取对提取率有较显著影响的 3 个因素即
萃取温度、萃取时间、甲醇体积分数，设计 3 因素
3 水平的响应面分析试验方案。响应面因素与水平
表见表 2。
表 1 单因素试验因素与水平设计
Tab. 1 Factors and levels for single factor analysis
水平
level
萃取温度 /℃
temperature
萃取时间 /min
time
甲醇体积分数 /%
methanol concentration
循环次数 /次
cycle
萃取池体积 /mL
size of extraction pool
1 50 5 50 1 10
2 70 10 60 2 34
3 90 15 70 3 66
4 110 20 80 4
5 130 25 90 5
表 2 Box-Behnken设计试验因素与水平
Tab. 2 Factors and levels for Box-Behnken design
编码水平
code level
萃取温度 /℃
temperature (A)
萃取时间 /min
time (B)
甲醇体积分数 /%
methanol concentration (C)
－ 1 90 10 60
0 110 15 70
1 130 20 80
2 结果与分析
2. 1 标准曲线的绘制
图 1 是以芦丁为标准样品绘制的标准曲线，线
性拟合方程式为 y = 9. 700x + 0. 016，Ｒ2 = 0. 992。
测定样品的吸光度，从标准曲线上读取对应的浓
度，计算出样品中总黄酮的提取率。
2. 2 单因素试验
2. 2. 1 甲醇体积分数对总黄酮提取率的影响
分别精确称取 5. 00 g 海刀豆粉末与硅藻土混匀，
确定提取条件为萃取温度 70 ℃，压力 10. 3 MPa，
萃取时间 10 min，循环 1 次，分别以 50%、60%、
70%、80%、90%和 100%甲醇为萃取溶剂进行萃
取，提取液减压浓缩后测定总黄酮含量，以 3 次试
验平均值来表示提取率，结果见图 2。随着甲醇体
积分数的升高，总黄酮提取率增加，当甲醇体积分
数达到 70%时提取率达到最大值，之后随着甲醇
体积分数的增加，总黄酮提取率降低。因此，选取
图 1 芦丁标准曲线
Fig. 1 Standard curve of rutin
70%甲醇作为最佳萃取溶剂。
2. 2. 2 萃取时间对总黄酮提取率的影响 分别
精确称取 5. 00 g 海刀豆粉末与硅藻土混匀，确定
提取条件为萃取温度 70 ℃，压力 10. 3 MPa，萃取
第 1 期 牛改改等:加速溶剂萃取技术提取海刀豆中总黄酮的工艺研究 81
图 2 甲醇体积分数对总黄酮提取率的影响
Fig. 2 Effect of concentration of methanol on
extraction rate of flavonoids
图 3 萃取时间对总黄酮提取率的影响
Fig. 3 Effect of time on extraction rate of flavonoids
溶剂 70%甲醇，循环 1 次，分别静态萃取 5 min、
10 min、15 min、20 min 和 25 min，提取液干燥后
测定总黄酮质量，以 3 次试验平均值来表示提取
率，结果见图 3。静态萃取时间越长，提取率越
高，然而，15 min 与 25 min 对提取率的影响变化
不显著(P ＞ 0. 05) ，且考虑到提取效率以及提取试
剂的用量，以 15 min为最佳萃取时间。
图 4 萃取温度对总黄酮提取率的影响
Fig. 4 Effect of temperature on extraction
rate of flavonoids
2. 2. 3 萃取温度对总黄酮提取率的影响 分
别精确称取 5. 00 g海刀豆粉末与硅藻土混匀，确
定提取条件为压力 10. 3 MPa，萃取时间 10 min，
萃取溶剂 70% 甲醇，循环 1 次，分别在 50 ℃、
70 ℃、90 ℃、110 ℃和 130 ℃下进行萃取，提取
液浓干后测定总黄酮含量，以 3 次试验平均值来
表示提取率，结果见图 4。随着萃取温度的升高
总黄酮提取率依次升高，在升至 110 ℃ 之后，
110 ℃与 130 ℃对提取率的影响变化不显著(P ＞
0. 05)。因此考虑到试验成本，最优的萃取温度
以 110 ℃为宜。
2. 2. 4 循环次数对总黄酮提取率的影响 分别
精确称取 5. 00 g 海刀豆粉末与硅藻土混匀，确定
提取条件为萃取温度 110 ℃，压力 10. 3 MPa，静
态萃取时间 15 min，萃取溶剂 70%甲醇，分别循
环 1、2、3、4 和 5 次，提取液干燥后测定总黄酮
提取率，以 3 次试验平均值来表示，结果见表 3。
随着循环次数的增加，提取率依次增加;然而循环
2、3、4 和 5 次对提取率的影响差异不大，且循环
次数越多耗费时间越长，使萃取效率大大降低，故
循环次数以 2 次为宜。
表 3 循环次数对总黄酮提取率的影响
Tab. 3 Effect of cycles on extraction rate of flavonoids
循环次数 /次 cycle 1 2 3 4 5
提取率 /% extraction rate 73. 45 ± 0. 23a 76. 34 ± 0. 67b 77. 28 ± 0. 34b 78. 31 ± 0. 59b 78. 91 ± 0. 41b
注:同一行中拥有不同小写字母的表示有显著性差异(P ＜ 0. 05) ;后表同此
Note:Different lowercase letters represent significant difference among different treatments (P ＜ 0. 05) ;the same case in the following table.
82 南 方 水 产 科 学 第 10 卷
2. 2. 5 萃取池体积对总黄酮提取率的影响 分
别精确称取 5. 00 g 海刀豆粉末与硅藻土混匀，确
定提取条件为萃取温度 110 ℃，压力 10. 3 MPa，
萃取时间 15 min，萃取溶剂 70%甲醇，分别用 10
mL、34 mL和 66 mL 的萃取池进行萃取，提取液
干燥后测定总黄酮提取率，结果见表 4。同样条件
下 34 mL 萃取池能够得到较高的提取率，因此 34
mL萃取池为最优选择。
2. 2. 6 各因素与提取率的方差分析 利用 SPSS
17. 0 软件对不同提取条件下总黄酮提取率进行方
差分析，结果见表 5。萃取温度、萃取时间、甲醇
体积分数、循环次数对总黄酮提取率均影响显著甚
至极显著，循环次数对于总黄酮提取率的影响不如
其他 3 个因素显著。
表 4 萃取池体积对总黄酮提取率的影响
Tab. 4 Effect of extraction pool volume on extraction rate of flavonoids
萃取池体积 /mL size of extraction pool 10 34 66
提取率 /% extraction rate 38. 72 ± 0. 71a 78. 27 ± 0. 64b 64. 59 ± 0. 58c
表 5 单因素试验的方差分析(F /P)
Tab. 5 Single-factor analysis of variance
因素
factor
甲醇体积分数
concentration of methonal
萃取时间
time
萃取温度
temperature
循环次数
cycle
F 513. 16 36. 90 287. 86 19. 19
P ＜ 0. 000 1 0. 000 7 ＜ 0. 000 1 0. 007 7
注:P ＜ 0. 05 为显著;P ＜ 0. 01 为极显著
Note:significant at P ＜ 0. 05;very significant at P ＜ 0. 01.
表 6 试验设计及结果
Tab. 6 Test design and results of Box-Behnken method
试验序号
test No.
萃取温度
temperature (A)
萃取时间
time (B)
甲醇体积分数
concentration of methonal (C)
提取率 /%
extration rate
1 0 0 0 77. 46
2 0 － 1 1 67. 47
3 0 0 0 78. 37
4 1 0 － 1 83. 87
5 0 1 － 1 65. 62
6 0 0 0 82. 96
7 0 － 1 － 1 65. 41
8 1 1 0 82. 39
9 － 1 － 1 0 54. 49
10 0 0 0 84. 52
11 － 1 1 0 64. 33
12 － 1 0 1 76. 97
13 1 － 1 0 62. 73
14 0 1 1 76. 03
15 － 1 0 － 1 67. 57
16 1 0 1 78. 91
17 0 0 0 85. 57
第 1 期 牛改改等:加速溶剂萃取技术提取海刀豆中总黄酮的工艺研究 83
2. 3 模型方程的建立与显著性分析
根据单因素试验将显著影响总黄酮提取率的 3
因素的适合区间列于表 2。采用 Box-Behnken 设计
法，对海刀豆中总黄酮提取进行 3 因素 3 水平的优
化试验，考察各因素之间的交叉影响;以 3 次试验
所得总黄酮提取率的平均值为响应值，结果见表
6。17 个试验点可分为 2 类:1)析因点。自变量取
值在各因素所构成的三维顶点，共有 12 个析因点;
2)零点。为区域的中心点，零点试验重复 5 次，
用以估计试验误差。
采用 Design Expert 8. 05 软件对各因素进行方
差分析［22 － 23］，结果见表 7。回归模型极显著(P ＜
0. 01) ，并且其失拟性不显著(P ＞ 0. 05) ，说明回
归模型能够较好地预测相应的响应变量;萃取温度
与萃取时间对总黄酮提取率有显著影响，甲醇体积
分数对总黄酮提取率的影响相对不显著，然而，单
因素试验数据说明甲醇体积分数对于总黄酮提取率
的影响是显著的，其原因可能在于 3 个因素之间对
响应值有着交叉影响，且萃取温度和萃取时间对响
应值的影响要比甲醇体积分数显著;即影响响应值
因素的显著性顺序为萃取温度、萃取时间、甲醇体
积分数。因此各个因素对响应值的影响不是简单的
线性关系，经回归拟合后可用如下二次多项回归方
程(响应值由 y 表示)表示:y = － 310. 98 + 3. 25A
+ 9. 73B + 3. 17C + 0. 02AB － 0. 02AC + 0. 04BC －
0. 01A2 － 0. 48B2 － 0. 01C2
表 7 方差分析表
Tab. 7 Analysis of variance
方差来源
soruce of variation
平方和
sum of squares
自由度
df
均方
mean square F P
显著性
significance
Model 1 265. 80 9 140. 64 7. 97 0. 006 1 ＊＊
A 247. 98 1 247. 98 14. 06 0. 007 2 ＊＊
B 183. 07 1 183. 07 10. 38 0. 014 6 *
C 35. 74 1 35. 74 2. 03 0. 197 6
AB 24. 11 1 24. 11 1. 37 0. 280 6
AC 51. 55 1 51. 55 2. 92 0. 131 1
BC 17. 43 1 17. 43 0. 99 0. 353 3
A2 60. 70 1 60. 70 3. 44 0. 106 0
B2 605. 73 1 605. 73 34. 35 0. 000 6 ＊＊
C2 5. 56 1 5. 56 0. 32 0. 591 9
残差 residual 123. 45 7 17. 64
失拟量 lack of fit 69. 90 3 23. 30 1. 74 0. 296 7
纯误差 pure error 53. 55 4 13. 39
总离差 total 1 389. 25 16
注:* . 显著(P ＜ 0. 05) ;＊＊. 极显著(P ＜ 0. 01) ;不显著(P ＞ 0. 1)
Note:* . significant (P ＜ 0. 05) ;＊＊. very significant (P ＜ 0. 01) ;not significant (P ＞ 0. 1)
2. 4 响应面分析对总黄酮提取率的影响
3 个因素之中两两因素对响应值的交叉影响
见图 5、图 6 和图 7。在 3D 响应面图中，响应值
随着因素数值的增加变化增大，即斜面的倾斜度
越大，说明该因素对响应值(提取率)的影响越显
著。在等高线中，两两因素构成的等高线越像椭
圆形，说明这两种因素对于响应值有着交叉影
响。因此，响应面呈规则的凸起形，表明在试验
因素水平范围内存在极大值，即响应面的最高
点;萃取温度与萃取时间的等高线呈椭圆形，即
两者之间存在交叉影响(图 5) ;响应值随着萃取
时间的增加变化显著，而随甲醇体积分数增加变
化不明显，萃取温度与萃取时间的等高线呈椭圆
形，即说明两者之间存在着交叉影响且萃取时间
比甲醇体积分数对响应值影响显著(图 6) ;响应
值随着萃取温度与甲醇体积分数的增加变化均显
84 南 方 水 产 科 学 第 10 卷
图 5 萃取温度和萃取时间对总黄酮提取率影响的响应面与等高线
Fig. 5 Ｒesponse surface and contour for effects of temperature and time on extraction rate of flavonoids
图 6 萃取时间和甲醇体积分数对总黄酮提取率影响的响应面与等高线
Fig. 6 Ｒesponse surface and contour for effects of time and concentration of methanol on extraction rate of flavonoids
图 7 萃取温度和甲醇体积分数对总黄酮提取率影响的响应面与等高线
Fig. 7 Ｒesponse surface and contour for effects of temperature and concentration of methanol on extraction rate of flavonoids
著，而萃取温度与甲醇体积分数的等高线呈线条
状，说明两者之间无交叉影响(图 7)。
2. 5 最佳预测条件
由响应面软件 Design Expert 分析得到的海刀
豆中总黄酮的最佳提取条件见表 8，由于这 2 组
条件比较接近，所以选取第一组条件进行验证，
为了操作方便将条件修正为萃取温度 130 ℃，萃
取时间 16 min，甲醇体积分数 66%，循环 2 次，
3 次平行试验所得总黄酮提取率分别为 82. 40%、
84. 61%和 83. 27%，平均值为 83. 43%，与预测
值相对偏差 － 1. 63%，说明该模型具有一定的适
用性。
第 1 期 牛改改等:加速溶剂萃取技术提取海刀豆中总黄酮的工艺研究 85
表 8 总黄酮提取率的最佳预测条件
Tab. 8 Optimum of extraction rate of flavonoids
序号
No.
萃取温度 /℃
temperature
萃取时间 /min
time
甲醇体积分数 /%
concentration of methanol
提取率 /%
extraction rate
理想值
ideal value
1 130 16. 33 65. 99 84. 808 1 0. 666
2 129. 99 16. 34 66. 08 84. 808 0 0. 666
3 结论
通过单因素试验优化条件，根据 Box-Behnken
设计法进行试验得出数据，最后经过响应面分析得
出加速溶剂萃取技术提取海刀豆中总黄酮的最佳工
艺条件为萃取温度 130 ℃，萃取时间 16 min，甲醇
体积分数为 66%，循环次数 2 次，得到的理论提
取率为 84. 81%，经验证实际提取率为 83. 43%。
通过响应面可知各单因素对海刀豆中总黄酮提取率
的影响显著性顺序为萃取温度 ＞萃取时间 ＞甲醇体
积分数 ＞循环次数。
参考文献:
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京:中国科学院研究生院，2006.
［2］黄新苹，朱校斌，林文瀚，等 . 海刀豆中的紫檀素和异黄酮化
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