全 文 ：峨眉黄连及近缘种DNA提取与 RAPD反应的优化
武敬亮 1 ,田桂香2 ,高志芹3 ,韩玉平4
(1 潍坊医学院普通生物学教研室 , 山东 潍坊　261042;2 麻醉学系;3 细胞生物学教研室;4 潍坊第十四中学)
　　[ 摘　要] 　目的　对峨眉黄连及其近缘种植物进行 DNA的提取和 RAPD的反应条件的优化。方法　CTAB 法提取 DNA , RAPD
研究多样性。结果　模板 DNA 的浓度 20ng 反应～ 60ng 反应;dNTPs 的适宜浓度范围为 0.2 ～ 0.3mmol L;Mg2+的适宜浓度范围为 2.
0 ～ 2.5mmol L;其合适的复性温度为 39～ 40℃;1min的延伸时间 , 40次热循环。结论　按照此优化的 RAPD条件进行重复实验 , 实验
结果重现性良好 ,为峨眉黄连及近缘种的分子生物学研究奠定基础。
　　[ 关键词] 　黄连;DNA;RAPD;优化
　　[ 中图分类号] 　Q 789　　　[ 文献标识码] 　A　　[ 文章编号] 　1004-3101(2007)02-0139-03
The Improvement of DNA Extracing and RAPD in Coptis
WU Jing-liang1 , TIAN Gui-xiang2 , GAO Zhi-qin3 ,HAN Yu-ping4
(1Department of General Biology , Weifang Medical College , Weifang　261042 , China;2Department of Anesthesiology;
　3Department of Cell Biology;4 The Fourteenth Middle School of Weifang)
　　[ ABSTRACT] 　Objective　The optimization of RAPD analytical conditions of the coptis were studied in this paper.Methods　CTAB and
RAPD.Results　The optimal PCR system for RAPD was as follows:1.5～ 2.0mmol L Mg2+ , 20 ～ 60ng template , 150 ～ 200μmol L dNTPs in 25μl
reaction solution , and 45 cycles of 4 min at 95℃, 60s at 94 , 40～ 50s at 39 ～ 40℃, 60 ～ 90s at 72℃, with 40 Thermal Cycles.Conclusion　A high
reproducibility was obtained under the optimized experimental conditions.
　　[ KEY WORDS] 　Coptis;DNA;RAPD
　　峨眉黄连(Coptis omeiensis (Chen)C.Y.Cheng)是毛茛科植
物 ,习称”岩连” , 野生 , 为国家二级濒危保护植物[ 1] , 过去常作
为”南品” 。其特点是:叶片窄长 , 形似雉尾 , 故又有”凤尾连”的
美称。它的单枝略微弯曲 ,表面黑褐 , 断面金黄 ,比家种黄连色
泽更深 ,味道更苦 , 质量更优。其近缘种包括黄连(Coptis chinen-
sis Franch.)、三角叶黄连(C.deltoide C.Y.Cheng et Hsiao)、云南黄
连(C.teeta Wall)、短萼黄连(C.chinensis Franch.var.brevisepala
W.T.Wang et Hsiao)、五裂黄连(C.quinquesecta W.T.Wang)。黄
连具有较高的药用价值 ,本文对峨眉黄连及 3 个近缘种的 DNA
提取和 RAPD反应条件进行了探索 , 得到较为合理的实验程序 ,
以探讨峨眉黄连及其近缘种的亲缘关系 、与环境的关系以及它
们之间的遗传多样性。
1　材料和方法
1.1　材料 、试剂和仪器　4 种黄连:三角叶黄连和峨眉黄连采
自四川峨眉山市 ,黄连采集于重庆石柱自治县黄连 GAP基地 ,
云南黄连采集于云南怒江自治州 , 毛茛采集于四川南充市。随
机引物 S 系列 、TaqDNA 聚合酶和 dNTP由上海生工生物工程公
司生产。
1.2　实验方法
1.2.1　总 DNA 提取　根据顾红雅[2]方法改进 , 取-75℃冻存
叶片研磨成粉状 ,取 0.1g转入 1.5ml离心管中 , 加入 500μl提取
缓冲液 100mmol L Tris·HCl(pH 8.0), 3%可溶性 PVP , 20mmol L
β-巯基乙醇 , 20mmol L EDTA(pH 8.0), 8000r min 离心 5min ,弃上
清 , 取沉淀重复洗涤 l次 , 再取沉淀加入 500μl裂解缓冲液(2%
CTAB , 100mmol L Tris·HCl , 1.4mol L NaCl , 20mmol L EDTA), 65℃
水浴 30min ,不时轻轻颠倒 , 取出上清加入 500μl苯酚 氯仿 异戊
醇(25∶24∶l),颠倒成乳浊状 , 10 000r min离心10min , 取上清加入
0.6 倍(V V)冷异丙醇 , 置室温 1h , 12 000r min 离心 10min , 取沉
淀 ,溶于 100μl TE。然后 37℃水浴 lh ,用等体积苯酚 氯仿 异戊
醇(25∶24∶1)和氯仿 异戊醇(24∶1)抽提 , 取上层加入 l 10(V V)
3mmol L NaAl , 加入 2.5 倍(V V)无水乙醇沉淀 , -20℃冰箱
30min , 12 000r min离心 10min ,沉淀用 70%乙醇洗涤 ,晾干后 , 溶
于 50μl TE 中 , -20℃保存备用。利用紫外分光光度计法和琼脂
糖凝胶电泳检查 DNA ,浓度由OD260 OD280值确定。
1.2.2　PCR-RAPD　DNA扩增 RAPD实验参考Williams 等[ 3] 创
建的方法 。反应在 Tgradient Chermocycle型 PCR仪上进行 , 从 S
系列 40 个引物中 ,共筛选出 20个扩增多态性好的引物。本实
验选用了其中的 S27 , S32等引物 , 其序列为 S27:GAAACGGGTG 与
S32:TCGGCGATAG。 反应体积为 25μl , 基础含量:10 ×reaction
Buffer(不含 Mg2+)2.5μl , 0.2mmol L dNTPs , 0.3μmol L 引物 , 2.
5mmol L MgCl2 , 1.5U Taq 酶 , 40ng 模板 DNA。从扩增产物中取
10μl扩增产物 , 经 EB 染色 , 用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 , 在
139 潍坊医学院学报　2007 年　第 29 卷　第 2期
[ 作者简介] 　武敬亮(1979年 5～ ),男(汉族),助教 ,硕士学位。研究方向:植物生物技术学。
UVPHOTO M.W型凝胶成像系统中观察 , 分析 ,记录。
2　结果
2.1　dNTPs用量对 PCR结果的影响　dNTPs 作为 PCR反应的
原料参与新链 DNA 的合成过程 , 对循环数 ,产物扩增的量有较
大的影响 ,浓度过低 , 偶然性大 , 无扩增产物或扩增产物不稳
定;浓度过高则会导致聚合酶错误掺入 , 影响扩增的特异性和
精确性。 Williams 等[ 4] 的 RAPD 实验中每种 dNTPs 浓度为
100μmol L;在以后的研究中常使用 100 ～ 200μmol L 的 dNTPs-
[ 5～ 8] 。综合考虑这些因素 ,本实验的 dNTPs 浓度梯度设置在 50
～ 300μmol L之间(见图 1)。实验结果表明:在黄连的 RAPD实
验中 , dNTPs 浓度在 150 ～ 300μmol L 范围内均获得较好的扩增
效果 ,但以 200 ～ 300μmol L范围内的实验结果最为稳定 ,其扩增
带型相似。因此我们认为 , 黄连的 RAPD实验的最佳的 dNTPs
浓度为 200～ 300μmol L。
2.2　RAPD中模板 DAN 用量的适宜范围　模板 DNA 的用量是
影响 RAPD扩增产物的一个重要因素 , 它制约着扩增产物的量
及特异性 , RAPD实验的模板浓度范围较大 , 不同物种的最适浓
度范围有所不同 ,需经过实验来确定[ 9 ～ 11] 。本实验在 20 ～ 50ng
之间设置模板 DNA 用量梯度(见图 2)。结果表明:模板 DNA浓
度对PCR结果影响不显著 , 在 20～ 60ng 反应的模板 DNA 含量
条件下均扩增出了基本相同的带型;超过 80ng 以后 , 扩增出来
的带弱 , 甚至出现弥散现象 , 致使谱带难以辨认。这可能是由
于模板浓度过高所致。另外 ,模板 DNA的纯度也一定程度上影
响 RAPD。因此 DNA 浓度的适宜范围为 20～ 60ng 反应 。
2.3　Mg2+浓度对 PCR结果的影响　Mg2+是PCR反应的一个决
定性因子 ,它不仅影响扩增的真实性及产物的特异性 , 而且影
响酶活性 、引物的退火温度 、引物二聚体的形成等方面。 确定
镁离子最佳浓度至关重要。镁离子浓度过低 , Taq 酶有所失活 ,
过高则会使引物的错配频率增加[ 12 ～ 15] 。 本实验在 1.0 ～ 2.
5mmol L之间设置 Mg2+浓度梯啡。研究结果表明 , Mg2+在 0.2
～ 2.0mmol L范围内 , 谱带的强度和亮度随着 Mg2+浓度的增加
而增加;当 Mg2+浓度为 1.5～ 2.5mmol L时扩增出谱带数多达 6
～ 8 条 ,且亮度理想;Mg2+浓度超过 2.0mmol L 以后 , 扩增出来
的带弱 ,同时出现弥散现象 , 较难辨认。总之 , 在黄连 RAPD实
验中 ,Mg2+浓度在 1.0～ 2.5mmol L范围内其扩增出的带型基本
相似 ,但以 Mg2+浓度为 2.0～ 2.5mmol L的谱带效果最佳。
表 1　PCR热循环参数
退火温度(T ℃) 延伸时间(t s) 循环次数(次)
38 40 38
39 50 40
40 60 42
41 90 45
2.4　PCR热循环的反应参数　本实验针对延伸时间 、退火温度
以及循环次数等条件进行了试验 ,所有程序的基本条件为 95℃
预变性 4min , 94℃变性 30s ,退火温度为 40℃,延伸温度为 72℃,
循环次数 40 ,经循环后在 72℃条件下反应 4min , 4℃条件下取
出。对退火温度 , 延伸温度和循环次数进行多次对比分析(如
表 1)。结果表明:退火温度 39 ～ 40℃可以取到理想的带谱;退
火时间以 40 ～ 60s为宜;而扩增时间以 60～ 90s 比较合适。循环
次数 40 ～ 45 次都可以满足要求。
2.5　黄连 RAPD反应体系的确立　影响随机引物 PCR反应的
因素很多 , 实验结果的质量是由反应中各因子共同作用决定
的。通过对影响实验结果的各因子交互组合实验 ,本研究最后
确立黄连的 RAPD 反应体系 10 × reaction 25μl:dNTPs 2.0μl
(200μmol L),Mg2+ 1.5μl(1.5mmol), Primer 1.0μl(5pmol), Taq 1.
5U , ddH2O 16.5μl , Template 1.0μl(20 ～ 40ng), Total 25.0μl。反应
过程为 45 个循环 , 40℃退火 50s , 72℃延伸 90s。
3　讨论
　　研究表明 , 采集黄连幼嫩叶片可以更好地提取黄连属植物
DNA[ 16] 。本试验采用改良 CTAB 法 , 在提取液中加入 β-巯基乙
醇和 PVP两种抗氧化剂 , 可防止 DNA 的褐化。另外苯酚∶氯仿∶
异戊醇(25∶24∶l)抽提 2 次 , 可有效除去蛋白 、多糖和酚类等物
质 , 获得的 DNA 的质量和纯度都较好。 RAPD 反应条件严格 ,
Mg2+ , Taq DNA 聚合酶 、引物 、模板 DNA 和 dNTP 及反应缓冲液
等因素均能影响扩增结果 , 并且不同物种的 RAPD反应体系差
别也较大。本实验通过一系列研究发现:虽然 RAPD反应涉及
诸多因子 , 但通过严格控制反应条件 , 保证所有反应都在同一
反应体系下完成 , 如使用同一厂家相同批号的 Taq DNA 聚合
酶 , 采用相同的扩增程序 , 就能获得重复性好 、稳定可靠的结
果。本试验为了使 RAPD体系具有较高的稳定性 , 对模板 DNA
的浓度 、dNTPs 的浓度 、Mg2+的浓度以及反应程序中的各种条件
分别进行研究 , 建立了适应于黄连 RAPD 试验的反应体系:
dNTPs 2.0μl(200μmol), Mg2+ 2.0μl(2.0mmol), Primer 1.0μl
(5pmol), Taq 1.5U , ddH2O 16.5μl , Template 1.0μl(20～ 40ng), Total
25.0μl ,所得到的 RAPD图谱重现性好 、稳定性强 , 认为 RAPD 可
作为黄连属植物分子生物学研究的标记方法。
　　(本文图 1 , 2 见封四)
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[收稿日期] 　2006-12-20
肺活检对弥漫性肺疾病的诊断价值
杨国儒 ,李　风 ,张绍坤 ,段胜利 ,张　勇 ,李　新
(潍坊市第二人民医院呼吸科 ,山东 潍坊　261041)
　　[摘　要] 　目的　探讨肺活检对弥漫性肺疾病的诊断作用。方法　对 1999年 ～ 2006年 2月 31例肺活检的
弥漫性肺疾病患者进行回顾性分析 。结果　31例患者均获病理确诊 ,其中普通型间质性肺炎(UIP)8例(其中合
并肺腺癌 2例),肺结核 5例 ,腺癌 3例。急性间质性肺炎(AIP)、结节病 、脱屑性间质性肺炎(合并肺腺癌 1例)各
2例。隐源性间质性肺炎(COP)、非特异性间质性肺炎(NSIP)、肺组织细胞增生症-X 、慢性嗜酸粒细胞性肺炎
(CEP)、肺泡蛋白沉着症 、韦格纳肉芽肿病(WG)、肺奴卡氏菌病 、双肺炎性结节 、肺原发性恶性淋巴瘤各 1例。结
论　对常规 、支气管镜及肺穿刺活检未能确诊的病例 ,开胸肺活检作为一种诊断方法 ,能获得足够的肺组织 ,具有
很高的敏感性和特异性 ,尤其是一些罕见病和不典型的病例 ,具有较大的价值。
　　[关键词] 　活组织检查;肺弥漫性疾病;病理学;诊断
　　[中图分类号] 　R 563　　　[文献标识码] 　A　　[文章编号] 　1004-3101(2007)02-0141-02
Lung Biopsy in Diagnosis of Diffuse Parenchymal Lung Disease
YANG Guo-ru , LI Feng , ZHANG Shao-kun , DUAN Sheng-li , ZHANG Yong , LI Xin
(The Second People s Hospital of Weifang , Weifang 　261041 , China)
　　[ ABSTRACT] 　Objective　To evaluate the role of lung biopsy in diagnosis of diffuse parenchymal lung diease.Methods　thirty-one patients
with diffuse parenchymal lung disease who underwent lung biopsy from 1999 to February 2006 were reviewed.Results　The documented pathologic
diagnosis in 31 patients with diffuse parenchymal lung disease who underwent lung biopsies were:8 UIP , 5 tuberculosis , 3 lung cancer , 2 AIP , 2 scar-
coidosis , 2 DIP , 1 nocardiosis , 1 COP , 1 NSIP , 1 CEP , 1 PAP , 1 histiocytosis-X , 1 WG.Conclusious　Most of these patients did not definitely diag-
nosed through their clinical evaluation including history , chest X-ray and TBLB(or lung biopsy).Open lung biopsy , is a useful method , as it is sensi-
tive and specific in diagnosis of diffuse parenchymal lung disease.it is helpful in diagnosing rare and atypical diffuse parenchymal lung disease.
　　[ KEY WORDS] 　Biopsy;Diffuse parenchymal lung disease;Pathology;Diagnosis
　　虽然弥漫性肺疾病可通过临床症状 、体征 、影象和
实验室资料进行诊断 ,但肺活检仍属必要 ,经皮肺穿刺
活检或经支气管镜肺活检(TBLB)为目前最常用的方
法 ,大多数病例能获得确诊 。对一些病例因获取肺组
织标本小 ,对病理诊断具有一定局限性 。开胸肺活检
或经电视胸腔镜肺活检作为一种诊断方法 ,能提供较
141 潍坊医学院学报　2007 年　第 29 卷　第 2期
[ 作者简介] 　杨国儒(1963年 2月 ～ ),男(汉族),山东省平度市人 ,副主任医师 ,学士学位 ,硕士研究生导师。主要研究方向:呼吸病学。
潍坊医学院学报
双月刊(1979年创刊)
2007年　第 29卷　第 2期 (总第 106期)
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