全 文 ：HPLC法同时测定黄芪中槲皮素 、山柰酚 、芒柄花素的含量
石继亮 1 ,单玉 1, 2 ,张振秋 1＊ ,赖静怡1 ,李玉恒 1
(1.辽宁中医药大学药学院 , 大连 116600;2.辽河油田石化医院 ,盘锦 124022)
摘要　目的:采用液相色谱法同时测定黄芪中槲皮素 、山柰酚 、芒柄花素的含量。方法:采用 Eclipse-C18柱(5 μm, 4.6 mm×
250mm);以乙腈(A)-2%醋酸水溶液(B)为流动相 , 梯度洗脱(0 min, 27% A;8min, 24% A;15 min, 21% A),流速 1.0 mL·
min-1;采用切换波长法:255 nm(0 ～ 15 min检测槲皮素), 266 nm(15 ～ 20 min检测山柰酚), 248 nm(20 ～ 30 min检测芒柄花
素);柱温 25 ℃。结果:槲皮素 、山柰酚 、芒柄花素浓度分别在 0.229 ～ 3.901 μg(r=0.9997), 0.050 ～ 0.852 μg(r=0.9998),
0.077 ～ 1.317 μg(r=0.9997)范围内线性关系良好;平均加样回收率(n=5)分别为 101.7%(RSD=2.1%), 98.4%(RSD=
2.5%), 100.8%(RSD=2.3%);供试品溶液在 12 h内稳定。结论:本方法快速简单 , 结果准确 , 为黄芪药材质量标准的制定
提供科学依据。
关键词:黄芪;槲皮素;山柰酚;芒柄花素;HPLC
中图分类号:R917　　　文献标识码:A　　　文章编号:0254-1793(2010)01-0114-03
HPLCsimultaneousdeterminationofquercetin, kaempferoland
biochaninBinAstragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge
SHIJi-liang1 , SHANYu1, 2 , ZHANGZhen-qiu1＊ , LAIJing-yi1 , LIYu-heng1
(1.ColegeofPharmacy, LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine, Dalian116600, China;
2.LiaoheRiverOilFieldPetrochemicalHospital, Panjin124022, China)
Abstract　Objective:Todevelopamethodfordeterminingquercetin, kaempferolandbiochaninBintherootsof
Astragalusmembranaceus(Fisch.)BungebyHPLC.Methods:ThemethodwasconductedonanEclipse-C18(5
μm, 4.6 mm×250mm)columnwithacetonitrile(A)-2% aceticacidsolution(B)asmobilephase(0 min, 27%
A;8min, 24% A;15min, 21% A);Theflowratewas1.0mL· min-1 , andthedetectionwavelengthwassetat255
nm(0-15 mindetectingquercetin), 266nm(15-20mindetectingkaempferol), and248nm(20-30mindetec-
tingbiochaninB).Thecolumntemperaturewas25 ℃.Results:Thelinearconcentrationrangesofquercetin,
kaempferol, andbiochaninBwere0.229 -3.901 μg(r=0.9997), 0.050 -0.852 μg(r=0.9998), 0.077 -
1.317μg(r=0.9997), respectively;Theaveragerecoveries(n=5)were101.7%(RSD=2.1%), 98.4%(RSD=
2.5%), 100.8%(RSD=2.3%), respectively.Thesamplesolutionwassteadywithin12h.Conclusion:Themeth-
odissimple, accurateandsensitive, soitcanbeusedforthequalitycontroloftherootsofA.membranaceus.
Keywords:Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge;quercetin;kaempferol;biochaninB;HPLC
黄芪为豆科植物膜荚黄芪 [ Astragalusmembra-
naceus(Fisch.)Bunge]和蒙古黄芪 [ A.membranaceus
(Fisch.)Bungevar.mongholicus(Bge.)Hsiao]的干
燥根 ,具有补气固表 、利尿托毒 、排脓 、敛疮生肌之功
效 ,用于气虚乏力 、食少便溏 、中气下陷 、久泻脱肛 、
便血崩漏 、气虚水肿以及慢性肾炎蛋白尿 、糖尿
病 [ 1] 。现代药理研究认为黄芪具有强心 、捕捉自由
基 、促进蛋白质合成 、护肝 、增强机体免疫 、抗衰老和
抗辐射等作用[ 2] 。槲皮素 、山柰酚 、芒柄花素具有
明显的降血压 、降血脂 、抗炎等作用 [ 3] ,其中槲皮素
和山柰酚还具有抗肿瘤作用 [ 3] 。同时测定黄芪中
槲皮素和山柰酚含量已有报道 [ 4] ,但同时测定黄芪
中槲皮素 、山柰酚 、芒柄花素含量的 HPLC法未见文
献报道。本实验采用反相高效液相色谱法同时测定
黄芪中槲皮素 、山柰酚和芒柄花素的含量 , 方法简
—114— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(1)
＊ 通讯作者　Tel:(0411)87586058;E-mail:zhangzhenqiu@sina.com
便 ,精确 ,重复性好 ,可有效控制其质量。
1　仪器与试药
Agilent1100型高效液相色谱仪 ,配置四元梯度
泵 、在线脱气机 、VWD检测器;U-3010型紫外可见
分光光度计;国产 AR级 2140型电子分析天平 ,
METTLERAB135-S十万分之一电子天平(瑞士)。
对照品:槲皮素 (100081 -200406)、山柰酚
(110861-200808)、芒柄花素(111703-200501)均
购自中国药品生物制品检定所 ,供含量测定用;乙
腈 、甲醇为色谱纯 ,其他试剂均为分析纯 ,水为重蒸
馏水。黄芪药材分别购自河北 、辽宁 、甘肃 、山东 、内
蒙古 ,经辽宁中医药大学李峰教授鉴定 ,均符合药典
规定 ,黄芪为豆科植物膜荚黄芪 [ Astragalusmembra-
naceus(Fisch.)Bunge]的干燥根 。
2　溶液的制备
2.1　供试品溶液　取黄芪药材粗粉(过 2号筛)约
5 g,精密称定 ,置圆底烧瓶中 , 加入 80%乙醇 50
mL,回流提取 3次 ,每次提取 1 h,滤过 ,合并滤液 ,
浓缩至干 ,残渣用甲醇溶解并转移至 5 mL量瓶中 ,
加甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,过 0.45 μm滤膜 ,即得。
2.2　对照品储备液　分别称取对照品槲皮素 、山柰
酚 、芒柄花素适量 ,精密称定 ,加甲醇制成每 1mL含
槲皮素 0.998mg、山柰酚 0.218mg、芒柄花素 0.242
mg的混合对照品储备液 ,摇匀 ,过 0.45 μm滤膜 ,
备用。
3　色谱条件
色谱柱:Eclipse-C18柱(5 μm, 4.6 mm×250
mm);流动相:乙腈(A)-2%醋酸水溶液(B),梯度
洗脱(0 min, 27% A;8 min, 24% A;15 min, 21%
A),流速 1.0mL· min-1;采用切换波长法:255 nm
(0 ～ 15 min检测槲皮素), 266 nm(15 ～ 20 min检测
山柰酚), 248 nm(20 ～ 30 min检测芒柄花素);柱
温:25 ℃;进样量:10 μL。分析时间为 30 min。对
照品及样品色谱图见图 1。
4　线性关系试验
精密吸取槲皮素对照品储备液 2.3 mL,山柰酚
对照品储备液 2.3 mL和芒柄花素对照品储备液
3.4mL,置同一 10 mL量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,
摇匀 ,用 0.45 μm微孔滤膜滤过 ,滤液作为混合对
照品溶液。分别精密吸取混合对照品溶液 1, 5 , 9,
13 , 17μL,置 2mL量瓶中 ,加甲醇定容至刻度 ,精密
吸取 20 μL, 注入液相色谱仪测定。以进样量 X
(μg)为横坐标 ,峰面积 Y为纵坐标 ,绘制标准曲线 ,
计算槲皮素 、山柰酚 、芒柄花素回归方程分别为:
图 1　对照品(A)及甘肃样品(B)的HPLC图谱
Fig1　HPLCprofilesofreferencesubstances(A)andsamplefromGansu(B)
1.槲皮素(quercetin)　 2.山柰酚(kaempferol)　 3.芒柄花素(bio-
chaninB)
Y=4.415×103X+92.22　r=0.9997
Y=4.241×103X+41.72　r=0.9998
Y=7.558×103X+174.3　r=0.9997
5　精密度试验
精密吸取同一供试品溶液(甘肃黄芪药材)10
μL,连续进样 5次 ,记录色谱峰的峰面积 。结果槲
皮素 、山柰酚 、芒柄花素峰面积的 RSD分别为
1.8%, 1.7%, 2.7%。表明精密度较好 。
6　稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液(甘肃黄芪药材)10
μL,在 0, 2, 4, 8, 12h分别进样 ,记录色谱峰的峰面
积。结果槲皮素 、山柰酚 、芒柄花素峰面积的 RSD
分别为 2.9%, 2.4%, 2.6%。表明供试品溶液在 12
h内稳定性良好 。
7　重复性试验
取甘肃黄芪药材 5份 ,每份约 5 g,按 “2.1”项
下方法制备供试品溶液 ,进样分析 。结果槲皮素 、山
柰酚 、芒柄花素含量平均值(n=5)分别为 0.12,
0.0058, 0.061mg· g-1;RSD分别为 2.0%, 2.7%,
2.8%。表明本方法重复性较好。
8　回收率试验
取已知槲皮素 (0.12 mg· g-1)、山柰酚
(0.0058mg· g-1)、芒柄花素(0.061mg·g-1)含量
的甘肃黄芪药材 5份 ,每份约 2.5g,精密称定 ,分别
置圆底烧瓶中 ,精密加入对照品储备液槲皮素 0.3
mL、山柰酚 0.07mL、芒柄花素 0.6 mL,按 “ 2.1”项
下方法制备溶液并进样分析 ,结果槲皮素 、山柰酚 、
芒柄花素的平均回收率分别为 101.7%(RSD=
—115—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(1)
2.1%), 98.4%(RSD=2.5%), 100.8%(RSD=
2.3%)。结果表明 ,本方法回收率较高 。
9　样品测定
分别取不同产地或商品地黄芪药材 ,按 “ 2.1”
项下方法制备供试品溶液 ,精密吸取 10 μL注入液
相色谱仪 ,按上述色谱条件进样测定 ,以外标法计算
含量。结果 5批黄芪药材中槲皮素 、山柰酚 、芒柄花
素的含量见表 1。
表 1　黄芪中黄酮成分的含量测定结果(mg· g-1)
Tab1　TheresulttableoftheflavonoidsinAstragalus
membranaceus(Fisch.)Bunge
序号
(serial
number)
产地或商品地
(originorsource
ofmerchandise)
槲皮素
(quercetin)
山柰酚
(kaempferol)
芒柄花素
(biochaninB)
1 河北(Hebei) 0.17 0.014 0.078
2 辽宁(Liaoning) 0.25 0.034 0.081
3 甘肃(Gansu) 0.12 0.012 0.048
4 山东(Shandong) 0.10 0.0079 0.040
5 内蒙古(NeiMonggol) 0.26 0.024 0.093
10　讨论
10.1　黄芪是一种常用的中药材 , 2005年版中国药
典只规定了黄芪甲苷的含量测定方法 ,而黄芪中含
有多种黄酮 ,槲皮素 、山柰酚 、芒柄花素等都是黄芪
的有效成分 ,本实验采用 HPLC法进行含量测定 ,采
用 C18柱 ,以乙腈(A)-2%醋酸水溶液(B)为流动
相进行梯度洗脱 ,同时测定黄芪中槲皮素 、山柰酚 、
芒柄花素的含量 ,为完善黄芪药材的质量标准提供
了科学依据 。色谱条件中 ,考察了乙腈 -水 、甲醇 -
水 、乙腈 -2%醋酸水溶液 。结果乙腈 -2%醋酸水
溶液为流动相进行梯度洗脱时 ,各有效成分均能得
到较好的分离度和较高的理论塔板数。而检测波长
的确定 ,均以其紫外分光光度计下 ,最大吸收波长为
检测波长 。
10.2　本实验在供试品溶液制备方法研究中考察了
超声 、回流及索氏提取方法 ,结果表明乙醇和水回流
提取效果好 。再以不同比例乙醇 -水(3∶2;7∶3;
4∶1)作为提取溶剂进行回流提取 ,结果表明 80%乙
醇溶液作为提取溶液提取效果最佳。
10.3　样品测定结果显示 , 5批黄芪药材中所含黄
酮成分的含量均有一定的差异 ,槲皮素含量最高的
是内蒙古的黄芪药材 ,山柰酚含量最高的是辽宁的
黄芪药材 ,芒柄花素含量最高的是内蒙古的黄芪药
材 ,有关黄芪药材多成分指标的评价有待进一步研
究。
参考文献
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黄芪中槲皮素和山奈酚的含量).ModMedHealth(现代医药卫
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(本文于 2009年 7月 29日收到)
—116— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(1)