全 文 ：2005年 5月
May 2005
色 谱
Chinese Journal o f Chromatogra phy
Vol. 23 No. 3
299 ～ 301
收稿日期:2004-06-16
作者简介:马晓丰 ,男 ,博士 ,现工作单位为中国科学院研究生院 , E-mail:maxiaofeng@gscas. ac. cn .
通讯联系人:屠鹏飞 ,男 ,教授 , Tel /Fax:(010)82802750, E-mail:pengfeitu@mail. bjm u. edu. cn.
高速逆流色谱法分离纯化黄芪中的芒柄花素和毛蕊异黄酮
马晓丰1 , 2 , 　屠鹏飞1 , 　陈英杰 2 , 　张天佑3 , 　魏　芸3
(1. 北京大学中医药现代研究中心 , 北京 100083;2. 沈阳药科大学 , 辽宁 沈阳 110016;
3. 北京市新技术应用研究所 , 北京 100035)
摘要:采用高速逆流色谱法(HSCCC),以正己烷-氯仿-甲醇-水组成二相系统作为固定相与流动相 ,对黄芪的乙酸乙
酯粗提物进行了分离纯化。结果发现:以正己烷-氯仿-甲醇-水(体积比为 1. 5∶3∶3∶2)组成的系统可以从黄芪的乙
酸乙酯粗提物中分离出毛蕊异黄酮 , 纯度可达 95%以上 , 并可以初步纯化芒柄花素;接着用正己烷-氯仿-甲醇-水
(体积比为 4∶4∶5∶4)组成的系统进一步纯化芒柄花素 , 其纯度达 95%以上。利用该方法 , 可以对中药黄芪中的异
黄酮进行快速的分离和纯化。
关键词:高速逆流色谱;芒柄花素;毛蕊异黄酮;黄芪
中图分类号:O658　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-8713(2005)03-0299-03
Preparative Isolation and Purification of Calycosin and
Formononetin from Astragalus membranaceus
Bge. var. mongholicus (Bge.)Hsiao by
High-Speed Counter-Current Chromatography
MA Xiaofeng1 , 2 , TU Pengfei1 , CHEN Yingjie 2 , ZHANG Tianyou3 , WEI Yun3
(1 . Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine , Peking Universit y , Beijing 100083 , China;
2 . Shenyang Pharmaceutical University , Shenyang 110016 , China;
3 . Beijing Institute of New Technology Application , Beijing 100035 , China)
Abstract:Preparative high-speed counter-current chromatography(HSCCC)was used for the sep-
aration of calycosin and formononetin from the ethyl acetate extract of Astragalus membranaceus
Bge. var. mongholicus (Bge. )Hsiao. Calycosin was obtained by HSCCC with a binary phase sol-
vent system composed of n-hexane-chloroform-methanol-water (1. 5∶3∶3∶2 , v/v). T hen , form-
ononetin was obtained with a system composed of n-hexane-chloroform-methanol-water (4∶4∶5∶4 ,
v/v). The mobile phase was the lower phase and operated at a flow-rate of 2. 0 mL /min , while the
apparatus rotated at 800 r/min. High performance liquid chromatographic analysis of calycosin and
formononetin revealed that their purities were over 95%. HSCCC is a useful method for the sepa-
ration of natural products.
Key words:high-speed counter-current chromatography;formononetin;calycosin;Astragalus
membranaceus Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao
　　高速逆流色谱(high-speed counter-current
chromatography , HSCCC)是美国国家医学院 Ito博
士等[ 1] 于 20世纪 80年代发明的一种无任何固态支
持介质的液-液分配色谱技术。其基本原理是根据
被分离的物质在两相溶剂系统中的分配系数不同而
得到最终分离[ 2] 。这种分离技术由于不使用固体支
持介质 ,避免了因与固体填料发生不可逆吸附而造
成的样品损失 、失活变性等常规填料易产生的弊端 ,
可使样品得以全部回收 ,具有分离容量大 、性能强 、
高效 、快速的特点 ,尤其适用于制备性分离 。到目前
为止 ,此技术已应用于生物化学 、生物工程 、医学 、药
学 、天然产物化学 、有机合成 、化工 、环境 、农业 、食
品 、材料等领域 ,在植物化学领域被广泛应用于生物
碱 、黄酮类化合物 、醌类化合物 、萜类化合物 、香豆
素 、有机酸等成分的分离和制备研究[ 3 ～ 9] 。
　　芒柄花素(formononetin)和毛蕊异黄酮(caly-
色 谱 第 23卷
cosin)是中药黄芪中的主要有效成分 ,其化学结构
见图 1。由于这两个化合物在紫外光下有吸收 ,容
易检测 ,因此常常被用作黄芪及其复方制剂质量控
制的标准品。为了建立上述 2种标准品的快速制备
方法 ,为黄芪的质量评价提供物质基础 ,我们对分离
纯化芒柄花素和毛蕊异黄酮的方法进行了研究。文
献[ 3] 已报道了应用 HSCCC分离毛蕊异黄酮的方
法 ,本实验简化了实验步骤 ,优化了色谱条件 ,应用
HSCCC分离纯化了蒙古黄芪(Ast ragalus mem-
branaceus Bge. var. mongholicus (Bge. ) Hsiao)
中的毛蕊异黄酮 ,同时分离纯化了芒柄花素。
图 1　芒柄花素 、毛蕊异黄酮的化学结构
Fig. 1　Chemical structures of formononetin
and calycosin
Formononetin:R1 =R2 =H.
Calycosin:R1=H , R2 =OH.
1　实验部分
1. 1　仪器与试剂
　　GS 10A2型半制备高速逆流色谱仪:多层螺旋
管柱(长 110 m、直径1. 6 mm、总体积 230 mL), β值
为 0. 5 ～ 0. 8;Six star NS-1007 恒流泵(流速为
0 ～ 9. 99 mL /min);8823A紫外检测器(以上仪器均
为北京市新技术应用研究所生产)。手动进样阀:20
mL (天津高新科技公司)。Yokogawa Model 3057
便携式记录仪(四川仪器厂)。Waters高效液相色
谱(HPLC)仪:包括Waters 600 泵 、Waters 2487 全
波长紫外检测器 、Millennium32数据处理系统(美国
Sage公司)。旋转蒸发仪(日本 Eyela公司)。
　　正己烷 、氯仿 、甲醇为分析纯试剂(北京化工
厂);重蒸水为自制;HPLC所用乙腈为色谱纯试剂
(Braker试剂公司)。
1. 2　样品的处理
　　取蒙古黄芪药材(购于山西省浑源县药材公司)
15 kg ,以 8倍质量的 50%(体积分数)乙醇水溶液加
热回流提取 3次 ,减压回收乙醇后 ,将浸膏溶于热水
中 ,以石油醚萃取除脂 ,再以乙酸乙酯萃取 ,将乙酸
乙酯萃取物减压回收溶剂 ,得到蒙古黄芪异黄酮的
粗提物。
1. 3　HSCCC分离纯化条件及步骤
　　溶剂系统 1为正己烷-氯仿-甲醇-水(体积比为
1. 5∶3∶3∶2),溶剂系统 2为正己烷-氯仿-甲醇-水(体
积比为 4∶4∶5∶4);流速 2. 0 mL /min , 转速 800
r /min;记录仪衰减 100 mV ,纸速 2. 0 cm/h;紫外检
测波长为 254 nm ,检测器衰减 2. 0 A。
　　将正己烷 、氯仿 、甲醇和水 4种溶剂按一定比例
置于分液漏斗中 ,充分振荡混合 ,静置 ,使用前将两
相分开 。上层水相为固定相 ,下层有机相为流动相。
将样品以溶剂系统 1的下相溶解后 ,根据要求配制
成适当浓度 。
　　在室温下 ,将上层水相完全充满多层螺旋管柱 ,
下层有机相以2. 0 mL /min的速度泵入柱中 ,同时将
离心机转速逐步升至 800 r /min。当流动相开始从
柱尾端流出时 ,即可认为固定相与流动相在柱中达
到了动态平衡 。这时通过样品环注入 20 mL 样品
溶液 ,以波长为 254 nm的紫外检测器连续监控尾
端流出的液体 ,根据色谱图收集各峰流分 。收集并
减压浓缩 HSCCC的各峰流分 ,利用 HPLC分析所得
流分的纯度。以核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)鉴定
结构。固定相保留值为分离后所余固定相与柱体积
的比值 。
1. 4　HPLC条件
　　色谱柱:Symmetry ShieldTM RP18柱(250 mm×
4. 6 mm i. d. );柱温:40 ℃。流动相:乙腈-水(体积
比为 40∶60);流速:1. 0 mL/min。紫外检测波长:
254 nm。
图 2　蒙古黄芪的乙酸乙酯粗提物的半制备 HSCCC图
Fig. 2　Chromatogram of the crude ethyl acetate extract
from A . mongholicus by preparative HSCCC
Solvent system: n-hexane-chloroform-methanol-water
(1. 5∶3∶3∶2 , v /v);stationary phase:upper aqueous phase;mo-
bile phase:lower organic phase;flow rate:2. 0 mL /min;revolu-
tion speed:800 r /min;detection waveleng th:254 nm;sample:
190 mg dissolved in 20 mL lower phase;retention of the stationary
phase:66. 7%.
　　Peak 1:formononetin;peak 2:calycosin.
2　结果与讨论
　　图 2为 20 mL(190 mg)黄芪提取物的 HSCCC
图(采用溶剂系统 1),分别接流分 1(峰 1)和流分 2
(峰 2);将流分 2减压蒸干后 ,可得到毛蕊异黄酮 25
mg ,经 HPLC检测其纯度超过 95%(见图4-b),流分
300
　第 3期 马晓丰等:高速逆流色谱法分离纯化黄芪中的芒柄花素和毛蕊异黄酮
1中含芒柄花素约为 50%。图 3是图 2中流分 1的
HSCCC图(采用溶剂系统 2),将峰 1减压蒸干后 ,可
得到芒柄花素 20 mg , 经 HPLC检测其纯度超过
95%(见图 4-c) 。图 4-a是黄芪的乙酸乙酯粗提物
的 HPLC图 ,可以得知其中毛蕊异黄酮的含量约为
15%,芒柄花素的含量约为 17%。
图 3　经过一次纯化的提取物的半制备HSCCC色谱图
Fig. 3　Chromatogram of the partially purified extract of
A. mongholicus by preparative HSCCC
Solvent system: n-hexane-chloroform-methanol-water
(4∶4∶5∶4 , v /v);stationary phase:upper aqueous phase;mobile
phase:lower organic phase;flow rate:2. 0 mL /min;revolution
speed:800 r /min;detection wavelength:254 nm;sample:80 mg
dissolved in 20 mL lower phase;retention of the stationary phase:
60. 0%.
　　Peak 1:formononetin.
图 4　蒙古黄芪乙酸乙酯粗提物(a)、图 2中流分 2(b)和
图 3中流分 1(c)的 HPLC图
Fig. 4　Chromatograms of the crude ethyl acetate
extract from A . mongholicus (a), effluent No. 2
in Fig. 2(b) and eff luent No. 1 in Fig. 3 (c) by HPLC
Column:Symmetry ShieldTM RP18 column (250 mm×4. 6 mm
i. d.);mobile phase:acetonitrile-water (40:60 , v /v);flow rate:
1. 0 mL /min.
　　芒柄花素 、毛蕊异黄酮的化学结构由1H-NMR
及 13 C-NMR 鉴 定 。图 3 中 的 峰 1:1H-NMR
(50 0　MHz , DMSO-d6)δ:3. 77(3H , s , —OCH3),
6. 86(1H , s , H-8),6. 93(1H ,dd , J =8. 7 Hz ,1. 8 Hz ,
H-6), 6. 98(2H , d , J =8. 4 Hz , H-3′, H-5′), 7. 49
(2H , d , J =8. 1 Hz , H-2′, H-6′),7. 96(1H , d , H-
5),8. 33(1H , s , H-2), 10. 82(1H , s , C7-OH);13C-
NMR(500 Hz , DMSO-d6)δ:153. 2(C-2), 123. 4(C-
3), 174. 7(C-4), 127. 4(C-5), 115. 8(C-6), 162. 6
(C-7), 102. 2(C-8), 157. 5(C-9), 116. 7 (C-10),
124. 7(C-1′), 116. 5(C-2′), 146. 1(C-3′), 147. 6
(C-4′), 112. 0(C-5′), 119. 8(C-6′)。将以上数据与
文献[ 10] 对照 ,确定峰 1 组分为芒柄花素 。图 2中
的峰 2:1H-NMR (500 MHz , DMSO-d6)δ:3. 77
(3H , s , —OCH3), 6. 84(1H , d , J =1. 5 Hz , H-8),
6. 91(1H , dd , J =9. 0 Hz , J =2 Hz , H-6), 6. 93
(2H , br s , H-5′, H-6′), 7. 02(1H , br s , H-2′),
7. 95(1H , d , J =8. 5 Hz , H-5), 8. 26(1H , s , H-
2);13 C-NMR(500 Hz , DMSO-d6)δ:153. 2(C-2),
123. 2(C-3), 174. 6(C-4), 127. 4(C-5), 115. 2(C-
6), 162. 6(C-7), 102. 1(C-8), 157. 5(C-9), 116. 6
(C-10), 124. 2(C-1′), 130. 1(C-2′), 113. 6(C-3′),
158. 9(C-4′), 113. 6(C-5′), 130. 1(C-6′)。将以上
数据与文献[ 10]对照 ,确定峰 2组分为毛蕊异黄酮。
3　结论
　　以上实验结果表明 ,HSCCC能有效地从黄芪粗
提物中分离纯化毛蕊异黄酮及芒柄花素 ,得到的高
纯度样品可以作为标准品用于分析测试或药理与毒
理试验 。由此可见 ,HSCCC在分离纯化结构相似的
异黄酮类成分方面将会具有很好的效果。
参考文献:
[ 1] 　Ito Y , Sandlin J , Bowers W G. J Chromatogr , 1982 , 244(2):
247
[ 2] 　Ito Y. CRC Crit Rev Anal Chem , 1986 , 17(1):65
[ 3] 　Ma X F, Zhang T Y, Wei Y, Tu P F , Chen Y J , Ito Y. J Chro-
matogr A , 2002 , 962:243
[ 4] 　Ma X F, Tu P F , Chen Y J , Zhang T Y , Wei Y, Ito Y. J Chro-
matogr A , 2003 , 992:193
[ 5] 　Ma X F, Tu P F , Chen Y J , Zhang T Y , Wei Y, Ito Y. J Chro-
matogr A , 2004 , 1 023:311
[ 6] 　Du Q Z , Xia M , Ito Y. J Chromatogr A , 2002 , 962:239
[ 7] 　Wei Y , Zhang T Y , Ito Y. J Chromatogr A , 2003 , 1 017:125
[ 8] 　Lu H T , Jiang Y , Chen F. J Chromatogr A , 2004 , 1 023:159
[ 9] 　Lu H T , Jiang Y , Chen F. J Chromatogr A , 2004 , 1 026:185
[ 10] 　Song Chunqing , Zheng Zhiren , Liu Di , Hu Zhibi , Sheng
Wanyun. Acta Botanica Sinica(宋纯清 , 郑志仁 , 刘　涤 , 胡
之壁 , 盛宛云. 植物学报), 1997 , 39(8):764
301