全 文 ：2012 年 5 月 Vol． 30 No ． 5
May 2012 Chinese Journal of Chromatography 543 ～ 546
技术与应用 DOI:10． 3724 /SP． J． 1123． 2012． 01017
* 通讯联系人:李玉林，副研究员，主要从事天然药物化学研究． E-mail:liyulin@ nw ipb． cas． cn．
基金项目:中国科学院知识创新工程重要方向项目．
收稿日期:2012-01-13
高速逆流色谱分离制备椭圆叶花锚中的 2 种口山酮苷元
刘永玲1，2， 陈 涛1，2， 王 萍1，2， 尤进茂1， 刘永军1， 李玉林1*
(1． 中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810008;2． 中国科学院研究生院，北京 100049)
摘要:椭圆叶花锚的主要活性成分为口山酮类化合物，这类化合物具有利胆、抗炎、抗菌及抗病毒活性。应用高速逆
流色谱法建立了 2 种高纯度口山酮苷元的分离制备方法。对椭圆叶花锚氯仿萃取部位运用高速逆流色谱分离纯化，
以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶ 5∶ 7∶ 5，v /v /v /v)为两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相。在主机转速 800
r /min，流动相流速 1. 5 mL /min，检测波长 254 nm 条件下进行分离制备。所得产物经高效液相色谱分析检测，其
化学结构由核磁共振氢谱(1H NMR)和核磁共振碳谱(13C NMR)鉴定。在此条件下，从 100 mg 粗样品中一步分离
得到 18 mg 1-羟基-2，3，5-三甲氧基口山酮，14 mg 1-羟基-2，3，4，5-四甲氧基口山酮。经高效液相色谱分析，其纯度均达
98%以上。该方法简便、快速，所得产物纯度高，适合于椭圆叶花锚口山酮苷元的制备分离。
关键词:高速逆流色谱;1-羟基-2，3，5-三甲氧基口山酮;1-羟基-2，3，4，5-四甲氧基口山酮;椭圆叶花锚
中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:1000-8713(2012)05-0536-04
Preparative separation of two xanthones from Halenia elliptica
by high-speed counter-current chromatography
LIU Yongling1，2，CHEN Tao 1，2，WANG Ping1，2，YOU Jinmao 1，LIU Yongjun1，LI Yulin1*
(1． Nor thw es t Ins ti tu te of Plateau Biology，Chines e Academ y of Sciences，Xining 810008，China;
2． Graduate Univer s i ty of Chines e Academ y of Sciences，Bei j ing 100049，China)
Abstract:A high performance method for iso lation and purification of tw o xanthones from a
crude extract o f Halen ia ellip tica w as successfully established by utilizing high-speed counter-
current chromatography (HSCCC)． The separation w as performed w ith a tw o-phase solvent
system composed of n-hexane-ethyl acetate-methanol-w ater (5∶ 5∶ 7∶ 5，v /v /v /v)w ith the low -
er phase as the mobile phase at a flow rate of 1. 5 mL /min． The apparatus w as ro tated at 800
r /min． The effluent w as detected at 254 nm ． Under the optimized conditions，18 mg of 1-
hydroxy-2，3，5-trimethoxyxanthone and 14 mg of 1-hydroxy-2，3，4，5-tetramethoxyxanthone
w ere obtained from 100 mg of the crude extract o f Halen ia ellip tica in one-step separation
w ithin 360 min． The results o f high performance liquid chromatographic (HPLC) analysis
show ed that the purity o f each of the target compounds w as over 98%． The chemical structures
of the tw o compounds w ere confirmed by 1H nuclear magnetic resonance (1 H NMR)and 13C
NMR． The established method is simple，highly efficient and suitable for large scale separation
of xanthones from Halen ia ellip tica ．
Key words:high-speed counter-current chromatography (HSCCC) ;1-hydroxy-2，3，5-trime-
thoxyxanthone;1-hydroxy-2，3，4，5-tetramethoxyxanthone;Halen ia ellip tica
椭圆叶花锚(Halen ia ellip tica)系龙胆科
(Gentianaceae)花锚属(Halen ia)植物，是藏药中
治疗肝胆系统疾病的常用药物之一［1］。临床上，椭
圆叶花锚多用于治疗小儿急性黄疸肝炎和小儿急性
乙型肝炎，疗效显著［2，3］。已有研究表明，椭圆叶花
锚中口山酮苷类物质具有抗肝炎的作用［4］，但其生物
活性则主要是通过转化为口山酮苷元产生［5］。目前，
有关椭圆叶花锚口山酮成分分离的研究报道大多采用
色 谱 第 30 卷
传统柱色谱方法［6 － 10］，存在样品组分损失、玷污、变
性、失活、拖尾，分离困难，收率低等不足。高速逆流
色谱(high-speed couter-current chromatography，
HSCCC)是一种不使用固态支撑体或载体的液液分
配色谱技术。其克服了固相载体对样品的吸附而产
生的损失、变性等缺点，并可以在短时间内实现高效
制备性分离，因而在植物有效成分的分离与制备方
面得到了广泛的应用［11 － 13］。本研究采用 HSCCC
技术对椭圆叶花锚中口山酮苷元成分进行了分离制备
与纯化，得到两种高纯度的口山酮苷元(1-羟基-2，3，5-
三甲氧基口山酮(I)和 1-羟基-2，3，4，5-四甲氧基口山酮
(II) ) ，为其进一步药用开发研究提供技术支撑。
1 实验部分
1． 1 仪器与材料
TBE-300A KTA Prime 高速逆流色谱仪(上海
同田生化技术有限公司) ，配有 KTA Prime 泵及紫
外检测系统(美国 GE 公司) ，聚四氟乙烯(PTFE)
管分离柱(内径 1. 6 mm，分离柱体积 280 mL) ，
N2000 色谱工作站和溶剂选择系统(浙江大学智达
信息工程有限公司) ，HX-1050 恒温循环器(北京博
医康实验仪器有限公司)。Agilent 1200HPLC 高效
液相色谱仪(美国安捷伦公司) ，配备 G1354A 四元
泵，G1313A 自动脱气机，G1316A 柱温箱，G1315B
二极管阵列检测器和 G1329A 自动进样器;AM400
核磁共振仪(瑞士 Bruker 公司)。
椭圆叶花锚采集于青海省互助县南门峡乡，由
中国科学院西北高原生物研究所陈世龙研究员鉴
定。萃取及 HSCCC 分离用的试剂氯仿、甲醇、乙酸
乙酯和正己烷均为分析纯，高效液相色谱(HPLC)
分析用甲醇为色谱纯(山东禹王公司) ，实验用水为
超纯水。
1． 2 样品制备
取干燥的椭圆叶花锚全草 500 g，切至 0. 5 ～
1. 0 cm 碎段，加 10 倍体积的 75% (体积分数，下
同)乙醇。于 80 ℃回流提取 3 次，每次 2 h，合并提
取液并减压浓缩至无醇味，得浸膏 110 g。将浸膏加
水悬浮后，置于分液漏斗中，用石油醚(沸点 60 ～ 90
℃)进行萃取，直至石油醚萃取溶液无色。再用氯
仿萃取，反复多次，直至氯仿萃取部分无颜色。回收
氯仿，得氯仿萃取部分 25 g，作为 HSCCC 待分离样
品，放置 4 ℃冰箱内备用。
1． 3 溶剂体系及样品溶液的制备
在分液漏斗中配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水
(5∶ 5 ∶ 7 ∶ 5，体积比，下同)两相溶剂系统，充分振摇
后静置过夜。上相为固定相，下相为流动相，使用前
分别超声脱气 30 min。取 100 mg 待分离样品粉
末，振荡后完全溶解于 20 mL上相溶液中，备用。
1． 4 分离与鉴定
1． 4． 1 HSCCC 分离制备
以最大流速 20 mL /min 将溶剂系统上相泵入
主机并充满分离螺线管，开启循环水浴并将温度设
定为 25 ℃。开启主机电源，以 800 r /min 正向旋
转。待转速稳定后，泵入流动相。待流动相从管柱
出口流出且基线稳定后，将样品溶液由进样圈注入。
管柱出口处流出液在 254 nm 波长下连续检测，根
据色谱图手动收集各峰组分，HPLC 检测其纯度。
1． 4． 2 HPLC 分析及结构鉴定
椭圆叶花锚氯仿萃取部分和高速逆流色谱分离
得到的各组分用 HPLC 分析。HPLC 分析条件:
Eclipse XDB-C18 色谱柱(150 mm × 4. 6 mm，5
μm) ;甲醇(A)-水(B)线性梯度洗脱(0 ～ 15 min，
50%A ～65%A;15 ～ 25 min，65%A ～ 68%A;25 ～ 30
min，68%A ～95%A;30 ～ 40 min，95%A) ;流速 1. 0
mL /min;检测波长 254 nm;柱温 25 ℃。椭圆叶花
锚氯仿萃取部分的 HPLC 谱图如图 1 所示。
HSCCC 分离得到的各峰组分的结构根据核磁
共振氢谱(1H-NMR)和核磁共振碳谱(13 C-NMR)的
数据进行鉴定。
图 1 椭圆叶花锚氯仿萃取部分的 HPLC谱图
Fig． 1 HPLC chromatogram of chloroform extract
from Halenia elliptica
Column:Eclipse XDB C18 column (150 mm × 4. 6 mm，5
μm) ;mobile phase:methanol (A)and w ater (B)in linear
gradient mode (0 － 15 min，50%A － 65%A;15 － 25 min，65%A
－68%A;25 － 30 min，68%A －95%A;30 － 40 min，95%A) ;flow
rate:1. 0 mL /min;detection w avelength:254 nm; column
temperature:25 ℃ ．
I． 1-hydroxy-2，3，5-trimethoxyxanthone;II． 1-hydroxy-2，3，
4，5-tetramethoxyxanthone．
2 结果和讨论
2． 1 HSCCC溶剂系统的优化选择
在高速逆流色谱中，溶剂系统的选择至关重要，
·445·
第 5 期 刘永玲，等:高速逆流色谱分离制备椭圆叶花锚中的 2种口山酮苷元
合适的溶剂系统是天然药物中活性成分分离纯化的
关键。根据色谱理论，用于 HSCCC 样品分离的两
相溶剂系统需满足如下条件:目标物能稳定的溶于
两相溶剂;目标物在两相中具有合适的分配系数 K
(0. 5 ＜ K ＜ 2. 0)［14，15］，分离因子(α = K II /K I，K II ＞
K I)大于 1. 5;溶剂系统分层时间短(＜ 30 s) ;有合
适的固定相保留率(＞ 50%)。若 K 远小于 1，样品
会很快随流动相流出，达不到分离效果;若 K 远大
于 1，样品的出峰时间会延长，形成宽峰。本研究测
定了两个目标化合物在不同溶剂系统中的分配系
数，结果见表 1。
表 1 两个目标化合物在不同溶剂系统中的分配系数(K)
Table 1 Partition coefficients (K)of the two target
components in different solvent systems
Solvent system Volume ratio K I K II
Chloro form-w ater 6∶ 6 ＜ 0． 01 ＜ 0． 01
Chloro form-methanol 5∶ 1∶ 5 ＜ 0． 01 0． 02
-w ater 5∶ 2∶ 6 0． 03 0． 12
5∶ 3∶ 2 0． 11 0． 25
n-Hexane-ethyl acetate- 1∶ 1∶ 1∶ 1 ＜ 0． 01 2． 34
methanol-w ater 5∶ 4∶ 5∶ 6 0． 87 3． 25
5∶ 5∶ 8∶ 4 0． 38 0． 57
5∶ 4∶ 5∶ 4 0． 65 2． 31
5∶ 5∶ 7∶ 5 0． 96 1． 46
鉴于待分离样品为椭圆叶花锚醇提取物的氯仿
萃取部位，首先选用氯仿-水作为溶剂系统，甲醇作
极性调节剂。由表 1 可知，目标化合物大部分溶于
下相(K 远小于 1) ，故氯仿-水体系不适于目标化合
物的分离。选用正己烷-水为基本溶液的溶剂系统，
并以乙酸乙酯和甲醇作极性调节剂，考察了目标化
合物在不同比例正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水中的分配
情况。由表 1 可知，当采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-
水(5∶ 4∶ 5∶ 4，v /v /v /v)为溶剂系统时，两个目标化
合物有较好的分离因子(α = 3. 55 ＞ 1. 5) ，但是化合
物 II的分配系数大于 2，洗脱时间较长。当用正己
烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶ 5∶ 7∶ 5，v /v /v /v)为两相溶
剂系统时，目标化合物的分配系数(0. 5 ＜ K ＜ 2)及
分离因子(α = 1. 52 ＞ 1. 5)合理，固定相保留率大于
60%，可实现目标化合物的高效分离。本溶剂体系
由于上相体积明显少于下相体积，故用上相作为固
定相。实验同时对流动相流速、旋转管转速和分离
温度等也进行了优化，结果发现，在流速 1. 5
mL /min、转速为 800 r /min、温度为 25 ℃条件下，分
离结果令人满意。在此分离条件下，从 100 mg 待
分离样品中一次性得到 18 mg 化合物 I和 14 mg 化
合物 II。HSCCC 分离谱图见图 2。HPLC 测定两种
化合物的纯度均大于 98%(见图 3)。
图 2 椭圆叶花锚氯仿萃取部分的 HSCCC分离谱图
Fig． 2 HSCCC chromatogram of chloroform
extract from Halenia elliptica
Tw o-phase so lvent system:n-hexane-ethyl acetate-methanol-
w ater (5 ∶ 5 ∶ 7 ∶ 5，v /v /v /v) ;mobile phase:the low er phase;
flow rate:1. 5 mL /min;revo lution speed:800 r /min;detection
w avelength:254 nm;separation temperature:25 ℃;retention
of the stationary phase:65%．
For I and II，see Fig． 1．
图 3 HSCCC制备组分的 HPLC谱图及其紫外光谱
Fig． 3 HPLC chromatograms and ultraviolet spectra
of fractions prepared from HSCCC
Conditions and peak identifications w ere the same as in Fig． 1．
2． 2 HSCCC制备组分结构鉴定
化合物 I 黄色粉末，1H NMR (400 MHz，DM-
SO-d6) :12. 70(s，1H，1-OH) ，7. 67 (d，J = 8. 6
Hz，1H，H-8) ，7. 52(d，J = 7. 6 Hz，1H，H-6) ，
7. 41(t，J = 7. 6 Hz，1H，H-7) ，6. 86(s，1H，H-
4) ，3. 98(s，3H，OCH3) ，3. 96(s，3H，OCH3) ，
3. 75(s，3H，OCH3) ;
13 C NMR(100 MHz，DMSO-
·545·
色 谱 第 30 卷
d6) :180. 7 (C=O) ，160. 3 (C-1) ，153. 2 (C-4a) ，
152. 3(C-3) ，148. 1(C-4b) ，145. 7(C-5) ，131. 4
(C-2) ，124. 3(C-7) ，121. 1(C-8a) ，116. 8(C-8) ，
115. 7(C-6) ，103. 5 (C-8b) ，91. 8 (C-4) ，60. 2
(OCH3) ，56. 9(OCH3) ，56. 4(OCH3)。参照文
献［6，8］，确定该化合物为 1-羟基-2，3，5-三甲氧基口山
酮(1-hydroxy-2，3，5-trimethoxyxanthone)。
化合物 II 黄色粉末，1H NMR(400 MHz，DM-
SO-d6) :12. 50(s，1H，1-OH) ，7. 67(d，J = 7. 6
Hz，1H，H-8) ，7. 54(d，J = 8. 0 Hz，1H，H-6) ，
7. 40(t，J = 8. 4 Hz，1H，H-7) ，4. 07(s，3H，
OCH3) ，4. 00 (s，3H，OCH3) ，3. 93 (s，3H，
OCH3) ，3. 83(s，3H，OCH3) ;
13C NMR(100 MHz，
DMSO-d6) :181. 2(C=O) ，153. 8(C-3) ，149. 7(C-
1) ，148. 3(C-5) ，145. 6(C-4a) ，145. 2(C-4b) ，
134. 9(C-4) ，132. 4(C-2) ，124. 3(C-7) ，120. 0(C-
8a) ，117. 1(C-8) ，115. 7(C-6) ，104. 4(C-8b) ，
61. 5(OCH3) ，60. 6(OCH3) ，56. 5(OCH3)。参照
文献［16 － 18］，确定该化合物为 1-羟基-2，3，4，5-四甲
氧基 口山酮(1-hydroxy-2，3，4，5-tetramethoxyxan-
thone)。
3 结语
本研究采用高速逆流色谱分离方法，以正己烷-
乙酸乙酯-甲醇-水(5 ∶ 5 ∶ 7 ∶ 5，v /v /v /v)为溶剂，从
100 mg 椭圆叶花锚醇提物的氯仿萃取部分一步分
离得到 18 mg 1-羟基-2，3，5-三甲氧基口山酮，14 mg
1-羟基-2，3，4，5-四甲氧基口山酮，纯度均在 98%以
上，为椭圆叶花锚口山酮苷元成分的系统分离研究提
供了一种高效的分离制备方法。与传统分离方法相
比，该方法具有简便、快速、节省溶剂的特点，具有较
好的实际应用价值。
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