全 文 ：下降 , CD4+T细胞比例增加 ,表明在 UC中由于CD4 +CD25+T细
胞的异常 , 机体出现免疫失衡 , 使得效应性 CD4 +T细胞附集于
炎症损伤的肠黏膜内 , 导致消化道黏膜免疫系统处于高活性状
态 , 诱发肠道免疫反应增强 ,对自身抗原发生不耐受 ,损伤性免疫
因子(如 TNF-α、IL-10等)的释放增加 , 引起肠粘膜的损伤。
安晓霞等研究发现中药灌肠 1号和柳氮磺胺吡啶均能较好调控
小鼠外周血和肠系膜淋巴结 CD4 + CD25 +Tregs细胞数量和功能
的增加 , 一方面可有效抑制过度的免疫反应 , 另一方面可调节机
体的免疫平衡 , 维持机体内环境的相对稳定 , 达到有效治疗 UC
的目的 [ 7, 8] 。王晓娣 [ 5]研究 UC患者 CD4 +CD25 +T细胞占 CD4 +T细胞的比例明显低于对照组(P<0.01), 并且与疾病的活动指
数及血沉水平均呈显著负相关(P<0.01);UC患者 Foxp3mRNA
的表达也明显低于对照组(P<0.01), 得出 UC患者外周血 CD4 +
CD25 +调节性 T细胞明显降低 , 与疾病活动性相关 , 提示这类细
胞可能在 UC的病理机制中发挥作用 , Foxp3表达降低可能是导
致 CD4 +CD25 +T细胞发育障碍的重要因素。UC的治疗一直为临床难点 , 目前临床上西药常用免疫抑制
剂治疗 ,但疗效也不甚理想 , 且毒副作用大。中药方剂中不乏具
有抗炎 、止泻 、黏膜保护 、抑制免疫反应等作用的药物 , 可辨证施
治 , 适当选用 [ 9] 。中药 KKL以猴头菌为君药 , 其味甘性平 , 归脾
胃经 , 补脾益气 、利五脏 、抗肿瘤 , 近年报道猴头菌提取物能调节
机体的非特异性免疫(巨噬细胞的吞噬作用)和特异性免疫(主
要由淋巴细胞介导的细胞免疫和体液免疫)功能 , 改善肠黏膜的
免疫状态 , 具有抗氧化作用 ,能有效清除氧自由基 ,减轻局部炎症
损害 , 促进炎症消退 ,改善肠黏膜血液循环及营养状态 ,促进肠黏
膜上皮细胞再生 、组织修复和溃疡愈合 [ 10] , 并具有黏膜保护作用
和良好的免疫调节作用 [ 11, 12] 。方剂中的半枝莲 、黄连 、厚朴 、苍
术等具有抗菌消炎 、生肌 、调节肠道功能等作用 [ 13～ 15] , 故以半枝
莲 、黄连 、厚朴 、苍术为臣;佐以调和气血之白芍 ,兼能柔肝缓急止
痛 , 清热凉血之马齿苋 、槐花;使以健脾利湿之厚朴 、土茯苓。全
方选药精炼 , 共奏补脾解毒 、清热利湿 、排脓敛疮 、调和气血 、凉血
止血 、止痛止痢之功。 KKL先期实验研究已经证实 , 中药 KKL对
TNBS模型大鼠结肠炎的发生具有一定预防保护作用 ,可能与下
调 CD4 +/CD+8 比值 、抑制促炎因子 IL-1β 分泌和促进抗炎因子
IL-10分泌等免疫调节机制有关 [ 16] 。本实验结果表明 , 中药
KKL对 UC大鼠一般状态 , 结肠大体损伤和病理组织学损伤均有
较好的改善作用 , 可以看出 KKL是一种有效的治疗 UC的药物 ,
提高 UC模型大鼠外周血和肠系膜淋巴结 CD4 +CD25 +调节性 T
细胞可能是其治疗机制之一。但复方中药制剂的实际作用机制
可能更为复杂 ,有效成分尚不清楚 ,及 KKL对 Foxp3基因表达的
影响等仍需今后进一步深入研究加以阐明。
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收稿日期:2009-11-19;　修订日期:2010-02-20
基金项目:辽宁省大连市科技计划项目(No.2007A13GX037)
作者简介:史丽颖(1975-),女(汉族),吉林长春人 ,现任大连大学讲师 ,博
士学位 ,主要从事天然活性物质研究工作.
＊通讯作者简介:王永奇(1946-), 男(汉族),吉林德惠人 , 现任大连大学
教授 ,博士学位 ,主要从事天然活性物质研究工作.
葫芦茶根中总多酚提取富集工艺研究
史丽颖 ,周旭东 ,石海峰 ,王永奇＊
(大连大学药物研究所 ,辽宁 大连　116622)
摘要:目的 优选葫芦茶根中总多酚提取富集工艺。方法 以总多酚含量为考察指标 , 采用单因素实验和正交实验结合的
方法优选葫芦茶根中总多酚的提取工艺 ,并优选 D101型大孔树脂富集葫芦茶根中总多酚的最优条件 。结果 优化条件
结合工业生产实际 , 确定其最佳提取工艺条件为 30℃, 50%丙酮 , 8倍量溶剂提取 3次 , 4.5 h/次 , 此条件下总多酚收率大
于 6%。以 D101型大孔树脂对总多酚进行富集 ,最佳工艺条件为 2 BV/h流速 , 收集 6 BV30%乙醇洗脱液 , 总多酚含量
为 77.2%, 收率为 32.3%。结论 该法能有效提取富集葫芦茶根中总多酚。
关键词:葫芦茶;　总多酚;　提取;　富集;　正交设计
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.07.057
中图分类号:R284.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)07-1690-02
　　葫芦茶系豆科葫芦茶属植物葫芦茶 Tadehagitriquetrum
(L.)Ohashi的全草 , 为民间常用中草药 , 主产于广西 、江西 、广
东 、福建等地 [ 1 , 2] 。本品性凉 ,味微苦 、涩 , 具有清热解毒 、消积利
湿 、杀虫防腐等功效 , 临床用于预防中暑 , 治疗感冒发热 、咽喉肿
痛 、急性肾炎 、黄疸肝炎 、肠炎 、细菌性痢疾 、妊娠呕吐等 [ 3] 。 目
前对该植物的化学成分和生物活性的研究已有报道 [ 4 ～ 6] ,发现其
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具有抑菌和杀灭椎实螺的作用。 我们在研究中发现葫芦茶根中
多酚类成分具有较强的杀软体动物作用 ,因此我们对其富含的多
酚类成分的提取和富集工艺进行了考察 , 旨在提高总多酚的收
率 , 为其综合开发利用奠定基础。
1　仪器与试药
Unico7200可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司);Labo-
rata4000型旋转蒸发仪(Heidolph公司);BP210S十万分之一电子天
平(Sartorius公司);V-560紫外可见分光光度计(Jasco公司)。
葫芦茶全草 , 2006-03采集于广西壮族自治区平南县 , 经辽
宁师范大学陈辰教授鉴定为 Tadehagitriquetrum(L.)Ohashi;没
食子酸(南京泽朗医药科技有限公司 , 批号:ZL20090403YG,纯度
99.68%);D101型大孔吸附树脂(天津海光化工有限公司);所
用试剂均为分析纯;实验用水为蒸馏水。
2　方法与结果
2.1　总多酚含量测定方法 [ 7 ～ 9]
2.1.1　标准曲线的绘制 精确称取干燥至恒重的没食子酸对照
品 10mg,置于 100 ml棕色容量瓶中 ,加水溶解并稀释至刻度 ,摇
匀 , 精密量取 25 ml, 置于 100 ml棕色容量瓶中 , 用水稀释至刻
度 , 摇匀 ,得到浓度为 0.025 mg/ml的对照品溶液。分别精确吸
取没食子酸对照品溶液 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0和 2.5ml置于 10ml
棕色容量瓶中 , 各加水至 5 ml, 再分别加入 Folin试剂 1 ml, 用
29% Na
2
CO
3
溶液稀释至刻度 , 摇匀 , 以相应的试剂为空白 , 30
min后 ,在 754 nm波长下测定吸光度值 , 以吸光度值为纵坐标 ,
浓度(mg/ml)为横坐标 ,绘制标准曲线。得回归方程 C=3.023A
+0.0405(r=0.999 5), 其线性范围为 0.002 5 ～ 0.012 5mg/ml。
2.1.2　样品溶液的测定 准确称取 30.0 g粉碎后葫芦茶根 , 置
于 500 ml的圆底烧瓶中 ,按实验设置的处理条件提取 , 回收溶剂
后冷冻干燥 , 准确称取待测样品 50 mg, 用水溶解 ,置于 100 ml的
容量瓶中并定容。摇匀 , 精密量取 10 ml置于 100ml的棕色容量
瓶中定容 , 摇匀 , 准确量取 2 ml于 10 ml棕色容量瓶中 , 按
“ 2.1.1”项下自 “各加水至 5 ml”起 , 同法测定吸光度 , 计算总多
酚的含量和收率。
2.2　葫芦茶根中总多酚提取工艺优选 [ 10, 11]
2.2.1　因素与水平 首先对溶媒浓度 、提取温度 、提取时间 、料
液比和提取次数进行了单因素实验 ,确定了各因素最佳条件分别
为:60%丙酮 , 40℃, 6 h, 1∶8和 3次。对各因素进行综合分析 ,
固定提取次数 3次 , 对温度(A), 溶媒浓度(B), 提取时间(C),料
液比(D)进行考察 , 以总多酚含量为考核指标 , 按 4因素 3水平
进行 L9(34)正交实验。各因素水平安排见表 1。
表 1　考察因素及水平
水平 A温度T/℃
B
溶媒浓度(%)
C
提取时间 t/h
D
料液比 /V∶V
1 30 50 4.5 1∶6
2 40 60 6.0 1∶8
3 50 70 7.5 1∶10
2.2.2　正交实验设计及结果 按 L9(34)正交设计表安排实验 ,
正交设计及实验结果见表 2。
由表 2分析结果可知 , 在葫芦茶总多酚的提取工艺中 , 各因
素对提取效果的影响程度依次为 A>B>C>D, 最优水平组合为
A1B1C1D2 ,即最佳提取工艺为 8倍量 50%丙酮 , 30 ℃提取 3次 ,
4.5 h/次。
2.2.3　验证实验 精确称取粉碎后葫芦茶根 30.0 g(平行 6份),
置于 500 ml的圆底烧瓶中 ,加入 8倍量 50%丙酮 , 30 ℃提取 4.5
h,提取 3次。 回收溶剂后冷冻干燥。 按 “ 2.1.2”项下操作在
754nm波长下测定吸光度。 6次测定结果 , 总多酚平均含量为
27.34%,总多酚平均收率为 6.26%。结果表明确定的工艺条件优
于正交实验中的任何一组, 且重复性较好 ,说明确定的工艺合理。
2.3　葫芦茶根中总多酚富集工艺优选 [ 12]
2.3.1　D101型大孔吸附树脂的预处理 取一定量的 D101大孔
树脂 , 95%乙醇浸泡 24 h, 将其装入树脂柱内 , 先以 95%乙醇洗
至流出液中加 3倍量水后无白色混浊现象 ,改用蒸馏水冲洗至无
醇味 , 备用。
表 2　正交设计及实验结果( x±s)
序号 A B C D 多酚收率(%)
1 1 1 1 1 6.20
2 1 2 2 2 5.09
3 1 3 3 3 4.91
4 2 1 2 3 5.25
5 2 2 3 1 5.11
6 2 3 1 2 5.38
7 3 1 3 2 5.00
8 3 2 1 3 4.35
9 3 3 2 1 4.10K1 16.20 16.45 15.93 15.41K2 15.63 14.55 14.44 15.47K
3 13.45 14.39 15.02 14.51k1 5.40 5.48 5.31 5.14k2 5.21 4.85 4.81 5.16k3 4.48 4.80 5.01 4.84R 0.92 0.68 0.50 0.35
2.3.2　静态吸附量的确定 在 250 ml的锥形瓶中加入 5 g预处
理后的 D101大孔吸附树脂以及 100 ml样品溶液(浓度为 9.36
mg/ml)。室温条件下振荡 24 h, 取上清液测定总多酚含量。 计
算物料平衡吸附量:q=(C0 -C)V/G, 式中 C0和 C分别是初始
和平衡时溶液中总多酚的浓度(mg/ml), V为供试品液的体积
(ml), G为树脂量(g)。计算得 D101树脂对多酚的静态吸附量为
27.82mg/g。
2.3.3　 动态吸附量的确定 取 30 g预处理后 D101大孔树脂装
入内径为 2.5 cm的树脂柱 , 取浓度为 10.33 mg/ml的葫芦茶根
50%丙酮提取液 , 以 2BV/h的流速连续通过树脂柱 , 收集流出
液 , 每 30 ml收集 1个洗脱馏分 , 测定每个洗脱馏分中总多酚浓
度。结果表明 , 当上柱样品溶液加至 300 ml时 , D101大孔树脂吸
附达到饱和。
2.3.4　 D101树脂洗脱条件的选择 洗脱剂浓度的考察:取 30 g
经预处理后的 D101大孔吸附树脂装柱 ,取 5 g葫芦茶根 50%丙
酮提取物 ,用水溶解 , 过滤 ,以 2BV/h的流速上柱 , 吸附完全后用
蒸馏水及 10%, 30%, 50%, 95%乙醇 , 以 2BV/h流速进行洗脱 ,
收集每个梯度洗脱液 ,浓缩干燥并进行含量测定。结果见表 3。
结果表明 , 10%和 30%乙醇洗脱液中总多酚含量高 , 收率为
33.0%,所以选择用水及 30%乙醇进行洗脱。
表 3　洗脱剂浓度对洗脱量的影响
洗脱剂 洗脱量 m/mg 总多酚含量(%) 收率(%)
水 175 43.2 3.5
10%乙醇 360 79.8 7.2
30%乙醇 1290 77.6 25.8
50%乙醇 315 2.8 6.3
95%乙醇 400 1.5 8.0
洗脱剂用量的确定:分别用水 、 30%乙醇对已饱和吸附的
D101大孔吸附树脂(柱体积为 30 ml)进行洗脱 ,分别用去离子水
5个柱体积 , 30%乙醇 8个柱体积进行洗脱 , 测定每个洗脱体积
中多酚的含量。结果见表 4。
从表 4可以看出 , 水洗脱过程中从第 2个柱体积开始洗脱液
中总多酚的含量大于 50%, 30%乙醇洗脱过程中从第 7个柱体
积开始洗脱液中总多酚的含量小于 70%, 为富集葫芦茶根中多
酚 , 所以选用 1BV的水洗脱后用 6BV的 30%乙醇洗脱。
采用洗脱条件为 1BV的水洗脱 , 6BV的 30%乙醇洗脱 ,洗脱
流速为 2BV/h, 葫芦茶根中总多酚富集在 30%乙醇洗脱液部分 ,
富集物中总多酚含量为 77.2%,收率为 32.3%。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.7 时珍国医国药 2010年第 21卷第 7期
表 4　洗脱剂用量的影响
水洗脱
洗脱体积编号 多酚含量(%)
30%乙醇洗脱
洗脱体积编号 多酚含量(%)
1 32.4 1 73.0
2 50.7 2 77.6
3 52.9 3 84.0
4 59.4 4 83.9
5 62.3 5 88.3
6 71.8
7 40.3
8 33.5
3　讨论
在对葫芦茶根杀软体动物实验中发现其具有较强的杀软体
动物作用 , 经化学成分分析发现其富含多酚类成分 [ 9] ,因此我们
对葫芦茶根中富含的多酚类成分的提取和富集工艺进行了优化。
确定了最佳提取工艺条件为 30℃, 50%丙酮 , 8倍溶剂提取 3次 ,
4.5h/次 , 此条件下总多酚收率大于 6%。以 D101型大孔树脂对
总多酚进行富集 , 最佳工艺条件为 2BV/h流速 ,收集 6 BV30%
乙醇洗脱液 , 总多酚含量为 77.2%, 收率为 32.3%。 D101树脂
对葫芦茶多酚的吸附容量大 , 吸附性能稳定 , 吸附柱可按比例放
大用于工业富集葫芦茶多酚。
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收稿日期:2009-11-10;　修订日期:2010-02-08
基金项目:广西教育厅科研项目(No.200809MS124;200911MS195)
作者简介:王晓平(1968-),女(汉族),广西玉林人 ,现任玉林师范学院
化学与生物系副教授 ,学士学位 ,主要从事药理学和生理学研究工作.
五指毛桃水提液体外抗菌作用的实验研究
王晓平 1 ,段丽菊2 ,陈晓白 1 ,李丽梅 3 ,陆奇丰3 ,李鉴清 3
(1.玉林师范学院 化学与生物系 ,广西 玉林　537000;　
2.郑州大学 公共卫生学院 ,河南 郑州　450001;　
3.玉林师范学院 化学与生物系 本科生 ,广西 玉林　 537000)
摘要:目的 研究五指毛桃水提液体外抗菌作用 , 为其在临床的应用提供依据。方法 制备五指毛桃水提液 , 采用圆滤纸
片法测定其对大肠杆菌 、枯草芽孢杆菌 、金黄色葡萄球菌 、黑曲霉 、黄曲霉的抗菌效果;采用圆滤纸片 -二倍连续稀释法
测定其最低抑菌浓度。结果 在一定的浓度下 , 五指毛桃水提液对大肠杆菌 、枯草芽胞杆菌 、金黄色葡萄球菌均具有抑制
作用 , 最低抑菌浓度均为 1g/ml, 而对黑曲霉 、黄曲霉没有抑制作用。结论 五指毛桃水提液对细菌具有较强的抑制作用 ,
具有良好的开发前景。
关键词:五指毛桃;　体外抗菌;　最低抑菌浓度
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.07.058
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)07-1692-02
　　五指毛桃 RadixficiHirtae为桑科植物粗叶榕 Ficushirta
Vah1.的干燥根 , 又名 “南芪” “五爪龙”“五指牛奶” “土北芪” [ 1] 。
五指毛桃味辛 、甘 ,性平 , 具有健脾利湿 、益肺止咳 、舒筋通络的功
效 , 在临床上主要用于治疗脾虚浮肿 、食少无力 、肝炎 、风湿痹痛 、
肺痨咳嗽等症 [ 2] 。原植物分布在我国南部及西南部地区 , 因疗
效独特而在华南地区较为广泛地应用。 五指毛桃具有抗炎镇痛
作用 , 在临床上用来治疗慢性盆腔炎 、慢性支气管炎 、肝炎 、膀胱
炎 、肺结核等病 [ 3 , 4] 。但其药理研究报道较少 , 本文初次对其水
提液的抗菌作用进行了研究 ,为其在临床的应用提供实验依据。
1　材料
1.1　实验菌种 金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus, 枯草芽胞
杆菌 Bacillussubtilis, 大肠杆菌 Escherichiacoli, 黑曲霉 Aspergillus
niger, 黄曲霉Aspergillusflavus均由本系微生物与制药工程实验室
提供。
1.2 　试剂和仪器 五指毛桃购于玉林市中药材市场。牛肉膏蛋
白胨培养基 ,查氏培养基。细菌培养箱 、低温离心机等。
2　方法
2.1　五指毛桃水提液的制备 称取五指毛桃 200g, 加蒸馏水 10
倍 , 浸泡 1h, 加热煮沸后文火煎煮 2h,趁热滤取药液。药渣再加
5倍水 , 煎煮 1h后取滤液。 2次滤液合并后 ,加热浓缩 , 药液浓缩
至 4g/ml。 115℃灭菌 30 min,置 4℃冰箱保存备用 [ 5] 。
2.2　细菌悬液的制备 将菌种分别接种到相应斜面培养基上 , 置
于恒温箱中活化 , 细菌和霉菌的活化条件分别为 28℃下培养
48h、37℃下培养 24h。 经活化后的菌种用生理盐水稀释到
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 7期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.7