全 文 ：收稿日期:2012-12-19 接受日期:2013-05-28
基金项目:湖南省科技厅科技计划项目(2008FJ3077)
* 通讯作者 Tel:86-743-8563911;E-mail:ouyang1227@ 126． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2013，25:1715-1721
文章编号:1001-6880(2013)12-1715-07
响应面优化田基黄总多酚提取工艺
欧阳玉祝* ，李雪峰，毛山山
吉首大学化学化工学院，吉首 416000
摘 要:在单因素实验基础上，利用响应面法对影响超声辅助提取田基黄总多酚的主要因素(乙醇浓度、料液
比、超声温度和时间)进行了优化，建立了影响因素与总多酚之间的函数关系。获得最佳工艺条件为 70%乙醇，
料液比 1∶ 25(g /mL)，超声提取温度 46 ℃，提取时间 50 min。在此最佳条件下，总多酚提取率为 1． 3189%，试验
结果与模型预测值相符。
关键词:田基黄;总多酚;响应面法
中图分类号:TS201． 2，TQ282 文献标识码:A
Optimization on Extraction Technology of Total Polyphenol from
Hypericum Japonicum by Ｒesponse Surface Methodology
OUYANG Yu-zhu* ，LI Xue-feng，MAO Shan-shan
College of Chemistry and Chemical Engineering，Jishou University，Jishou 416000，China
Abstract:Ｒesponse surface methodology (ＲSM)was used to optimize ultrasonic-assisted extraction of total polyphenols
from Hypericum japonicum based on single-factor experiments． The main influencing factors，including ethanol concentra-
tion，material-solvent ratio，extraction temperature and time were determined． The function relationship between influen-
cing factors and response values was established． The optimum extraction conditions were as follows:the extraction sol-
vent was 70% ethanol，material-solvent ratio was 1∶ 25 (g /mL)，extraction temperature was 46 ℃，and extraction time
was 50 min． Under these conditions，the extraction rate of total polyphenols reached 1． 3189%，which was well matched
with the predicted value．
Key words:Hypericum japonicum;total polyphenol;response surface methodology
田基黄系藤黄科金丝桃属植物地耳草(Hyperi-
cum japonicum Thumb．)的干燥全草，具有清热解毒，
抑菌抗炎，抗氧化之功效［1］。研究表明，田基黄中
含有丰富的槲皮素、槲皮苷、山奈酚等多酚化合
物［2］。植物多酚是植物的次生代谢产物，具有延缓
衰老、抗菌抗炎、抗氧化和清除过氧自由基等生物活
性，广泛用于食品、保健品、日用化学品等领域［3-6］。
目前，田基黄的研究主要做中药用于临床［7］，多酚
类化合物的提取研究报道极少。响应面法是一种新
的工艺优化方法，广泛用于活性成分的提取分离工
艺条件优化［8］。本文以田基黄为原料，用曲面响应
法优化总多酚的提取工艺，研究结果能为田基黄的
开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料与仪器
1． 1． 1 仪器
UV-2450 型紫外可见分光光度计，日本岛津公
司;KQ-250E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限
公司;ＲE-85Z 旋转蒸发器，上海青浦沪西仪器厂;
SHB-III循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限
公司;DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州
长城科工贸有限公司;JA2003N型电子天平，上海精
密仪器厂;M22 型中量制备仪，天津玻璃厂。
1． 1． 2 材料与试剂
田基黄购置于吉首市药店，经 60 ℃，0． 1 MPa
真空干燥后，用粉碎机打成粉末备用。无水乙醇、硫
酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等均
为国产分析纯试剂;没食子酸标准品由上海沪宇生
物科技有限公司提供。
1． 2 实验方法
DOI:10.16333/j.1001-6880.2013.12.003
1． 2． 1 大孔树脂的预处理
D-101 大孔吸附树脂按参考文献［9］进行预处
理，处理好的湿树脂密封在三角瓶里备用(含水量
30%)。
1． 2． 2 田基黄总多酚的提取
准确称取 5． 0 g田基黄粉末，在不同温度下，按
一定料液比加不同浓度乙醇水溶液，提取容器置于
KQ-250E型超声波清洗器中心位置，离底部 2 cm。
超声提取一段时间，抽滤，滤液用提取的乙醇溶液定
容至 100 mL，用单因素实验和曲面响应优化法考察
总多酚的提取工艺条件。
1． 2． 3 田基黄总多酚的分离
提取液根据文献［9］按固液比 1∶ 6(g /mL)加 D-
101 大孔树脂吸附 4 h，再用 60%乙醇解吸，定容，用
紫外可见光分光光度法测多酚浓度。
1． 3 分析方法
1． 3． 1 标准曲线的绘制
以没食子酸为标样，取 10 mg /mL 没食子酸标
准母液，按参考文献［9］绘制标准曲线，经线性回归
得回归方程和相关系数为:C = 1． 7475A，Ｒ2 =
0. 9974。式中:C为没食子酸浓度(mg /mL);A 为吸
光度。
1． 3． 2 样品中总多酚含量测定
取待测液 1． 0 mL于 25 mL容量瓶中，用酒石酸
亚铁比色法按参考文献［10］测溶液在 540 nm处的吸
光度，结合回归方程计算多酚含量，按下式计算总多
酚提取率。
总多酚提取率(% ) =提取液中总多酚质量( g)田基黄粉末质量( g)
×100
2 结果与讨论
2． 1 提取工艺单因素影响实验
2． 1． 1 乙醇浓度对田基黄总多酚提取率的影响
称取 5． 00 g干燥田基黄粉末，按 1． 2． 2 方法在
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
50% 60% 70% 80% 90
乙醇浓度（%）
提
取
率（
%
）
图 1 乙醇浓度对多酚提取率的影响
Fig. 1 Influence of alcohol concentration on polyphenol ex-
traction rate
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
料液比（g/mL）
提
取
率（
%
）
01∶15 01∶20 01∶25 01∶3501∶30
图 2 料液比对多酚提取率的影响
Fig. 2 Influence of material － solvent ratio on polyphenol ex-
traction rate
料液比为 1∶ 10(g /mL)，60 ℃下超声提取 60 min，并
按 1． 2． 3 分离，考察乙醇浓度对总多酚提取率的影
响，结果见图 1。
图 1 结果表明，随乙醇浓度增加总多酚的提取
率增大，用 70%乙醇提取时，总多酚提取率最大为
1． 432%。因为多酚在植物细胞中与蛋白质、多糖等
以苷键、氢键和酯键等疏水键形式结合，要使多酚浸
出，必须破坏疏水键。水分子较小，容易通过细胞壁
进人细胞，但很难破坏疏水键;乙醇容易破坏疏水
键，但分子过大，难通过细胞壁。70%乙醇水溶液渗
透力最强，容易进入细胞内破坏疏水键，所以 70%
乙醇的提取率最高。
2． 1． 2 料液比对田基黄总多酚提取率的影响
料液比是田基黄用量与浸取溶剂体积之比。料
液比不同，溶剂用量不同，多酚的浸出率将不同。为
了考察料液比对总多酚提取率的影响，称取 5． 00 g
田基黄粉末，按 1． 2． 2 和 1． 2． 3 法实验，在乙醇浓度
为 70%，60 ℃下超声提取 60 min，结果见图 2。图 2
结果表明，按料液比为 1∶ 25(g /mL)提取时，总多酚
提取率最大为 1． 252%。因为料液比大，溶剂用量
多，总多酚浓度相对较低，不仅有利于溶剂向细胞内
渗透，而且有利于多酚向溶液中扩散;如果料液比太
大，将导致提取液中多酚浓度过小，不利于大孔树脂
对多酚的吸附分离。因此，料液比选择 1 ∶ 25(g /
mL)为宜。
2． 1． 3 提取时间对田基黄总多酚提取率的影响
多酚具有多个酚羟基，有很强的还原能力，如果
提取时间太长，将会造成多酚氧化，因此，提取时间
对多酚的提取率也有一定影响。为了考察提取时间
对多酚提取率的影响，称取 5． 00 g 田基黄粉末，按
1． 2． 2 和 1． 2． 3 法在乙醇浓度为 70%，固液比为 1∶
10(g /mL)，60 ℃温度下超声提取，结果见图 3。
6171 天然产物研究与开发 Vol. 25
30% 40% 50% 60% 70
时间（min）
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
提
取
率（
%
）
图 3 提取时间对多酚提取率的影响
F ig. 3 Influence of extraction times on polyphenol extraction rate
30% 40% 50% 60% 70
温度（℃）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
提
取
率（
%
）
图 4 提取温度对多酚提取率的影响
Fig. 4 Influence of extraction temperature on polyphenol ex-
traction rate
由图 3 可知，超声提取 50 min 时，总多酚提取
率达最大值 1． 273%，随后多酚提取率稍有减少。
因为 60 ℃下长时间加热提取，会导致多酚氧化。
2． 1． 4 提取温度对田基黄总多酚提取率的影响
称取 5． 00 g田基黄粉末，按 1． 2． 2 和 1． 2． 3 法
进行提取分离实验，以 70%乙醇为溶剂，在固液比
为 1∶ 10(g /mL)条件下超声提取 60 min，考察温度
对总多酚提取率的影响，结果见图 4。图 4 结果表
明，随温度升高，多酚提取率增大，50 ℃时达最大值
0． 919%，随后稍有减少。因为升高温度会增加分子
内能，加速溶剂分子运动，溶剂更容易进入植物细
胞，使提取率提高。如果温度过高，将加速多酚的氧
化，使多酚提取率降低。因此，选择 50 ℃最好。
2． 2 响应面法优化试验
2． 2． 1 Box-Behnken试验设计方案及试验结果
根据单因素影响实验得出最佳提取条件为
70%乙醇为溶剂，料液比 1∶ 25(g /mL)，50 ℃超声提
取 50 min。为了获得最佳组合条件，在此条件下，选
择乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间 4 个因
素，每个因素设三水平，以总多酚提取率为响应值进
行响应面优化，Design Expert 软件优化试验水平表
和试验结果见表 1 和表 2。
表 1 Box-Behnken试验设计因素水平表
Table 1 Factor and level list of Box-Behnken experimental design
编码值
Coded value
料液比
Material-solvent ratio
(g /mL)
乙醇浓度
Ethanol concentration(%)
提取时间
Extraction time(min)
提取温度
Extraction temperature(℃)
-1 1∶ 20 60 40 40
0 1∶ 25 70 50 50
1 1∶ 30 80 60 60
表 2 Box-Behnken试验设计及试验结果
Table 2 Design and result of Box-Behnken experiments
实验号
No．
料液比 A
Material-
solvent ratio
乙醇浓度 B
Ethanol
concentration
提取时间 C
Extraction
time
提取温度 D
Extraction
temperature
响应值 Ｒ
Ｒesponse value
1 0 0 -1 1 1． 251
2 1 1 0 0 1． 103
3 0 1 -1 0 0． 969
4 -1 0 0 1 1． 136
5 0 1 0 1 1． 088
6 0 1 0 -1 1． 175
7 1 0 -1 0 1． 078
8 -1 0 -1 0 1． 074
9 1 0 0 1 1． 118
10 1 0 1 0 1． 163
7171Vol. 25 欧阳玉祝等:响应面优化田基黄总多酚提取工艺
11 0 0 0 0 1． 335
12 0 0 0 0 1． 324
13 1 0 0 -1 1． 366
14 0 1 1 0 1． 04
15 0 0 0 0 1． 316
16 -1 0 1 0 0． 902
17 0 0 -1 -1 1． 065
18 -1 0 0 -1 1． 044
19 -1 1 0 0 0． 961
20 0 -1 0 1 1． 216
21 0 0 0 0 1． 317
22 0 0 1 -1 1． 217
23 0 -1 1 0 1． 02
24 0 -1 -1 0 1． 248
25 -1 -1 0 0 1． 089
26 1 -1 0 0 1． 259
27 0 0 0 0 1． 338
28 0 0 1 1 0． 981
29 0 -1 0 -1 1． 239
2． 2． 2 模型的建立及显著性检验
通过 Design Expert 软件对实验数据进行回归
分析，结果如表 3，回归方程为:
Y = -11． 341 + 117． 117A + 0． 113B + 0． 125C +
0． 138D-0． 07AB + 0． 643AC-0． 850AD + 7． 475 × 10-4
BC-1． 600 × 10-4 BD-1． 055 × 10-3 CD-1181． 250A2-
1. 039 × 10-3 B2-1． 538 × 10-3 C2-4． 275 × 10-4 D2，相关
系数 Ｒ2 = 0． 9919，回归方程在其试验点上与实验结
果拟合得非常好。
表 3 回归统计分析结果
Table 3 Ｒesult of regression statistical analysis
变异来源
Source of
variation
平方和
Quadratic
sum
自由度
Degree of
freedom
均方
Mean
square
F值
F value
P值
P value
显著性
Significance
模型 model 0． 475 14 0． 0339 121． 808 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
料液比(A)material-solvent ratio 0． 0646 1 0． 0647 232． 199 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
乙醇浓度(B)ethanol concentration 0． 0450 1 0． 0450 161． 616 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
提取时间(C)extraction time 0． 0109 1 0． 0109 39． 203 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
提取温度(D)extraction temperature 0． 00832 1 0． 0083 29． 873 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
AB 0． 000196 1 0． 0002 0． 703 0． 4157 不显著
AC 0． 0165 1 0． 0165 59． 278 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
AD 0． 0289 1 0． 0289 103． 750 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
BC 0． 0223 1 0． 0224 80． 236 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
BD 0． 00102 1 0． 0010 3． 676 0． 0758 不显著
CD 0． 0445 1 0． 0445 159． 829 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
A^2 0． 0905 1 0． 0905 324． 925 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
B^2 0． 0699 1 0． 0670 251． 259 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
8171 天然产物研究与开发 Vol. 25
C^2 0． 153 1 0． 1533 550． 466 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
D^2 0． 0118 1 0． 0119 42． 557 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
残差 Ｒesidual 0． 00389 14 0． 0003
失拟值 Lack of Fit 0． 00348 10 0． 0003 3． 404 0． 1245 不显著
纯误差 Pure Error 0． 00041 4 0． 0001
总和 Cor Total 0． 478 28
模型 Ｒ2 = 0． 9919Ｒ-Squared
调整 Ｒ2ady = 0． 9837
Adj Ｒ-Squared
Pred． Ｒ2 =
0． 9567
Adeq． precision = 33． 621
注:＊＊＊表示差异非常显著
Note:＊＊＊means very significant difference
从表 3 方差分析可知，实验所选模型的相关系
数 Ｒ2 = 0． 9919，P ＜ 0． 0001，表明模型极其显著;失
拟项 P = 0． 1245 ＞ 0． 05，没有显著性意义，说明数据
中没有异常点，不需要引入更高次数的项。校正后
的复相关系数 Ｒ2adj = 0． 9837，表明响应值(提取率)
变化的 98． 37%来自于所选变量。从模型系数显著
性检验分析，模型的一次项 A、B、C、D和二次项 A2、
B2、C2、D2 均达到极显著水平(P ＜ 0． 01)，表明实验
设计的线性效应和曲面效应显著;交互项中，只有
AB和 BD交互效应不显著，表明本实验设计交互效
应基本显著。将模型参数优化得到本实验设计的田
基黄总多酚最佳提取条件为:乙醇浓度为 69%，料
液比为 1∶ 25(g /mL)、提取温度为 46 ℃，提取时间
为 50 min，模型预测田基黄多酚最大提取率为
1. 3585%。
2． 2． 3 响应面分析
根据回归模型作出相应的响应曲面图和等高线
图，考察拟合响应曲面的形状，分析超声提取各因素
对多酚提取率的影响，响应曲面及等高线图，如图 5
～图 10 所示。
1.40
1.32
1.23
1.15
1.07
0.98
0.90
提
取
率（
%
）
80
75
70
65
60乙醇浓度（%） 0.03
0.04
0.06
0.05
0.07
料液比（g/mL） 料液比（g/mL）
0.03% 0.04% 0.05% 0.06% 0.07
80
75
70
65
60
乙
醇
浓
度（
%
）
提取率（%）
图 5 Y = f(A，B)的响应面和等高线
Fig. 5 Ｒesponse surface plot and contour plot of Y = f(A，B)
1.40
1.32
1.23
1.15
1.07
0.98
0.90
提
取
率（
%
）
0.03
0.04
0.06
0.05
0.07
料液比（g/mL） 料液比（g/mL）
0.03% 0.04% 0.05% 0.06% 0.07
60
55
50
45 40提取时间（min）
提取率（%）60
55
50
45
40
提
取
时
间（
m
in）
图 6 Y = f(A，C)的响应面和等高线
Fig. 6 Ｒesponse surface plot and contour plot of Y = f(A，C)
9171Vol. 25 欧阳玉祝等:响应面优化田基黄总多酚提取工艺
1.40
1.32
1.23
1.15
1.07
0.98
0.90
提
取
率（
%
）
0.03
0.04
0.06
0.05
0.07
料液比（g/mL） 料液比（g/mL）
0.03% 0.04% 0.05% 0.06% 0.07
60
55
50
45
40提取时间（℃）
提取率（%）60
55
50
45
40
提
取
时
间（
℃
）
图 7 Y = f(A，D)的响应面和等高线
Fig. 7 Ｒesponse surface plot and contour plot of Y = f(A，D)
提取率（%）
1.40
1.32
1.23
1.15
1.07
0.98
0.90
提
取
率（
%
）
60
55
45
40提取时间（min）
60
55
50
45
40
提
取
时
间（
m
in）
50
60
65
70
75
80
乙醇浓度（%）
60% 65% 70% 75% 80
乙醇浓度（%）
图 8 Y = f(B，C)的响应面和等高线
Fig. 8 Ｒesponse surface plot and contour plot of Y = f(B，C)
提取率（%）
1.40
1.32
1.23
1.15
1.07
0.98
0.90
提
取
率（
%
）
60
55
45
40提取时间（℃）
60
55
50
45
40
提
取
时
间（
℃
）
50
60
65
70
75
80
乙醇浓度（%）
60% 65% 70% 75% 80
乙醇浓度（%）
图 9 Y = f(B，D)的响应面和等高线
Fig. 9 Ｒesponse surface plot and contour plot of Y = f(B，D)
由图 5 ～图 10 可以看出，乙醇浓度对田基黄多
酚提取率的影响最为显著，表现在各图中的曲面较
陡，而提取温度的影响最不显著，表现为曲线较为平
滑。结合表 2 中各系数项的估计值可知，本实验各
因素的影响大小顺序依次为:乙醇浓度 ＞料液比 ＞
提取时间 ＞提取温度。
2． 2． 4 模型验证
为了检验响应曲面法实验结果的可靠性，并考
虑实验条件的可操作性，将提取工艺参数调整为:乙
醇浓度 70%、提取温度 46 ℃、提取时间 50 min、料
液比 1∶ 25(g /mL)。在此条件下进行验证实验，平
行实验 5 次取平均值，结果如表 4。
0271 天然产物研究与开发 Vol. 25
提取率（%）
1.40
1.32
1.23
1.15
1.07
0.98
0.90
提
取
率（
%
）
60
55
45
40提取时间（℃）
60
55
50
45
40
提
取
时
间（
℃
）
50
40
45
50
55
60
提取时间（min）
40% 45% 50% 55% 60
提取时间（min）
图 10 Y = f(C，D)的响应面和等高线
Fig. 10 Ｒesponse surface plot and contour plot of Y = f(C，D)
表 4 最佳吸附条件组合实验
Table 4 Confirmation experiment of optimum adsorption condition
序号 No． 1 2 3 4 5 平均 Mean
提取率 Extraction rate(%) 1． 2684 1． 3425 1． 3251 1． 3301 1． 3286 1． 3189
表 4 结果表明:在最佳提取条件下，田基黄中总
多酚的平均提取率为 1． 3189%，与预测值 1． 3585%
只相差 0． 0396%，表明本实验设计工艺条件准确可
靠，进一步验证了数学回归模型的合理性。
3 结论
本实验采用单因素实验和响应面优化了田基黄
总多酚提取工艺条件，在试验范围内建立的二次线
性回归模型准确有效。实验结果表明，在设定条件
范围内，田基黄总多酚提取工艺条件为:乙醇浓度为
70%，料液比为 1 ∶ 25(g /mL)、46 ℃温度下提取 50
min，多酚提取率为 1． 3189%。
参考文献
1 The Chinese Materia Medica Editorial Committee(中华本草
编委会)． Chinese Herbal Medicine(中华本草)． Shanghai:
Shanghai Science and Technology Press，1999． Vol Ⅲ，598-
601．
2 Fu P(傅芃)，Li TZ(李廷钊)，Liu ＲH(柳润辉)，et al．
Xanthones from the whole plant of Hypericum japonicum． Nat
Prod Ｒes Dev(天然产物研究与开发) ，2004，16:511-513．
3 Ouyang YZ(欧阳玉祝)，Lü CL(吕程丽)，Yi YH(易银
辉)，et al． Influence of plant polyphenol blend on antioxida-
tion performance of the oil-in-water type cosmetic cream．
Chin Surf Det Cosmet(日用化学工业)，2010，40:190-193．
4 Ouyang YZ(欧阳玉祝)，Wu DH(吴道宏)，Hu MH(胡明
浩)，et al． Effect of a combination of polyphenolic extracts
from Herba Gei and Herba Lysimachiae on antioxidant stabil-
ity of Kiwifruit juice． Food Sci(食品科学)，2010，31:126-
129．
5 Wang XJ(王修杰)，Yuan SL(袁淑兰)，Wei YQ(魏于
全)． Cancer preventive effect and anti-cancer activity of
plant polyphenols． Nat Prod Ｒes Dev(天然产物研究与开
发)，2005，17:508-517．
6 Li YF，Guo CJ，Yang JJ，et al． Evaluation of antioxidant prop-
erties of pomegranate peel extract in comparison with pome-
granate pulp extract． Food Chem，2006，96:254-260．
7 Lin H(林慧)，Mei QX(梅全喜)，Kong XL(孔祥廉)，et
al． Ｒesearch summary of clinical application and pharmaco-
logic action of Hypericum japonicum in hepatopathy． Today
Pharm(今日药学)，2011，21:500-502．
8 Liu JP(刘进鹏)，Wu CJ(吴纯杰)，Xin HL(辛海量)，et
al． Optimum extracting process for biflavone of the leaves and
branches of Cunninghamia lanceolata by central composite
design and response surface method． Nat Prod Ｒes Dev(天然
产物研究与开发)，2012，24:514-519．
9 Ouang YZ(欧阳玉祝)，Chen XD(陈小东)，Tang HY(唐
红玉)，et al． Extraction and separation of total polyphenols
from Herba gei． Food Sci(食品科学)，2009，30(16) :44-
49．
10 Wang LZ(王丽珠)，Wu L(吴棱)，Yao YG(姚元根)，et
al． Spectrophotometric determination of tea-polyphenol with
ferrous tartrate． Chin J Spectro Lab(光谱实验室)，1997，14
(3) :52-54．
1271Vol. 25 欧阳玉祝等:响应面优化田基黄总多酚提取工艺