全 文 ：收稿日期:2015-05-25
作者简介:范海涛(1979-) ，男(汉族) ，北京人，讲师，硕士，主要从事天然来源多糖的分离、结构鉴定与活性的研究，
Tel． 010-87226049，E-mail f 81896605@ 163. com;
文章编号:1006-2858(2016)02-0110-04 DOI:10． 14066 / j． cnki． cn21-1349 /r． 2016． 02． 004
蝙蝠草多糖的提取和分离及其活性测定
范海涛1* ，辛秀兰1，兰 蓉1，韩晓强2，胡仲冬3，曲 伟4
(1. 北京电子科技职业学院 生物工程学院，北京 100029;2. 香港中文大学 深圳研究院，广东 深圳 518057;
3. 北京中医药大学 中药现代研究中心，北京 100029;4. 北京联合大学校医院，北京 100101)
摘要:目的 提取和分离纯化蝙蝠草多糖，并进行结构分析与活性测定。方法 对蝙蝠草多糖进行
提取和分离纯化，得到均一组分蝙蝠草多糖 02-2(christia vespertilionis polysaccharides 02-2，CP 02-
2)。采用 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼［1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-(2，4，6-tri-
nitrophenyl)hydrazyl，DPPH］自由基清除、小鼠巨噬细胞增殖、吞噬能力和产生 NO 等试验方法对
CP 02-2 的活性进行研究。结果 CP 02-2 对浓度 0. 1 mmol·L －1 DPPH 溶液的自由基清除率为
28. 99%，对小鼠巨噬细胞 ＲAW264. 7 的增殖、吞噬能力和产生 NO的能力均具有促进作用，与空白
对照组有显著性差异(P ＜ 0. 01) ，且当质量浓度为 1 500 mg·L －1时，活性最大。结论 蝙蝠草多糖
CP 02-2 具有一定的药理活性。
关键词:蝙蝠草;多糖;活性;巨噬细胞
中图分类号:Ｒ 917;Ｒ 931. 6 文献标志码:A
蝙蝠草为我国壮族的传统民族草药，来源于
豆科蝙蝠草属植物蝙蝠草［Christia vespertilionis
(L. f．)Bahn． f］，主要分布于我国广西、广东和海
南岛。当地民间以其全草代茶饮，有养生保健功
效，也以全草入药，水煎服主治肺结核、支气管炎、
扁桃体炎和痈肿疮毒等［1］。多糖(polysaccha-
rides)是由单糖连接形成的大分子物质，据文献报
道多种植物来源的多糖具有抗氧化、清除自由基
和免疫活性，是部分中草药提高免疫力，发挥保健
功能的物质基础之一。目前对蝙蝠草的现代化研
究报道很少，并仅局限于资源分布、种属鉴别和栽
种用途［2 － 3］，对蝙蝠草化学成分的研究至今未见
报道，对蝙蝠草多糖的研究亦属空白，本研究作者
通过提取和分离纯化，从蝙蝠草中得到均一组分
CP 02-2，并对其进行特征分析和活性测定，为蝙
蝠草的开发利用提供依据。
1 仪器与试药
CAＲY 50 全波长紫外扫描仪(美国 Varian
公司) ，WZZ-2S 自动旋光仪(上海精密科学仪
器有限公司) ，Agilent 7890A-5975C 气相色谱-
质谱联用仪、DB-5 色谱柱(30 m × 0. 25 mm，
0. 25 μm)、质谱检测器、Agilent 1200 高效液相
色谱仪和 G1352A ＲID 检测器(美国 Agilent 科
技有限公司) ，TSK G5000 PWXL 凝胶色谱柱
(300 mm × 7. 8 mm，10 μm)、LABOＲATA 4000
旋转蒸发仪(德国 Heidolph 公司) ，AＲ224CN
电子天平(美国 Ohaus 公司) ，TD5A-WS 高速
离心机(上海安亭科学仪器厂) ，ZＲQ30 冷冻干
燥机(天津因赛科技发展有限公司) ，WF2 UV-
2100 紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪
器有限公司)。
试验用药材于 2014 年购于广西千缘药材公
司(产地广西河池) ，经中国科学院植物研究所于
胜祥副研究员鉴定为蝙蝠草［Christia vespertilionis
(L． f．)Bahn． f．］的干燥全草。植物标本存于北京
电子科技职业学院生物工程学院中药标本馆(编
号 20140731-1)。ＲAW264. 7 巨噬细胞由北京大
学医学部曾克武老师惠赠。
DMEM培养基(中科迈晨(北京)科技有限公
司) ，胎牛血清优级(北京华美兰博生物科技有限
公司) ，一氧化氮(NO)测定试剂盒(硝酸还原酶
法) (南京建成生物工程研究所) ，1 1-二苯基-2-三
硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，
2-diphenyl-1-(2，4，6-trinitrophenyl)hydrazyl，DP-
PH，美国 Sigma-Aldrich公司) ，多糖分子质量测定
第 33 卷 第 2 期
2 0 1 6 年 2 月
沈 阳 药 科 大 学 学 报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol. 33 No. 2
Feb． 2016 p. 110
用系列标准品(分子质量分别为 1. 2 × 104，2. 5 ×
104，5. 0 × 104，8. 0 × 104，2. 7 × 105，4. 1 × 105，6. 7
× 105 u，美国 Sigma-Aldrich 公司) ，透析袋(截留
相对分子质量 2000，美国 MYM 生物科技有限公
司) ，葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、氯
化钠、三氯甲烷、正丁醇和无水乙醇等试剂均为分
析纯。
2 方法与结果
2. 1 CP的提取
称取 750 g 蝙蝠草全草，切成约 3 cm 段，以
无水乙醇回流提取 2 次，残渣按照文献［4］中多
糖的提取方法提取蝙蝠草粗多糖，并以 Sevage 法
除蛋白，再以无水乙醇、丙酮反复洗涤得到蝙蝠草
多糖(Christia vespertilionis Polysaccharides，CP)。
2. 2 CP的分离纯化
称 取 CP 6. 08 g，用 蒸 馏 水 溶 解，以
DEAE DE-52离子交换色谱柱分离，分别采用蒸馏
水及 0. 2、0. 4 mol·L －1 NaCl 溶液洗脱，每个部位
收集 3. 0 L。将用浓度 0. 2 mol·L －1 NaCl 洗脱的
部分浓缩后置于透析袋中，进行透析，之后以
Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱进行分离纯化，以
水为流动相进行洗脱，洗脱速度为1 mL·min －1，
部分收集器收集洗脱部分，每管收集洗脱液 3
mL，将各管洗脱液以高效液相色谱法检测，合并
相同峰的洗脱液，最终得到一个单一对称峰组分，
该组分命名为 CP 02-2。
2. 3 CP 02-2 的特性分析
2. 3. 1 旋光度测定
精密称定 CP 02-2 10. 0 mg置 25 mL量瓶中，
水溶解，配制成质量浓度为 0. 4 g·L －1的多糖溶
液。取 20 mL上述溶液置于旋光管中。以水为空
白，用自动旋光仪测量 CP 02-2 旋光度。经计算，
CP 02-2 旋光度为［α］20D = + 38. 5°。
2. 3. 2 分子质量分布的测定
以 HPLC 法对系列多糖标准溶液和 CP 02-2
溶液进行测定。色谱柱为 TSK G5000PWXL
(300 mm × 7. 8 mm，10 μm)凝胶色谱柱;柱温
40 ℃;流动相为去离子水;流速为0. 8 mL·min －1;
示差折光检测器检测。
分别称取适量的分子质量为 1. 2 × 104、
2. 5 × 104、5 × 104、8 × 104、2. 7 × 105 和 4. 6 × 105 u
的 Dextran标准品，加入去离子水，配成质量浓度
约 2 g·L －1的对照溶液，并以 0. 45 μm 水系滤膜
过滤，进行 HPLC 检测，以保留时间(ＲT)为横坐
标 x，分子质量的对数值为纵坐标 y，得标准曲线
y = － 0. 332x + 10. 224(r = 0. 998 0)。
称取一定量的 CP 02-2，加入去离子水，配成
质量浓度约 2 g·L －1的样品溶液，按上述方法进行
检测，以 CP 02-2 保留时间依上述标准曲线公式
进行计算，得 CP 02-2 的重均分子质量(molecular
weight，Mw)为 2. 2 × 105 u。
2. 3. 3 单糖组成的测定
按照文献［5］所述方法对 CP 02-2 进行全水
解还原衍生化，以标准单糖为参照，对 CP 02-2 进
行单糖组成的测定。气相条件为采用 DB-5
(30 m ×0. 25 mm，0. 25 μm)色谱柱;检测器为质
谱检测器;进样口温度为 250 ℃;检测器温度为
280 ℃;氮气流速为 0. 6 mL·min －1;分流比为
20∶ 1;进样量为 5 μL;升温程序为 200 ℃保持
2 min，以 3 ℃·min －1 的速率升至 245 ℃，再以
10 ℃·min －1的速率升至 270 ℃，保持 2 min。
测得 CP 02-2 由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半
乳糖组成，物质的量比为 2. 44∶ 1∶ 6. 54∶ 1. 28。
2. 4 CP 02-2 的清除自由基活性测定
按照文献［6］所述方法对 CP 02-2 进行清除
自由基活性测定，以样品对 DPPH 自由基的清除
率作为评价指标。CP 02-2 对浓度 0. 1 mmol·L －1
的 DPPH 溶液的自由基清除率为 28. 99%
(ＲSD =2. 28%)。
2. 5 CP 02-2 对小鼠巨噬细胞增殖的影响
按照文献［7］所述方法，以 96 孔板测定 CP
02-2 对 ＲAW264. 7 小鼠巨噬细胞增殖能力的影
响。组 1 为空白对照组组 2 ～ 7 为给药组，给药组
细胞分别给予终质量浓度为 30、150、300、800、
1 500和 3 000 mg·L －1的多糖溶液，将细胞在体积
分数 5%CO2、37 ℃培养箱中培养 24 h后，吸去培
养液，每孔加入 20 μL MTT，在上述条件下继续培
养 4 h，弃上清液，每孔加入 150 μL DMSO，振荡器
上震荡 10 min，酶标仪 570 nm 波长检测吸光值，
以空白对照组的吸光值为 100%，各给药组与对
照组的吸光度比值计算细胞相对增殖率。不同质
量浓度给药条件下各孔吸光值的比值结果见图
1。从图 1 可知，不同质量浓度的CP 02-2溶液对
细胞的增殖作用影响不同，在质量浓度 30 ～
1 500 mg·L －1的内，多糖给药组与空白对照组有
显著性差异，随着质量浓度的增大，对细胞的增殖
促 进 作 用 逐 渐 增 强，并 在 质 量 浓 度 为
111第 2 期 范海涛等:蝙蝠草多糖的提取和分离及其活性测定
1 500 mg·L －1时达到最大值。
a—P ＜ 0. 05;b—P ＜ 0. 01
Fig． 1 Effect of CP 02-2 on viability of ＲAW264. 7 mac-
rophages
图 1 CP 02-2 对小鼠巨噬细胞 ＲAW264. 7 增殖的影响
2. 6 CP 02-2 对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响
按照文献［8］所述方法，以中性红作为目标
异物，以 96 孔板测定 CP 02-2 对 ＲAW264. 7 小鼠
巨噬细胞吞噬能力的影响。组 1 为空白对照组，
组 2 ～ 7 为给药组，给药组细胞分别给予终质量浓
度为 30、150、300、800、1 500 和 3 000 mg·L －1的多
糖溶液，将细胞在体积分数 5% CO2、37 ℃培养箱
中培养 24 h后，每孔加质量浓度为720 mg·L －1的
中性红溶液 100 μL，将细胞在体积分数 5% CO2、
37 ℃培养箱中继续培养 24 h 后，吸去培养液，每
孔加入 50 μL 冰醋酸及 50 μL 乙醇，置于4 ℃冰
箱中 2 h。从冰箱中取出 96 孔板，置于振荡器上
震荡 10 min，酶标仪波长 495 nm 检测吸光值，以
空白对照组的吸光值为 100%，以各给药组与对
照组的吸光度比值计算细胞相对增殖率。不同质
量浓度给药条件下各孔吸光值的比值结果见图
2。从图 2 可知，不同质量浓度的 CP 02-2 溶液对
细胞的吞噬能力影响不同，在质量浓度 30 ～
1 500 mg·L －1内，多糖给药组与空白对照组有显
著性差异，随着质量浓度的增大，对细胞的吞噬能
力 的 影 响 逐 渐 增 强，并 在 质 量 浓 度 为
1 500 mg·L －1时达到最大值。
2. 7 CP 02-2 对小鼠巨噬细胞产生 NO的影响
采用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中
NO －2 间接反映生成 NO 的量。组 1 为空白对照
组，组 2 ～ 7 为给药组，给药组细胞分别给予终质
量 浓 度 为 30、150、300、800、1 500 和
3 000 mg·L －1的多糖溶液，将细胞在体积分数
a—P ＜ 0. 05
Fig． 2 Effect of CP 02-2 on engulfment capability of
ＲAW264. 7 macrophages
图 2 CP 02-2 对小鼠巨噬细胞 ＲAW264. 7 吞噬能力的
影响
5%CO2、37 ℃培养箱中培养 24 h 后，按照 NO 检
测试剂盒说明书进行操作，于酶标仪波长 495 nm
检测吸光值，以吸光度值反映细胞产生 NO 的能
力。不同质量浓度给药条件下各孔吸光值结果见
图 3。从图 3 可知，不同质量浓度的 CP 02-2 溶液
对细胞产生 NO 的影响不同，在质量浓度 800 ～
3 000 mg·L －1内，对细胞产生 NO 的的影响与空
白对照组有显著性差异。
a—P ＜ 0. 05
Fig． 3 Effect of CP 02-2 on NO production of
ＲAW264. 7 macrophages
图 3 CP 02-2 对小鼠巨噬细胞 ＲAW264. 7 产生 NO 能
力的影响
3 讨论
作者通过提取分离最终纯化得到均一分子质
量的蝙蝠草多糖 CP 02-2，并进行了单糖组成与分
子质量分布的分析，以不同药理活性检测方法，研
211 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 33 卷
究了 CP 02-2 的药理活性。结果表明 CP 02-2 具
有一定的清除 DPPH 自由基的能力，可能是蝙蝠
草代茶饮产生保健功效的活性来源。在以不同质
量浓度 CP 02-2 考察对小鼠巨噬细胞影响的实验
中，随着给药质量浓度的增加，CP 02-2 促进小鼠
巨噬细胞的增殖的能力、促进细胞吞噬和产生
NO的能力的作用增强，显示了蝙蝠草多糖产生
的免疫促进作用。但是当 CP 02-2 质量浓度过高
时，相应以上指标反而出现下降，推测与大剂量
CP 02-2作用于细胞干扰了细胞代谢或产生了细
胞毒作用有关。本研究作者对合理使用和开发蝙
蝠草提供了理论依据。
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Purification and activity determination of polysaccharides
from Christia vespertilionis
FAN Hai-tao1* ，XIN Xiu-lan1，LAN Ｒong1，HAN Xiao-qiang2，HU Zhong-dong3，QU Wei4
(1． College of Bioengineering，Beijing Polytechnic，Beijing 100029，China;2． Shenzhen Ｒesearch Institute，
The Chinese university of Hong kong，Shenzhen 518057，China;3． Modern Ｒesearch Center for TCM，Beijing
University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China;4． Hospital of Beijing Union University，Beijing
100101，China)
Abstract:Objective To investigate the structure and activity of polysaccharides(CP)from Christia vespertilionis
(L． f．)Bahn． f．Methods The polysaccharides were extracted and purified from Christia vespertilionis(L． f．)
Bahn． f． and uniform polysaccharide named CP 02-2 was obtained． The effect of CP 02-2 on DPPH
reducing assay，cell viability，engulfment capability and NO production of ＲAW264. 7 macrophages were
investigated． Ｒesults The viability，engulfment capability and NO production of ＲAW264． 7 macrophages
had been stimulated most by CP 02-2 with 1 500 mg·L －1 ． Conclusions The presented results confirm that
CP had capacity of eliminating DPPH radicals and cell-stimulatingactivity．
Key words:Christia vespertilionis;polysaccharides;activity;macrophages
311第 2 期 范海涛等:蝙蝠草多糖的提取和分离及其活性测定