全 文 ：前体物对粉葛细胞生长及次生代谢的影响
项雷文 ,郭丽梅
(福建师范大学福清分校生物与化学工程系 , 福建福清　350300)
摘　要:黄酮类化合物是粉葛积累的一类重要的次生代谢产物 ,具有良好的药用价值。本实
验以粉葛为模式植物 , 通过观测不同前体物(L-苯丙氨酸 、肉桂酸 、阿魏酸和香豆素)及不同浓度
梯度(10mg/ L 、20mg/ L、30mg/ L 和 40mg/ L)的同种前体物对粉葛细胞的生长特性 , 黄酮类化合物
合成过程中关键酶苯丙氨酸裂解酶 PAL的活性及总黄酮含量的影响。结果表明 , 高浓度的 L—
苯丙氨酸和肉桂酸抑制粉葛细胞的生长;低浓度的 L-苯丙氨酸对总黄酮积累有较大的促进作
用:添加 L-苯丙氨酸和香豆素都降低了 PAL的活性。
关键词:粉葛细胞;前体物;总黄酮;PAL
中图分类号:Q946　　文献标识码:A　　文章编号:1008-3421(2004)02-0050-04
0　引言
随着病原微生物对抗生素耐药性的加强 ,药用植物愈来愈受到人们的关注。迄今为止 ,已可从细胞培养物
中分离出 600 多种次生代谢产物[ 1] , 其中用于药用的有紫草宁 、人参皂甙 、紫杉醇等。但植物细胞培养技术仍
存在着缺陷 ,主要是不少药用植物培养的细胞中目的次生代谢产物的含量低 ,即使偶尔含量高也存在产量不稳
定问题。其次是植物细胞生长速率低 ,培养过程中易受污染 ,不易进行工业化生产。
在植物细胞培养中加入目的化合物生物合成的前体物是提高次生代谢产物产量的有效途径[ 2] 。但一些外
源前体物的加入会抑制植物细胞的生长 ,从而也影响了最终产量[ 3] , 就大多前体物而言 , 存在前体物的添加最
佳浓度。
本实验采用粉葛作为模式植物 ,粉葛中主要药用成分是黄酮类化合物。与其它诱导后的植物细胞相比有
生长周期短 ,营养物质代谢途径明了等特点。根据植物苯丙烷类代谢途径示意图[ 5] , 选择在培养基中添加 L-
苯丙氨酸 、肉桂酸 、阿魏酸和香豆素 ,来探讨其对粉葛细胞生长 、总黄酮含量 , PAL 活性的关系 ,为实现药用植物
细胞培养工业化生产提供参考。
1　材料和仪器
1.1　材料和试剂
材料:粉葛(杭州市药物种植场提供)及其愈伤组织(实验室所筛选细胞系)
试剂:芸香叶苷(Rutin)(生化试剂)、无水乙醇(分析纯)
1.2　仪器
HY-2调速多用振荡器(常州国华电器有限公司)、LRH-250-GS 型人工气候箱(广东省医疗器械厂)、
UV-1100 紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)
2　实验方法
2.1　实验处理
前体物:L-苯丙氨酸 、肉桂酸 、阿魏酸和香豆素;浓度梯度:10mg/ L、20mg/ L 、30mg/ L和 40mg/ L。
处理:将细胞接种于添加各种前体物的固体培养基中并立即置于光照培养箱中 ,每天连续照射 10 小时 , 处
理时间由结果 3.1 而定。
对照:不添加前体物。
2.2　愈伤组织生长参数的测定
生长指数=(收获细胞量-接种细胞量)/接种细胞量
2.3　黄酮的提取和测定
2004年第 2期
总第 64 期　　　　
《福建师范大学福清分校学报》
JOURNAL OF FUQING BRANCH OF FUJIAN NORMAL UNIVERSITY
　　
Sum No.64
收稿日期:2003-12-04
作者简介:项雷文(1975-),男 ,浙江淳安人 ,食品科学硕士 ,研究方向:食品资源开发;
郭丽梅(1980-),女 ,福建武夷山市人 ,助理工程师。
参考伍碧珍[ 6]方法 , 得到以芦丁对照品含量与吸光度的标准曲线及回归万程 Y=0.9771+0.0121 , 相关系
数 r=0.9996。
2.4　苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定
黄酮类化合物的生物代谢是许多植物体内次生物质的特征之一 , 苯丙氨酸解氨酶(PAL)是这一系列酶反
应中的第一关键酶。
粗酶提取和酶活性测定参照 Kouko l和 Conn(1961)[ 7]方法
3　结果和分析
3.1　粉葛细胞的生长曲线和总黄酮含量的变化
将培养 5 代以上的粉葛细胞接种于 Ms 培养基上(接种量约为 0.5 克/瓶)置于光照培养箱中 , 每日连续照
射 10 小时。每隔三天随机取样测定细胞鲜重 、干重及总黄酮含量 ,直至 28 天。其结果见图 1 、图 2。
图 1　粉葛细胞的生长曲线　　　　　　　　　　图 2　粉葛细胞的总黄酮含量
由图 1 知 ,粉葛愈伤组织在此培养条件下 , 前 3 天生长缓慢 ,其后生长速率加快 ,在 12 天左右生长稍有减
慢随后进入对数生长期。20 天时 , 生长量达到最高值。之后 , 细胞进入衰亡 ,生长急剧下降。图 2 显示 , 总黄
酮积累量在前阶段呈缓慢上升趋势 ,第 12 天开始急剧上行 , 到第 16 天总黄酮含量达到最高值 , 接着又缓慢下
行。因此我们选择培养 16 天 , 这时粉葛细胞生长旺盛 ,总黄酮含量达到最高。
3.2　不同前体物对粉葛细胞生长量的影响
结果如图 3 所示。
图 3　不同浓度前体物对粉葛细胞生长的影响
(注:1)L-苯丙氨酸;2)肉桂酸;3)阿魏酸;4)香豆素)
Fig3　Effects of different concentration precursors on the growth of Pueraria lobata
1)L-phe;2)Cinnamic acid;3)trans-Ferulic acid;4)Coumarin)
由图3 可知 , 在培养基中添加 L-苯丙氨酸对粉葛细胞的生长具有明显的抑制作用 ,这与吕东平等报道有
关 L-苯丙氨酸对雪莲细胞生长的试验结果一致;与赵德修等报道的较低浓度的外源 L-苯丙氨酸对雪莲细
胞的生长并不明显 ,但高浓度的外源 L-苯丙氨酸对雪莲细胞的生长会受到明显抑制一致。
肉桂酸对粉葛细胞的生长也具有明显的抑制作用 , 与赵德修等报道的肉桂酸对雪莲细胞的生长具有抑制
作用 ,且随浓度的增大而增强一致。而添加阿魏酸和香豆素对粉葛细胞的生长影响不大。
51第 2 期　　　　　　　项雷文　郭丽梅:前体物对粉葛细胞生长及次生代谢的影响 　　　　　　　
3.3　不同前体物对粉葛细胞总黄酮含量的影响
结果如图 4 所示。
图 4　不同浓度前体物对粉葛细胞总黄酮含量的影响
(注:1)L-苯丙氨酸;2)肉桂酸;3)阿魏酸;4)香豆素)
Fig4　Ef fects of different concentration precursors on flavonoids levels of Pueraria lobata cell
(1)L-phe;2)Cinnamic acid;3)trans-Ferulic acid;4)Coumarin)
从图 4 可以看出 ,添力口浓度为 10mg 几的 L-苯丙氨酸对粉葛细胞中总黄酮积累有较大的促进作用。
而添加其他前体物质以及高浓度的 L-苯丙氨酸对粉葛细胞中黄酮类化合物的积累无明显的促进作用。这与
赵德修等报道的结果 0.1mM 浓度的外源 L-苯丙氨酸下 ,雪莲细胞的黄酮含量最高基本一致 , 但与肉桂酸对
雪莲细胞合成黄酮类化合物的促进作用强于 L-苯丙氨酸不同。
3.4　不同前体物对粉葛细胞 PAL 的影响
结果如图 5 所示。
图 5　前体物对 PAL活性的影响
Fig5　Effects of dif ferent precursors on PAL activities of Pueraria lobata cell
由图 5 可知 ,在培养基中添加 L-苯丙氨酸对 PAL 活性并无多大影响 ,只是略有提高;添加肉桂酸和阿魏
酸都较大程度的降低了 PAL的活性 , 这原因可能是在黄酮的生物合成过程中 , PAL是关键酶 , 催化 L-苯丙氨
酸生成肉桂酸 ,而直接添加了肉桂酸则减小了对 PAL 的依赖 ,反馈抑制了 PAL 的活性 , 当然 PAL只是其中的
一个关键酶 ,其活性受多种因素影响。只有添加了香豆素这一前体物才有效的提高了 PAL的活性。
4　讨论
之前对黄酮类化合物合成途径的研究表明 , PAL 是黄酮类化合物合成过程中的第一限速酶 , 其活性的强弱
直接影响总黄酮含量。而从实验结果看 , PAL对总黄酮的积累影响不大 , 因此 PAL 可能为非限速酶。需进一
步寻找出黄酮类化合物合成的高峰时间 ,来确定粉葛细胞黄酮类化合物合成过程中可能的限速酶。
本文从前体物角度来寻找提高植物次生代谢物的最有效方法 , 从实验结果看 ,虽对黄酮类化合物的合成途
径及关键酶有所了解 ,但仅从前体物质的改变来研究总黄酮的积累量和 PAL的活性是有局限性的 , 且从植物
52　　　　　　　　　　　　　　福建师范大学福清分校学报 　　　　　　　　　　　　　　2004 年 4 月
细胞培养方法与培养条件的优化方面研究是很难找到一个最佳方案 , 只有从整体上即从分子水平上弄清有关
次生代谢产物生物合成机理 ,并从基因水平上对其生物合成进行调控 ,增加次生代谢产物合成过程中一系列关
键酶基因的表达量 ,从而彻底解决药用植物细胞培养次生代谢产物低 、不稳定的难题 , 真正实现利用药用植物
细胞培养技术工业化生产次生代谢产物的目的。
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Precursor on the Growth of Pueraria Lobata Cell
and the Secondary Metabolism
XIANG Leiw en , GUO Limei
(Fuqing Branch of Fujian No rmal University , Fuqing , Fujian , 350300)
Abstract:Flavon oids compounds are a kind of important secondary metabolities accumula ted in Pueraria lobata cell ,
and have a special value in medicine.Taking Pueraria lobata as a pattern , we observed that precursors(L-phe , Cin-
namic acid , trans-Ferulic acid , Coumarin)had an effect on the grow th of Pueraria lobata , the activity of Phenylala-
nine ammonia-lyase(PAL)w hich appeared during fiavonoids synthesis and the content of flavonoids.As a result , L
-phe and Cinnamic acid had promo ting effects on cell grow th , w hile the highest flavonoids levels w ere obtained on
the medium containing low concentration of L-phe.PAL activities were enhanced when adding L-phe and trans-
ferulic acid.
Key Words:Pueraria lobala cell;precurso r;Pheny lalanine ammonia-lyase
53第 2 期　　　　　　　项雷文　郭丽梅:前体物对粉葛细胞生长及次生代谢的影响