全 文 ：160 2016, Vol.37, No.09 食品科学 ※生物工程
外源物质对新疆紫草毛状根次生代谢
产物含量的影响
葛素囡1，张生翾1，王  芳1,*，魏  欢1，谢文磊1，谢  建1，李  驰1，赵  胡2,*
（1.新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.阜阳师范学院生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037）
摘  要：目的：探讨不同外源物质对新疆紫草毛状根中次生代谢产物含量的影响。方法：采用分光光度法测定
AgNO3、L-苯丙氨酸、乙酸钠影响下新疆紫草毛状根提取物中次生代谢产物的含量。结果：AgNO3质量浓度为
5 mg/L时，毛状根中紫草素、总多酚及总黄酮的含量分别较对照提高了5、0.3 倍和0.8 倍，而花青素的含量在
AgNO3质量浓度为3 mg/L时达峰值，较对照提高了0.4 倍。在AgNO3质量浓度为5 mg/L前提下，L-苯丙氨酸质量浓
度为25 mg/L时，紫草素、花青素及总黄酮的含量均达峰值，分别较对照提高了0.3、1.4 倍和1.2 倍。而总多酚含量
虽然并未高于对照组，但是在各个处理中仍然含量最高。在AgNO3、L-苯丙氨酸质量浓度分别为5、25 mg/L时，
总多酚和紫草素含量均在乙酸钠质量浓度为50 mg/L时达到最高，花青素的含量在乙酸钠质量浓度为200 mg/L时达
到最高，而乙酸钠不同处理的毛状根中总黄酮含量均明显低于对照。结论：外施一定质量浓度的诱导子AgNO3及
AgNO3和L-苯丙氨酸的联合作用均能促进新疆紫草毛状根次生代谢产物的积累；外施一定质量浓度的AgNO3、L-苯
丙氨酸及乙酸钠可协同促进毛状根中总多酚、花青素和紫草素的积累，但显著抑制总黄酮的合成积累。
关键词：新疆紫草；毛状根；次生代谢产物；诱导子；前体物质
Effects of Exogenous Substances on the Content of Secondary Metabolites in Arnebia euchroma Johnst Hairy Roots
GE Sunan1, ZHANG Shengxuan1, WANG Fang1,*, WEI Huan1, XIE Wenlei1, XIE Jian1, LI Chi1, ZHAO Hu2,*
(1. College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Ürümqi 830052, China;
2. School of Biotechnology and Food Engineering, Fuyang Normal College, Fuyang 236037, China)
Abstract: Objective: To investigate the effects of different exogenous substances on the content of secondary metabolites in
Arnebia euchroma Johnst hairy roots and consequently provide a theoretical basis for further development and utilization of
Arnebia euchroma Johnst hairy roots. Methods: The contents of secondary metabolites were measured by spectrophotometry
from Arnebia euchroma Johnst hairy roots cultured in the presence of AgNO3 alone and in combination with L-phenylalanine
or L-phenylalanine plus sodium acetate. Results: The contents of shikonin, total polyphenols and total flavonoids in hairy
roots cultured for 30 days at an AgNO3 concentration of 5 mg/L respectively increased by 6, 1.3, 1.8 times compared with
the control (CK). In addition, when AgNO3 concentration was 3 mg/L, the anthocyanin content reached its peak, a 1.4-fold
increase over the control. Peak contents of shikonin, anthocyanins and total flavonoids were observed after culture in the
presence of both 25 mg/L L-phenylalanine and 5 mg/L AgNO3, which were increased by 1.3, 2.4 and 2.2 times, respectively,
compared with the CK. The content of total polyphenols was not higher than that in the CK, but it was still the highest among
three treatment groups. The contents of shikonin and total polyphenols reached their highest levels at 50 mg/L among different
sodium acetate concentrations combined with 5 mg/L AgNO3 and 25 mg/L L-phenylalanine, whereas the highest content of
anthocyanin was observed when the sodium acetate concentration was 200 mg/L. The content of total flavonoids in hairy
roots with sodium acetate treatments at various concentrations was significantly lower than that of the control. Conclusion:
The addition of AgNO3 and L-phenylalanine can cooperatively promote the accumulation of secondary metabolites in
Arnebia euchroma Johnst hairy roots. Meanwhile, AgNO3, L-phenylalanine and sodium acetate can cooperatively promote
the accumulation of shikonin, polyphenol and anthocyanin, but significantly inhibit the accumulation of total flavonoids.
收稿日期：2015-05-18
基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31060205）；阜阳师范学院自然科学研究项目（2013FSKJ04ZD）
作者简介：葛素囡（1989—），女，硕士研究生，研究方向为植物细胞工程。E-mail：940747841@qq.com
*通信作者：王芳（1962—），女，教授，硕士，研究方向为植物细胞工程。E-mail：Wangfang1hao@126.com
赵胡（1977—），男，讲师，博士，研究方向为植物次生代谢调控。E-mail：zhaohu8196@sina.com
※生物工程 食品科学 2016, Vol.37, No.09 161
Key words: Arnebia euchroma (Royle) Johnst; hairy roots; secondary metabolites; elicitor; precursor
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201609030
中图分类号：Q943.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2016）09-0160-05
引文格式：
葛素囡, 张生翾, 王芳, 等. 外源物质对新疆紫草毛状根次生代谢产物含量的影响[J]. 食品科学, 2016, 37(9): 160-164.
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201609030. http://www.spkx.net.cn
GE Sunan, ZHANG Shengxuan, WANG Fang, et al. Effects of exogenous substances on the content of secondary
metabolites in Arnebia euchroma Johnst hairy roots[J]. Food Science, 2016, 37(9): 160-164. (in Chinese with English
abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201609030. http://www.spkx.net.cn
毛状根培养是获得有用次生代谢产物的重要途径之
一。近年来，培养珍贵药用植物毛状根以获取次生代谢
产物已成为研究热点。杨世海[1]、何含杰[2]、谈荣慧[3]等
分别培养决明的蒽醌类化合物、三裂叶野葛的总异黄酮
和葛根素、丹参的丹酚酸等均获成功。但利用毛状根生
产药物依然存在次生代谢产物产量低、生产成本高的问
题，因此，深入研究植物细胞中次生代谢产物合成的高
产调控机理具有重要的理论和实际意义。
诱导子被认为是提高植物细胞和组织培养中次生代
谢产物最有效的途径之一。茉莉酸可促进长春花毛状根
中吲哚生物碱的生物合成[4]。真菌诱导子可提高黄芩毛状
根中黄芩苷的含量[5]，也可影响人参毛状根中人参皂苷的
生物合成[6]。同时，随着植物次生代谢产物合成途径的
深入研究，添加前体物质也成为提高目的产物的有效手
段。苯丙氨酸是一个代谢中间体，它是合成类黄酮、苯
丙素类、香豆素类、木质素类、萘醌类等多种次生代谢
物质的前体[7]。Fettneto等[8]在红豆杉细胞培养中加入前体
物质苯丙氨酸能使紫杉醇含量提高5 倍。乙酸钠是黄酮
类化合物合成的前体物质之一，1 mmol/L乙酸钠能够促
进红豆杉细胞中紫杉烷的合成[9]。培养基中添加硝酸银和
酵母提取物对不定根中雷公藤甲素的合成具有明显的促
进作用[10]。表明多个诱导子或诱导子与前体物质共同作
用，可大大提高毛状根次生代谢产物的产量。
新疆紫草毛状根中添加真菌诱导子[11]、茉莉酸甲酯[12]、
乙烯[13-14]及Ag+[15]均可促进紫草素及其衍生物的合成，
L-苯丙氨酸对紫草细胞中紫草素的积累也有明显促进作
用[16]，但未见诱导子及前体物质的联合作用对新疆紫草
毛状根次生代谢产物含量影响的研究报道。本研究探讨
AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸钠协同作用对新疆紫草毛状
根次生代谢产物含量的影响，为深入研究紫草素合成的
代谢调控以及相关分子机制及运用细胞工程技术大量生
产紫草素及其衍生物提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新疆紫草毛状根为1号根系[17]，由新疆农业大学农学
院王芳课题组提供。
芦丁标准品 国药集团化学试剂有限公司；无水乙
醇 新疆乌市化学试剂厂；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化
钠、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、硝酸银、L-苯丙氨酸、
乙酸钠（均为分析纯） 北京化工厂。
1.2 仪器与设备
循环水式真空泵、旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器
厂；721型紫外分光光度计 上海隆拓仪器设备有限公
司；恒温水浴锅 南京科尔仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 毛状根的生长
称取 0 . 5 g生长状况良好的毛状根接种于装有
50 mL SH培养基[18]的250 mL锥形瓶中，温度25 ℃、转速
（100±10） r/min条件下暗培养30 d后，待用。
1.3.2 AgNO3处理新疆紫草毛状根
称取来自SH培养基中培养的毛状根5 g，接于M9培
养基[18]中，附加AgNO3 0、1、3、5、7 mg/L，培养30 d
后，进行成分测定。
1.3.3 AgNO3及L-苯丙氨酸联合处理新疆紫草毛状根
在1.3.2节最佳条件（5 mg/L Ag＋）基础上，将毛
状根接于M9培养基附加L-苯丙氨酸0、25、50、75、
100 mg/L的培养基中，培养30 d后进行成分测定。
1.3.4 AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸钠联合处理新疆紫草
毛状根
在1.3.3节最佳条件（5 mg/L Ag＋＋25 mg/L L-苯丙氨
酸）基础上，将毛状根接于M9培养基附加乙酸钠0、25、
50、75、100 mg/L的培养基中，培养30 d后进行成分测定。
1.3.5 总黄酮的提取及含量测定
1.3.5.1 芦丁标准对照品溶液的制备及其标准曲线回归
方程的建立
参照张桂等[19]方法。以芦丁质量浓度为横坐标，波
长为510 nm的吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，并
计算回归方程。芦丁质量浓度与吸光度的回归方程式为
y=11.227 0x＋0.005 8（R2=0.995 6）。结果表明，芦丁质
量浓度在0～0.05 mg/mL范围内，与吸光度成良好的线性
关系。
162 2016, Vol.37, No.09 食品科学 ※生物工程
1.3.5.2 供试品提取溶液的制备及样品含量测定
参照杨春霞等[20]的方法。在波长510 nm处，以空白
溶液校正基线，测定供试液的吸光度，代入回归方程，
计算样品溶液中总黄酮的含量。ᙫ哴䞞ਜ਼䟿/˄mg/g˅＝ ṧ૱ѝᙫ哴䞞䍘䟿⎃ᓖ/˄mg/mL˅h⎨ᨀ⏢〰䟺ؽᮠh⎨ᨀ⏢ᙫփ〟/mLṧ૱ᒢ䍘䟿/g  （1）
1.3.6 花青素的提取及相对含量的测定
参照Weiss等[21]的方法。以A校表示样品中花青素的相
对含量/（mg/g），样品质量为干质量。
A校=A530 nm－0.25A657 nm  （2）
1.3.7 总多酚的提取及含量测定
总多酚的提取采用水浴提取法。总多酚含量测定
采用酒石酸亚铁分光光度法，在540 nm波长处测定吸
光度（A）。ᘏ໮䜮৿䞣/%＝ × ×100Ah7.8261 000 V总V×m   （3）
式中：A为样液的吸光度；V总为供试液总量/mL；
V为吸取的供试液体积/mL；m为样品干质量/g；7.826为
吸光度为1.00时的茶多酚含量的经验值/（mg/mL）。
1.3.8 紫草素的提取及含量测定
采用中国药典中记载的测定羟基萘醌总色素的方
法测定紫草素含量[18]。具体方法：取培养一定时间的愈
伤组织适量，于50 ℃烘箱中干燥3 h，粉碎，精密称取
0.5 g，置100 mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，4 h
内不断振摇，过滤，精密吸取滤液5 mL于25 mL容量瓶
中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀。采用分光光度法在
516 nm波长处测定吸光度，按左旋紫草素（C16H16O5）的
吸收系数为242计算。㋿㤝㋴৿䞣/%＝ ×10A516 nm242   （4）
1.4 数据处理
每份样品各重复3 次提取测定。采用Microsoft Excel
和SPSS 16.0统计分析软件对数据进行处理。
2 结果与分析
2.1 AgNO3对毛状根次生代谢产物含量的影响
将毛状根接种于M9培养基中，图1、2结果显示，毛
状根中次生代谢产物的含量均随AgNO3质量浓度的增加
呈先升后降趋势，其中紫草素、总多酚及总黄酮的含量
均在AgNO3质量浓度为5 mg/L时达峰值，分别较对照提
高了5、0.3 倍和0.8 倍，而花青素的含量在AgNO3质量浓
度为3 mg/L时达峰值，较对照提高了0.4 倍。当AgNO3质
量浓度过高时，毛状根中紫草素、总多酚、总黄酮及花
青素的含量均大幅降低，表明AgNO3对毛状根次生代谢产
物的产出有一定的影响，其中AgNO3质量浓度为5 mg/L时
呈现较高的促进作用。
00.0
0.2
0.4㋿㤝㋴৿䞣/% ㋿㤝㋴৿䞣0.60.81.01.21.41.61.82.0
1 3 5 70
1
2
ᘏ໮䜮৿䞣
/%
3
4
5
6
7ᘏ໮䜮৿䞣
AgNO3䋼䞣⌧ᑺ/˄mg/L˅
图 1 AgNO3对毛状根中紫草素及总多酚含量的影响
Fig. 1 Effect of AgNO3 on the contents of shikonin and total
polyphenols in Arnebia euchroma Johnst hairy rootsᘏ咘䝂৿䞣㢅䴦㋴৿䞣
00.00
ᘏ咘䝂৿䞣/ ˄mg/g ˅ 0.050.100.150.200.250.300.350.40
1
AgNO3䋼䞣⌧ᑺ/˄mg/L˅3 5 70.00 㢅䴦㋴৿䞣 /˄ mg/g˅0.050.100.150.200.250.30
图 2 AgNO3对毛状根中总黄酮及花青素含量的影响
Fig. 2 Effect of AgNO3 on the contents of total flavonoids and
anthocyanins in Arnebia euchroma Johnst hairy roots
2.2 AgNO3及L-苯丙氨酸联合作用对毛状根次生代谢产
物含量的影响 ㍛㥹㍐ਜ਼䟿ᙫཊ䞊ਜ਼䟿
3
4
ᙫཊ䞊ਜ਼䟿
/%
5
6
7
0
1.0
1.5
2.0
2.5
25 50 75 100
L-㤟щ≘䞨䍘䟿⎃ᓖ/˄mg/L˅㍛㥹㍐ਜ਼䟿/%
图 3 AgNO3及L-苯丙氨酸联合作用对毛状根中紫草素及
总多酚含量的影响
Fig. 3 Combined effects of AgNO3 and L-phenylalanine on the contents of
shikonin and total polyphenols in Arnebia euchroma Johnst hairy roots
0 25 50
L-㤟щ≘䞨䍘䟿⎃ᓖ/˄mg/L˅75 1000.000.05 㣡䶂㍐ਜ਼䟿 /˄ mg/g˅0.100.150.200.250.300.35ᙫ哴䞞ਜ਼䟿㣡䶂㍐ਜ਼䟿0.0ᙫ哴䞞ਜ਼䟿/ ˄mg/g ˅ 0.10.20.30.40.50.60.70.8
图 4 AgNO3及L-苯丙氨酸联合作用对毛状根中总黄酮及
花青素含量的影响
Fig. 4 Combined effect of AgNO3 and L-phenylalanine on the contents of
total flavonoids and anthocyanins in Arnebia euchroma Johnst hairy roots
※生物工程 食品科学 2016, Vol.37, No.09 163
在2.1节实验结果基础上，考察L-苯丙氨酸对毛状
根次生代谢产物含量的影响，图3、4结果表明，毛状根
次生代谢产物的含量均随L-苯丙氨酸质量浓度的增加呈
先升高后降低趋势，当L-苯丙氨酸质量浓度为25 mg/L
时，紫草素、花青素及总黄酮的含量均达峰值，均显著
高于对照（P＜0.05），分别较对照提高了0.3、1.4 倍和
1.2 倍。而总多酚含量虽然并未高于对照组，但是在各个
处理中仍然含量最高。说明在AgNO3质量浓度为5 mg/L
前提下，L-苯丙氨酸为25 mg/L时，对毛状根次生代谢产
物的积累有明显促进作用，高质量浓度起抑制作用。说
明添加一定量的AgNO3及L-苯丙氨酸可协同促进毛状根
中次生代谢产物的积累。
2.3 AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸钠联合作用对毛状根次
生代谢产物含量的影响 ㋿㤝㋴৿䞣ᘏ໮䜮৿䞣
0
㋿㤝㋴৿䞣/%
1.0
1.5
2.0
2.5
50 100Э䝌䩴䋼䞣⌧ᑺ/˄mg/L˅150 2003 ᘏ໮䜮৿䞣 /%45678
图 5 AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸钠联合作用对毛状根中紫草素及
总多酚含量的影响
Fig. 5 Combined effect of AgNO3, L-phenylalanine and sodium acetate
on the contents of shikonin and total polyphenols in Arnebia euchroma
Johnst hairy Rootsᙫ哴䞞ਜ਼䟿㣡䶂㍐ਜ਼䟿
0
0.0
0.1ᙫ哴䞞ਜ਼䟿/ ˄mg/g ˅ 0.20.30.40.50.60.70.8
50҉䞨䫐䍘䟿⎃ᓖ/˄mg/L˅100 150 2000.00.51.01.52.02.53.0 㣡䶂㍐ਜ਼䟿 /˄ mg/g˅
图 6 AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸钠联合作用对毛状根中总黄酮及
花青素含量的影响
Fig. 6 Combined effect of AgNO3, L-phenylalanine and sodium acetate
on the contents of total flavonoids and anthocyanins in Arnebia euchroma
Johnst hairy roots
在2.2节实验结果基础上，考察乙酸钠对毛状根次
生代谢产物含量的影响，图5、6结果表明，在乙酸钠不
同质量浓度处理下，毛状根中总多酚和花青素的含量均
高于对照组，其中总多酚含量随着乙酸钠质量浓度增高
而增大，在乙酸钠质量浓度为50 mg/L时达到最高；花
青素的含量在乙酸钠质量浓度为200 mg/L时达到最高，
且各个质量浓度处理间存在显著差异（P＜0.01）。当
乙酸钠质量浓度为50 mg/L时紫草素含量较对照提高1 倍
（P＜0.05）。乙酸钠不同处理的毛状根中总黄酮含量均
明显低于对照（P＜0.01），说明乙酸钠抑制毛状根中
总黄酮的积累。综上所述，同时添加一定量的AgNO3、
L-苯丙氨酸及乙酸钠可协同促进新疆紫草毛状根中总多
酚、花青素和紫草素的积累，但显著抑制总黄酮的合成
积累。
3 讨 论
由于紫草素及其衍生物的合成呈非偶联型，即紫草
素及其衍生物在毛状根生长停止后才进行合成的，故新
疆紫草毛状根的培养采用二阶段培养法：第一阶段为生
长阶段，主要目的是为了提高或增加毛状根的生物学产
量，其适宜的培养基为SH[18]，第二阶段为生产阶段，主
要目的是为了促进毛状根积累紫草素及其衍生物，其适
宜的培养基为M9[18]。本研究着重考察了第二阶段即毛状
根生产阶段，AgNO3、L-苯丙氨酸、乙酸钠影响下新疆
紫草毛状根提取物中次生代谢产物的含量。
许多研究表明真菌菌丝体等或其他金属离子等诱导
剂可促进植物毛状根合成和积累次生代谢物[22-24]。尹雅乐
等[25]研究发现5 µmol/L Ag+处理能够显著促进紫草素的合
成。本研究结果表明，5 mg/L的Ag+使得新疆紫草毛状根
的紫草素及其衍生物含量提高了5 倍，结果与前人一致。
前人研究发现，L-苯丙氨酸可促进葡萄细胞中花青
素的积累[26]，苯丙氨酸前体与茉莉酸甲酯的联合作用也
可显著提高葡萄细胞中花青素含量 [27]。本研究结果表
明，添加一定量的AgNO3及L-苯丙氨酸可协同促进毛状
根中紫草素及其衍生物、总黄酮及花青素含量的提高，
进一步阐明了诱导子与前体物质的联合作用的效应。
研究表明乙酸钠作为黄酮类化合物合成的前体物
质之一可促进甘草细胞中总黄酮的合成积累 [28]，但也
有研究认为L-苯丙氨酸和乙酸钠共同使用对银杏细胞中
黄酮的合成无明显促进作用[29]。本研究中，当AgNO3质
量浓度为0 mg/L时，总黄酮含量为0.2 mg/g，当AgNO3
质量浓度为5 mg/L时，总黄酮含量为0.329 mg/g，当
5 mg/L AgNO3＋25 mg/L L-苯丙氨酸时，总黄酮含量为
0.731 mg/g，由此可见，单独添加5 mg/L AgNO3及AgNO3
与L-苯丙氨酸共同作用均有利于总黄酮的积累。但是，
同时添加一定量的AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸钠却显著
抑制总黄酮的合成积累，是否与本实验选用乙酸钠质量
浓度过高有关，有待进一步研究。
本研究明确了一定质量浓度的诱导子A g N O 3及
AgNO3和前体物质L-苯丙氨酸的联合作用均能够促进新
疆紫草毛状根次生代谢产物的积累；添加一定质量浓度
的AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸钠可协同促进毛状根中总
164 2016, Vol.37, No.09 食品科学 ※生物工程
多酚、花青素和紫草素的积累。本结果为进一步深入研
究诱导子及前体物质对新疆紫草毛状根有效成分及次生
代谢物的影响以及相关分子机制提供了理论依据和实验
基础，对工厂化生产新疆紫草毛状根有价值的药用成分
具有重要意义。
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