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Study on mechanism of precursors transforming into indigoand indirubin in blue-genera plants

"蓝"类植物中的前体物质转化为"靛"的机制探讨



全 文 :“蓝”类植物中的前体物质转化为“靛”的机制探讨
杨明1,2,刘泽玉1,苏柘僮1,邹文铨3
(1成都中医药大学,四川 成都 610000;2江西中医学院 中药现代制剂
教育部重点实验室,江西 南昌 330004;3四川大学,四川 成都 610000)
[摘要] 目的:通过查阅国内古籍和国外近代文献,介绍了“蓝”类植物的炮制品青黛从染料产业过渡到医药产业的过
程;明确了生成靛的前体物质分别为靛红烷A、靛红烷B、靛红烷C和吲哚苷;阐明了前体物质转化为靛的机制;总结了多种测
定前体物质含量的方法;为我国青黛炮制原理研究提供事实依据,为制靛工艺进入现代工业范畴奠定了基础。
[关键词] “蓝”类植物;前体物质;靛蓝;靛玉红;机制;含量测定
[收稿日期] 20090924
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30772784)
[通信作者] 杨明,教授,博士生导师,主要从事中药新制剂新技术
的研究,Tel:(028)87825696,Email:yangming16@126com
  青黛[1]为爵床科植物马蓝 Baphicacanthuscusia(Nees)
Bremek、蓼科植物蓼蓝 PolygonumtinctoriumAit或十字花
科植物菘蓝IsatisindigoticaFort的叶或茎叶经加工制得的
干燥粉末或团块,其主要有效成分靛蓝和靛玉红,其从应用
之初作为染料[26]发展成为药物[79],经历了上千年,历史十
分悠久。通过对从夏、商、周朝到清代的相关本草典籍进行
整理和分析,弄清了青黛饮片的炮制意图及其炮制演变历
史[1015];人们在对染色机制和工艺的研究及对炮制过程的探
索中,积累了丰富的实践经验。但是古书中仅对炮制工艺和
方法做了介绍,古人对其炮制过程的控制全凭经验,导致目
前各地各家都是沿用传统方法进行手工作坊式生产,以自家
经验为准,使得炮制工艺难以规范,导致生产效率低,产品成
本高,质量参差不齐,这些严重影响了青黛的产业化、规模
化。因此,只有阐明青黛的炮制原理,了解炮制过程中各个
环节的物质变化,摸清影响各环节的外界因素,才能内外兼
修,使得“蓝”类植物在炮制过程中向着可控的方向发展,以
便准确、合理的控制炮制过程。
经查阅大量文献发现,国内关于“蓝”类植物炮制原理的
文章寥寥无几,然而国外对“蓝”类植物的研究较为深入,发
现并鉴别了“蓝”类植物中产生靛的前体物质,初步阐明了其
物理化学性质,建立了多种测定前体物质含量的方法;并阐
明了前体物质转化为靛的机制,提出了影响转化的因素;这
些信息为研究传统的炮制原理提供了依据。
1 靛的概述
靛蓝作为
$
色色素,自古以来以染料的形式被人们所关
注,尤其因牛仔布的风靡而在全世界被再次广泛应用[16]。
靛蓝来源于“蓝”类植物———亚洲的 Bcusia,欧洲的 woad
(Itinctoria),热带地区的Indigoferaspp和远东的Ptincto
rium。中国古代已有其相关记载,《说文·草部》中明确指
出“蓝,染青草也”;春秋战国时代的荀子在《劝学篇》中提
到:“青,取于蓝,而青于蓝”,就是说“青”是由“蓝”制得,即
蓝可染青。其中,“青”是指印染中染制的青色,是由靛蓝染
制的颜色;“蓝”则指制取靛蓝的蓝草。与此同时,在欧洲的
远古时代[17],Itinctoria(菘蓝属)是以染料原料和草药的形
式存在的,自12~17世纪其被作为生产靛蓝的原料而被广泛
种植。
近年来,经证实菘蓝属植物叶子提取物中亲脂类物质具
有抗炎作用[18],例如活性成分色胺酮,其能潜在的抑制前列
腺素和白细胞三烯的合成;靛蓝[1819]具有抗菌、消炎的作用;
靛玉红[1819]具有抗癌作用,近年来被用于治疗慢性粒细胞白
血病。鉴于其显著的药理作用,如何炮制“蓝”类植物得到高
产量、高纯度的靛(靛蓝和靛玉红)引起了科研人员的思索。
另外,2005年版《中国药典》[1]中青黛含量测定项下规定了
靛蓝、靛玉红的质量分数分别不得少于20%,013%,此标
准为控制青黛的质量提供了一定的依据和保障。
2 靛的前体物质
21 前体物质的鉴定历程
“靛”是“蓝”类植物中次生代谢的产物,原植物中无其
原形,以前体物质的形式存在于叶中。早在19世纪初期,国
外已开始对前体物质的属性进行研究,但是直到最近,这些
化合物的属性才被阐明。Epstein等描述主要的前体物
质———靛红烷 B为吲哚酚5酮葡萄糖酸酯(indoxyl5keto
gluconate);Stoker等研究了 Itinctoria(菘蓝属)生成靛蓝的
工艺,假设靛红烷B是酯的正确性;StrobelandGroger,Gilbert
等确定了Itinctoria(菘蓝属)中含量相对较少的另一种前体
物质吲哚苷;Maugard等声明靛红烷 C[17]的存在,但是未提
出其明确的化学结构。ChristineOberthur证明了 Itinctoria
(菘蓝属)中主要的吲哚酚葡萄糖苷为靛红烷A[indoxyl3O
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(6′OmalonylβDribohexo3ulopyranoside)][17]。总 而 言
之,目前经研究发现的靛蓝的前体物质为:靛红烷 A,靛红烷
B,靛红烷C和吲哚苷。
22 前体物质转化为靛的过程
221 前体物质的转化机制
靛蓝的生成:前体物质转化为靛蓝的过程为(图1)叶子
浸泡于温水中,酯类(靛红烷B)在加碱的情况下,苷类(吲哚
苷)在内源酶酶解作用下,碳水化合物部分与吲哚酚(indox
yl)分离,吲哚酚阴离子在氧气存在的条件下生成吲哚酚自
由基,1分子吲哚酚自由基与1分子吲哚酚缩合成1分子无
色靛蓝(也称靛白)(lecuoindigo,离子态),其在氧气存在的
情况下形成蓝色靛蓝(indigo)。由于其难溶于水,故悬浮于
水溶液中。
靛玉红的生成:前体物质转化为靛玉红的过程为(图
1):自靛红烷(isatans)溶出至吲哚酚自由基的生成过程同靛
蓝,吲哚酚自由基进一步氧化成为吲哚满二酮(isatin),1分
子吲哚满二酮与1分子吲哚酚形成靛玉红,生成的靛玉红悬
浮于水溶液中。
图1 前体物质形成靛蓝的过程
根据用途选择性的产靛:在染色过程中,靛玉红对靛蓝
不起协同作用,并影响靛蓝青色色调的纯净,因此靛玉红作
为副产物而存在,应控制条件减少其生成。但是现代药理研
究表明,靛玉红具有抗癌作用,近年来被用于治疗慢性粒细
胞白血病;同时,靛蓝也具有抗炎、杀菌的作用。因此,若是
控制反应过程中的某些条件,那么产物将根据用途生成不同
结构的靛。此将完全改变原生产目的,切实的从染料产业过
渡到医药产业,从而通过调节某些因素,按着最终用途选择
性的控制产物的生成,真正达到满足市场需求的目的。
222 影响前体物质转化为靛的因素
2221 温度 靛红烷 B在加热和干燥的过程中很不稳
定,易氧化缩合为靛,很难从吲哚苷中分离出来单独定量分
析。前体物质的减少就意味着靛产率的降低,此发现与传统
生产中使用鲜叶以获得高产量靛蓝的结论相一致。故鲜叶
收获后的前处理对产靛也起着举足轻重的作用。
2222 碱性环境 经证实,靛红烷 B属于酯类,碱性条件
下易水解。吲哚苷属于苷类,碱性条件下较稳定,其在内源
酶的作用下发生水解反应。此性质合理的解释了中国古代
染色技术的关键环节。中国古代,早期的染色技术可能仅限
于用碱水浸泡菘蓝获取靛质,而蓼蓝则用于浸揉“染碧”。如
唐代苏敬在《新修本草》中云:“……今并堪染,菘蓝为淀,惟
堪染青;其蓼蓝不堪为淀,惟作碧色尔”。宋代寇宗在《本
草衍义》中云:“蓼蓝即堪揉汁染翠碧”。国外研究表明,菘
蓝属中含有靛红烷 B,吲哚苷等前体物质,而蓼属中仅含有
吲哚苷,菘蓝属用碱水浸泡,而蓼属中吲哚苷在内源酶的作
用下水解无需碱环境。因此,古人已从实践经验中提示了菘
蓝前提物质转化成靛的外界要素碱性环境。
2223 氧化环境 由成靛机制可知:吲哚酚自由基的生
成由原浸泡液中的溶解氧供氧即可,但是进一步氧化生成的
吲哚满二酮则需要外界额外供氧。因此,体系 pH的控制与
酶解时通氧与否是使反应生成何种靛的关键。若使产靛向
着靛玉红方向进行,则在酶解过程中,通过通氧气、调高 pH
等手段促进吲哚满二酮的生成,若向着靛蓝方向进行,则应
在酶解过程中控制氧气含量和体系 pH,防止吲哚满二酮的
生成,故体系含氧量和pH与生成何种靛密切相关。
传统青黛生产过程中,打靛环节加入石灰乳后,通过人
工搅拌提高溶液中氧气含量,促进靛的氧化缩合,此操作缺
乏科学性、规范性。大生产中可以通过空气压缩机和转子流
量计等设备控制通氧量,通过pH计控制打靛的碱性环境,使
得各个参数量化,增加了操作的合理性。从而,将青黛的炮
制过程切实由传统的经验值转化为产业化的可控值。
23 前体物质含量测定概述及其变化规律
据前所述,前体物质靛红烷 B、中间产物吲哚酚、靛白都
很不稳定,十分活跃。国内除了于萍,刘庆华等[20]比较了不
同产地、不同采收时期大青叶中吲哚苷的含量外尚无该方面
的研究报道。因此,定量测定前体物质(靛红烷 A,靛红烷
B,靛红烷C和吲哚苷)和靛蓝形成过程中出现或消失的中
间体(吲哚酚,吲哚满二酮)有一定的难度。
据国外文献报道,靛的前体物质的定性和定量方法有
RPHPLC,LCMS,HPLCELSD,密度计法[17],荧光光谱法等。
ThieryMaugard[21]等应用 HPLCUV/MS法联用技术鉴
别并定量了前体物质(靛红烷 B,靛红烷 C)。KeryGGil
bert,HamishGMaule[22]等建立了HPLCELSD法首次定量测
定了菘蓝属植物中的前体物质(靛红烷 B,吲哚苷),并通过
另外的色谱光谱法和衍生化技术测定靛蓝总含量,结果与该
法保持一致,证明了该法稳定,可行。TetsuoKokubun[23]等通
过测定前体物质释放出的吲哚酚与绕丹宁形成的红色化合
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物来间接定量分析 Itinctoria中前体物质(靛红烷 B,吲哚
苷)。ChristineOberthur[17]等建立了定量的密度计法首次同
时测定了靛红烷A,靛红烷 B和吲哚苷的含量,并证实了其
有效性。该法通过 HPTLC分离其前体物质,硅胶板经稀酸
或稀碱处理后用密度计分析生成的靛蓝类染料。Paulina
GarciaMacias[16]等应用N甲基2吡咯烷酮作为溶剂测定靛
蓝的含量,并应用一种新方法———荧光光谱法测定中间产物
吲哚酚,实验表明其在靛蓝的形成过程中能稳定存在几分
钟,此法用于检测天然靛蓝的纯度。
ThieryMaugard等发现在Itinctoria中靛红烷B从4月
份即可被检出,而吲哚苷和靛红烷C6月末才能被检出并定
量;KeryGGilbert,HamishGMaule等分析了2种属中的前
体物质,结果表明Polygonum中仅含有吲哚苷,而Ispp中含
有靛红烷B和吲哚苷;TetsuoKokubun试验中发现,吲哚酚衍
生物在鲜叶与陈叶(叶干重)中的比例分别为 24%,14%。
前体物质在同一片叶中各部位分布无显著性差异,但是叶与
叶间的含量存在差异;ChristineOberthur等研究了5种菘蓝
叶在第一年栽培期中靛红烷A随季节变化而变化的情况,同
时发现了收获后冻干,室温干燥和40℃干燥不同的处理对
前体物质含量的影响很大。
以上研究成果表明:前体物质的含量取决于栽培品种和
收获时节;各前体物质的含量与温度密切相关。那么,如何
利用上述含量测定方法及科研成果指导现代产靛工艺的改
进,从内在物质变化来控制整个工艺过程,最终获得高产量、
高纯度的靛蓝和靛玉红值得科研人员深思。
3 展望
目前,多种方法已用于靛蓝生成过程中前体物质或者
中间体的鉴别或含量测定,为阐明生产过程中各物质变
化提供了一定依据,但是仍存在某些亟待解决的问题:笔
者预期设计试验通过调节温度、pH、氧气通量、浸泡时间
等因素生成高纯度的靛蓝或者高含量的靛玉红;通过熟
悉各前体物质的性质,从溶液中分离并纯化出前体物质;
寻求到一种更为简便、快速、准确的含量测定方法同时测
定前体物质等等。只有解决了以上一系列问题,才能阐
明生产工艺各环节中物质变化机制,从而实现染料产品
的高纯化和医药产品的高效力,最终达到提高产率及其
纯度,节约能源,保护环境的目的;同时,为制靛工艺进入
现代工业范畴奠定了基础。
本研究较为全面的介绍了“蓝”类植物、靛及其之间的相
互关系,有助于科研工作者清楚的了解青黛炮制历史沿革,
以及目前对“蓝”类植物的研究水平,为进一步设计试验研究
青黛炮制机制提供了科学依据。
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andindirubininbluegeneraplants
YANGMing1,LIUZeyu1,SUZhetong1,ZOUWenquan2
(1ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610000,China;
2SichuanUniversity,Chengdu610000,China)
[Abstract] Accessedtoliteraturesathomeandabroad,weintroducedtheprocessofindigonaturalistransformingfromdyestuf
industryintopharmaceuticalindustryItisafirmedthattheprecursorsofindigoandindirubinareisatanA,isatanB,isatanCandin
dicantMeanwhile,authorclarifiedthemechanismoftransformationfortheseprecursorstransformingintoindigoandindirubinAndwe
summarizedmethodsofdeterminationfortheseprecursorsInsummary,thesereferencesprovideusaccordanceofstudyonprocessing
principleofIndigonaturalis,andlaythefoundationfortechnicsofmakingindigoandindirubinenteringintomodernindustry
[Keywords] bluegeneraplants;precursors;indigo;indirubin;mechanism;determination
doi:10.4268/cjcmm20100728
[责任编辑 周驰]
2010海峡两岸暨CSNR全国第九届天然药物资源学术研讨会通知(第一轮)
2010海峡两岸暨CSNR全国第九届天然药物资源学术研讨会拟定于2010年7月17—20日在广东省广州市召开,会期3
天。本届学术研讨会由CSNR天然药物资源专业委员会、中国药材GAP研究促进会(香港)、广东省人民政府、化州市人民政
府主办,广东绿色生命集团承办。现在开始进行学术研讨会报名和学术论文征集工作。会议的具体事项将在第2轮通知中发
出。欢迎踊跃报名参加本次会议!
1 时间 2010年7月17—20日。研讨会报名截止时间2010年5月30日;论文及论文摘要提交截止时间2010年6月1日。
2 地点 会议地点为广东省广州市,专题研讨及考察为广东省化州市。
3 主题 产学研合作,推进我国中药及天然药物资源健康发展。
4 交流研讨内容 中药及天然药物资源调查与研究;中药材规范化生产(GAP)与产业化发展;中药及天然药物资源化学研
究与综合利用;生物多样性与珍稀濒危野生药用动植物资源的积极保护;中药及天然药物资源学科建设与人才培养。
5 组织形式 ①学术研讨会开幕式和大会特邀报告,届时将邀请我国中药及天然药物资源科学领域院士、著名专家和主管
部门领导到会并作学术报告。②分会场学术交流(初步确定中药资源调查与研究、中药材规范化生产(GAP)与产业化发展、
中药及天然药物资源化学研究与综合利用三个分会场,具体将根据代表到会和论文征集情况予以调整)。③大会期间组织赴
化州中药材GAP基地考察,具体路线第2轮通知再具体说明。④本届年会将出版《第九届全国天然药物资源学术研讨会论文
集》,请按要求撰写论文和投稿。并邀请相关杂志编辑参会。⑤中国自然资源学会(htp://wwwcsnrorg/)、《中国中药杂
志》、《中药材》、《中草药》、《中国现代中药》、《现代中药研究与实践》等杂志上将公布本届学术研讨会的消息,与会者可以在
报名和投稿有效期内,复印或下载相关表格,并按照要求办理报名和投稿手续。⑥参加会议通知及报到事宜将在第2轮通知
中告知。⑦会议期间将召开中国药材GAP研究促进会第三次扩大理事会,请理事、理事单位准时参会,不另行文。
6 会议论文征集 会议论文可围绕主题和交流研讨内容,具体内容包括前瞻性综述,学科现状、前沿及展望,系统性研究成
果,原创性研究工作等。拟参加会议者(不提供论文也可参加会议),请于2010年6月1日前提交论文及摘要。
请向会议提供Word软件录入的论文电子版。并同时提供论文打印稿1份,请打印在A4纸上,上下各空3cm,左右空22cm,
用激光打印机输出。
7 联系方法 江苏省南京仙林大学城仙林大道138号(南京中医药大学药学院 CSNR天然药物资源专业委员会办公室),邮
码:210046,电话:02585811514/85811519,传真:02585811524,联系人:单鸣秋 15951802806,严辉 13512537853,电子信箱:
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