全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2016)07 － 1719 － 05 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2016． 07． 039
收稿日期:2015 － 10 － 13
基金项目:国家自然科学基金“花榈木根瘤菌多样性及幼苗形
成调控因素研究”(31460193) ;贵州省国际合作项目“珍贵用材
树种花榈木精准化容器育苗理论与技术研究”［G 字(2012)
7012］;贵州省林业厅重大攻关“贵州优质阔叶用材树种培育技
术与示范”［黔林科合(2010)重大 02 号］;贵州大学研究生创新
基金“组培过程中不同家系花榈木的影响探究”(贵大研农
2015003) ;贵州大学 SＲT项目“花榈木组织培养外植体的灭菌
技术探讨”［贵大 SＲT字(2014)113 号］
作者简介:乔 栋(1991 －) ，男，在读硕士，研究方向:林木植物
组织培养，E-mail:610064918@ 163． com，* 为通讯作者。
珍稀树种花榈木组培不同外植体的无菌繁殖体系构建
乔 栋，韦小丽* ，李 群
(贵州大学 林学院，贵阳 贵州 550025)
摘 要:为构建花榈木组织培养的无菌繁殖体系，采用随机区组试验方法研究不同药剂组合对其籽苗茎段、幼苗茎段和叶片、成年
植株茎段和嫩叶等外植体的消毒效果。结果表明:籽苗茎段以 70 %乙醇消毒 30 s + 0． 1 %升汞灭菌 8 min +培养基中添加 PPM 0．
5 mL /L的消毒效果最好;幼苗外植体最佳采集时间为 4 月，茎段用 70 %乙醇浸泡 30 s +(50 mg /L利福平 + 50 mg /L氯霉素)混合
液浸泡 30 min + 0． 1 %升汞浸泡 8 min消毒效果最好，叶片用 70 %乙醇浸泡 30 s +(50 mg /L利福平 + 50 mg /L氯霉素)混合液浸
泡 30 min + 0． 1 %升汞浸泡 6 min消毒效果最好;成年植株叶片以 4 月采集较好，最佳消毒方法为 70 %乙醇浸泡 30 s +(50 mg /L
利福平 + 50 mg /L氯霉素)混合液浸泡 30 min + 0． 1 %升汞浸泡 12 min，成年植株茎段尚未取得理想消毒效果。
关键词:花榈木;外植体;消毒方法
中图分类号:S792． 99;Q813． 1 + 2 文献标识码:A
Establishment of Sterile Propagation System of Different Explant for
Ｒare Species Ormosia henryi in Tissue Culture
QIAO Dong，WEI Xiao-li* ，LI Qun
(Forest College，Guizhou University，Guizhou Guiyang 550025，China)
Abstract:In order to establish the sterile system of O． henryi for tissue culture，stem segment of ten days seedling，leaf and stem segment of
seedling and adult tree were used to study the sterilization effects of different combination of reagent on the tissue culture through a random
block experiment． Ｒesults:70 % alcohol soak 30 s + 0． 1 % HgCl2 soak 8 minutes + PPM 0． 5 mL /L have the best sterilization effect for
stem segment of ten days seedling． The optimum collecting time of seedling explant is April，the optimum sterilization method of leaf for
seedling and stem segment for seedling are 70 % alcohol soak 30 s +(50 mg /L Ｒifampicin + 50 mg /L Chloramphennicol)+ 0． 1 % HgCl2
soak 6 minutes and 70 % alcohol soak 30 s +(50 mg /L Ｒifampicin + 50 mg /L Chloramphennicol)+ 0． 1 % HgCl2 soak 8 minutes． The op-
timum collecting time of leaf explant for adult tree is April，and the best sterilization method is 70 % alcohol soak 30 s +(50 mg /L Ｒifampi-
cin + 50 mg /L Chloramphennicol)+ 0． 1 % HgCl2 soak 12 minutes，but the stem segment of adult tree has not achieved optimum steriliza-
tion effect．
Key words:Ormosia henryi;Explant;Sterilization method
花榈木(Ormosia henryi Prain)为豆科(Legu-
minosae)红豆属(Ormosia)常绿乔木，又名花梨木，
属国家二级重点保护植物和珍贵用材树种［1］。由
于花榈木野生植株稀少，结实困难，结实率及种子繁
殖系数低［2］，因而建立花榈木组织培养快繁体系、
扩大其繁殖系数对保护花榈木野生资源，提高人工
培育种苗的繁殖效率具有重要意义。
有关花榈木组织培养技术的相关研究已有文献
报道。姚军等［3］采用花榈木种子无菌萌发获得的
带叶茎段进行组织培养研究;高丽等［4］采用花榈木
种子无菌萌发获得的胚轴进行组织培养及后续的耐
冷性诱导。然而，目前已有研究采用的外植体均来
源于种子无菌萌发材料，尚未见有关采用花榈木自
然萌发植株和成年植株外植体进行组培的报道，在
繁殖材料方面存在局限性。其原因可能是自然萌发
9171
2016 年 29 卷 7 期
Vol. 29 No. 7
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
植株和成年植株外植体内生菌多，无菌培养体系建
立困难［5 － 8］。为此，笔者以自然条件下生长的花榈
木植株的籽苗茎段、幼苗茎段和嫩叶、成年植株茎段
和嫩叶作外植体，采用随机区组试验方法研究各消
毒剂不同消毒时间组合对花榈木不同外植体的消毒
效果，旨在寻求花榈木不同外植体的有效消毒方法，
扩大组织培养外植体的来源，为花榈木组织培养中
无菌繁殖体系的建立提供依据。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
1． 1． 1 外植体 花榈木籽苗茎段、幼苗茎段和叶
片、成年植株茎段和嫩叶，其中籽苗茎段来源于气候
箱内播种萌发 10 d 的花榈木籽苗，剪取 3 cm 长茎
段(带顶芽)做外植体;幼苗外植体取自贵州大学苗
圃当年生播种苗，分别于 4、8 和 12 月剪取带顶芽长
约 6 cm的茎段(带 1 ～ 2 个侧芽，不带叶片)作为外
植体;成年植株外植体取自贵州大学苗圃 7 年生及
农场 20 年生花榈木带顶芽枝条，分别于 4、8 和 12
月剪取当年生长约 20 cm 半木质化枝条进行试验。
将各种茎段剪成 1． 5 cm长带顶芽或带侧芽茎段(不
带叶片) ，将幼苗和成年植株茎段上的当年生叶片
切成 1 cm ×1 cm大小作为外植体。
1． 1． 2 试剂 植物组培抗菌剂(PPM)、利福平、链
霉素和氯霉素，美国 Phytotech 公司生产，购自北京
西美杰公司。启动培养基自制，配方为 MS + 6-BA
2． 0 mg /L + NAA 1． 0 mg /L +琼脂 8 g /L +蔗糖 30
g /L，pH 5． 8 ～ 6． 0。
1． 1． 3 仪器与设备 LDZX-50E 高压灭菌锅，SW-
CJ-1D单人超净工作台。
1． 2 方法
1． 2． 1 材料预处理 分别将采集的籽苗外植体、幼
苗外植体和成年植株外植体用洗涤剂浸泡 15 min、
30 min和 1 h，然后在流水下分别冲洗 30 min、1 h和
2 h，并用牙刷轻轻刷洗，成年植株外植体需去除表
面绒毛。之后所有材料在超净工作台内用 70 %乙
醇浸泡 30 s，用无菌水冲洗 2 ～ 3 次后备用。
1． 2． 2 试验设计 试验设 16 个处理(表 1)。供试
材料分别按表 1 进行消毒并用无菌水冲洗 4 ～ 5 次
后接种到启动培养基中，每个处理接种 15 瓶，每瓶
接种外植体 1 个。接种后置(25 ± 2)℃、光照强度 3
000 lx下培养，光照时间 12 h /d条件下培养。
1． 2． 3 测定内容 接种后每天观察、记录材料污染
情况，并统计污染率、存活率、诱导率和灭菌有效值。
污染率 =(污染数 /接种数)× 100%
存活率 =(存活数 /接种数)× 100%
诱导率 =(成功诱导数 /存活数)× 100%
灭菌有效值 =(1 －污染率)×成活率 ×诱导率
× 100%
1． 3 数据统计与分析
采用 Excel 2007 进行数据的统计与分析。
2 结果与分析
2． 1 籽苗茎段的消毒效果
由表 2 可知，以籽苗茎段为外植体的各处理中，
处理 3 和处理 4 的污染率低，灭菌有效值为 44． 45
表 1 花榈木不同外植体的消毒方法
Table 1 Sterilization methods of different explants of O． henryi
处理
Treatment
外植体
Explant
消毒方法
Sterilization method
1 籽苗茎段 0． 1 %升汞浸泡 6 min
2 0． 1 %升汞浸泡 6 min + 70 %乙醇浸泡 30 s
3 0． 1 %升汞浸泡 8 min + 70 %乙醇浸泡 30 s
4 0． 1 %升汞浸泡 8 min + 70 %乙醇浸泡 30 s +培养基中添加 PPM 0． 5 mL /L
5 成年植株叶片及茎段 0． 1 %升汞浸泡 12 min
6 0． 1 %升汞浸泡 12 min +培养基中添加 PPM 0． 5 mL /L
7 (100 mg /L苯菌灵 + 100 mg /L链霉素)混合液浸泡 30 min + 0． 1 %升汞浸泡 12 min
8 (50 mg /L利福平 + 50 mg /L氯霉素)混合液浸泡 30 min + 0． 1 %升汞浸泡 12 min
9 幼苗叶片及茎段 0． 1 %升汞浸泡 10 min
10 0． 1 %升汞浸泡 6 min +培养基中添加 PPM 0． 5 mL /L
11 (100 mg /L苯菌灵 + 100 mg /L链霉素)混合液浸泡 30 min + 0． 1 %升汞浸泡 6 min
12 (100 mg /L苯菌灵 + 100 mg /L链霉素)混合液浸泡 30 min + 0． 1 %升汞浸泡 8 min
13 (100 mg /L苯菌灵 + 100 mg /L链霉素)混合液浸泡 30 min + 0． 1 %升汞浸泡 10 min
14 (50 mg /L利福平 + 50 mg /L氯霉素)混合液浸泡 30 min + 0． 1 %升汞浸泡 6 min
15 (50 mg /L利福平 + 50 mg /L氯霉素)混合液浸泡 30 min + 0． 1 %升汞浸泡 8 min
16 (50 mg /L利福平 + 50 mg /L氯霉素)混合液浸泡 30 min + 0． 1 %升汞浸泡 10 min
0271 西 南 农 业 学 报 29 卷
表 2 不同处理花榈木籽苗茎段的消毒效果
Table 2 Sterilization effect of stem segment for ten days seedling of O． henryi (%)
处理
Treatment
污染率
Contamination
rate
存活率
Survival rate
诱导率
Induction rate
灭菌有效值
Sterilization rate
1 93． 33 6． 67 100 0． 44
2 60． 00 40． 00 100 16． 00
3 33． 33 66． 67 100 44． 45
4 6． 67 93． 33 100 87． 10
% ～87． 10 %;处理 3 消毒效果优于处理 2;培养基
中添加 PPM的处理 4 其外植体的污染率显著降低，
仅为 6． 67 %，存活率显著提高，达 93． 33 %，比未添
加 PPM的处理 3 提高 26． 66 %。因此，对籽苗茎段
而言，用70% 乙醇浸泡30 s + 0 ． 1 % 升汞浸泡8
min + PPM消毒效果最好。
2． 2 幼苗外植体的消毒效果
2． 2． 1 叶片 从表 3 可知，以幼苗叶片为外植体，4
月采集的幼苗叶片，污染率和存活率相对较低，为 0
～ 40 %;诱导率(处理 13 和处理 16 除外)较高，为
50 % ～100 %;8 和 12 月采集的叶片，尽管存活率
高，为 70 % ～100 %，但诱导率均为 0。用(100 mg /
L苯菌灵 + 100 mg /L 链霉素)混合液浸泡 30 min
(处理 11 ～ 13)与(50 mg /L 利福平 + 50 mg /L 氯霉
素)混合液浸泡 30 min(处理 14 ～ 16)均能有效降低
4 月采集幼苗叶片的污染率，其污染率均为 0，低于
处理 9 和处理 10，但其存活率降低。处理 11 ～ 16
抗菌素用量产生的效果差异不明显，外植体存活率
和诱导率均随升汞处理时间增加而降低，其中以处
理 14 的消毒效果最好，存活率和诱导率分别为 33．
33 %和 60 %，灭菌有效值达 19． 99 %。因此，4 月
采集的幼苗叶片外植体最佳处理方式为 70 %乙醇
浸泡 30 s +(50 mg /L利福平 + 50 mg /L 氯霉素)混
合液浸泡 30 min + 0． 1 %升汞浸泡 6 min。
2． 2． 2 茎段 从表 3 还可知，不同时期采集茎段的
污染率(处理 9 除外)依次为 4 月 ＞ 8 月 ＞ 12 月，但
表 3 不同处理花榈木当年生幼苗叶片和茎段的消毒效果
Table 3 Sterilization effect of leaf and stem segment for seedling (%)
处理
Treatment
污染率
Contamination rate
存活率
Survival rate
诱导率
Induction rate
灭菌有效值
Sterilization rate
4 月 8 月 12 月 4 月 8 月 12 月 4 月 8 月 12 月 4 月 8 月 12 月
叶片 Leaf
9 6． 67 20． 00 6． 67 33． 33 80． 00 93． 33 50． 00 0． 00 0． 00 15． 55 0． 00 0． 00
10 40． 00 0． 00 0． 00 40． 00 100． 00 100． 00 66． 67 0． 00 0． 00 16． 00 0． 00 0． 00
11 0． 00 26． 67 0． 00 26． 67 73． 33 100． 00 50． 00 0． 00 0． 00 13． 34 0． 00 0． 00
12 0． 00 13． 33 13． 33 20． 00 86． 67 86． 67 100． 00 0． 00 0． 00 20． 00 0． 00 0． 00
13 0． 00 0． 00 0． 00 6． 67 100． 00 100． 00 0． 00 0． 00 0． 00 0． 00 0． 00 0． 00
14 0． 00 20． 00 6． 67 33． 33 80． 00 93． 33 60． 00 0． 00 0． 00 19． 99 0． 00 0． 00
15 0． 00 6． 67 0． 00 13． 33 93． 33 100． 00 50． 00 0． 00 0． 00 6． 67 0． 00 0． 00
16 0． 00 6． 67 0． 00 0． 00 86． 67 100． 00 0． 00 0． 00 0． 00 0． 00 0． 00 0． 00
平均值
Mean 5． 83 11． 67 3． 33 21． 67 87． 50 96． 67 47． 08 0． 00 0． 00 － － －
茎段 Stem segment
9 6． 67 20． 00 33． 33 53． 33 80． 00 66． 67 62． 5 50． 00 50． 00 31． 11 32． 00 22． 22
10 20． 00 13． 33 6． 67 66． 67 86． 67 93． 33 72． 73 53． 85 42． 86 38． 79 40． 45 37． 33
11 40． 00 20． 00 26． 67 40． 00 80． 00 66． 67 66． 67 58． 33 60． 00 16． 01 37． 33 29． 33
12 26． 67 20． 00 13． 33 26． 67 53． 33 86． 67 50． 00 42． 86 84． 62 9． 78 18． 29 63． 56
13 13． 33 13． 33 6． 67 33． 33 80． 00 86． 67 60． 00 58． 33 46． 15 17． 33 40． 44 37． 33
14 33． 33 20． 00 6． 67 26． 67 73． 33 93． 33 100 63． 64 71． 42 17． 78 37． 33 62． 21
15 20． 00 13． 33 0． 00 33． 33 86． 67 100． 00 80． 00 61． 54 64． 29 21． 33 46． 23 64． 29
16 13． 33 6． 67 6． 67 26． 67 93． 33 93． 33 75． 00 57． 14 50． 00 17． 33 49． 78 43． 55
平均值 Mean 21． 67 15． 83 12． 50 38． 33 79． 17 85． 83 70． 86 55． 71 58． 67 － － －
12717 期 乔 栋等:珍稀树种花榈木组培不同外植体的无菌繁殖体系构建
表 4 不同处理花榈木成年植株叶片和茎段的消毒效果
Table 4 Sterilization effect of leaf and stem segment for adult tree (%)
处理
Treatment
污染率
Contamination rate
存活率
Survival rate
诱导率
Induction rate
灭菌有效值
Sterilization rate
4 月 8 月 12 月 4 月 8 月 12 月 4 月 8 月 12 月 4 月 8 月 12 月
叶片 Leaf
5 100 100 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 80 100 86． 67 20 0 13． 33 66． 67 0 0 2． 67 0 0
7 86． 67 100 86． 67 13． 33 0 13． 33 100 0 0 1． 78 0 0
8 66． 67 86． 67 86． 67 33． 33 13． 33 13． 33 80 0 0 8． 89 0 0
平均值 Mean 83． 34 96． 67 90． 01 25 25 28． 34 61． 67 0 0 — — —
茎段 Stem segment
5 100 100 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 86． 67 100 100 13． 33 0 0 100 0 0 1． 78 0 0
7 100 100 66． 67 0 0 33． 33 0 0 20 0 0 2． 22
8 100 100 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0
平均值 Mean 96． 67 100 91． 67 3． 33 0 8． 33 25 0 5 — — —
大多数消毒处理的污染率差异不明显，处理 9 ～ 16
的污染率平均值比较接近。与叶片消毒相比，处理
9 ～ 16 的消毒方法均可对茎段产生较好效果。说
明，幼苗茎段外植体对取材时间没有叶片要求严格。
外植体存活率(处理 11 除外)则表现为 12 月 ＞ 8 月
＞ 4 月。可能与 4 月幼苗茎段较幼嫩有关。诱导率
以 4 月最高，平均诱导率为 70． 86 %，12 月次之，平
均诱导率为 58． 67 %，8 月最低，平均诱导率为 55．
71 %。外植体存活率和诱导率均随升汞处理时间
增加而降低。从灭菌有效值看，各月采集的材料以
处理 9、处理 10 和处理 15 的效果较好。但需要注
意的是，虽然 8 月及 12 月的外植体材料灭菌有效值
高于 4 月，但外植体诱导产生的愈伤组织较少且容
易褐化。因此，建议 4 月采集的茎段用处理 10 消
毒，即 70 %乙醇浸泡 30 s + 0． 1 %升汞浸泡 6 min
+培养基中添加 PPM;8 月和 12 月采集的茎段用处
理 15 消毒，即用 70 %乙醇浸泡 30 s +(50 mg /L利
福平 + 50 mg /L 氯霉素)混合液浸泡 30 min + 0． 1
%升汞浸泡 8 min消毒。
2． 3 成年植株外植体
2． 3． 1 叶片 从表 4 可知，不同时期采集的成年植
株外植体其污染率依次为 8 月 ＞ 12 月 ＞ 4 月，8 月
的叶片带菌多，灭菌困难。与幼苗叶片相比，成年植
株叶片消毒困难，即使是 4 月采集的叶片外植体，污
染率也在 60 %以上，培养基中添加 PPM 0． 5 mL /L
的灭菌效果仍然很差。处理 5 ～ 9 以处理 8 的灭菌
效果较好，添加抗菌剂处理后，其污染率为 66． 67
%，存活率为 33． 33 %，诱导率为 80 %，灭菌有效值
为 8． 89 %。因此，用成年植株叶片外植体，以 4 月
采集为宜，其最佳消毒及诱导处理方式为 70 %乙醇
浸泡 30 s +(50 mg /L利福平 + 50 mg /L 氯霉素)混
合液浸泡 30 min + 0． 1 %升汞浸泡 12 min。
2． 3． 2 茎段 从表 4 还可知，成年植株茎段外植体
消毒比其叶片更困难。其中，4 和 12 月采集的茎段
相对带菌较少，其污染率低于 60 %，8 月的带菌最
多，无论哪种灭菌处理均全部污染。成年植株茎段
消毒效果以 12 月采集茎段用处理 7 消毒的灭菌效
果较好，污染率为 63． 67 %，存活率为 33． 33 %。但
从诱导率看，以 4 月采集茎段采用处理 6(在培养基
中添加 PPM 0． 5 mL /L)消毒的灭菌效果较好，诱导
率达 100 %。从灭菌有效值看，处理 6 和处理 7 的
灭菌效果均较差。
3 结论与讨论
在植物组织培养过程中，无菌培养体系的建立
是获得组培苗的重要环节。该试验结果表明，籽苗
外植体以 70 %乙醇消毒 30 s + 0． 1 %升汞灭菌 8
min + 70 %乙醇消毒 30 s +培养基中添加 PPM 0． 5
mL /L的消毒效果最好;幼苗外植体以 4 月采集较
好，其幼苗茎段用 70 %乙醇浸泡 30 s +(50 mg /L
利福平 + 50 mg /L氯霉素)混合液浸泡 30 min + 0． 1
%升汞浸泡 8 min的消毒效果最好，幼苗叶片用 70
%乙醇浸泡 30 s +(50 mg /L利福平 + 50 mg /L氯霉
素)混合液浸泡 30 min + 0． 1 %升汞浸泡 6 min消毒
效果最好。成年植株叶片外植体以 4 月采集较好，
最佳消毒方法为 70 %乙醇浸泡 30 s +(50 mg /L利
2271 西 南 农 业 学 报 29 卷
福平 + 50 mg /L 氯霉素)混合液浸泡 30 min + 0． 1
%升汞浸泡 12 min。
研究发现，采用抗菌剂(50 mg /L 利福平 + 50
mg /L氯霉素)混合液及(100 mg /L 苯菌灵 + 100
mg /L链霉素)混合液浸泡对花榈木幼苗叶片、茎段
和成年植株叶片消毒均能起到较好的灭菌效果，污
染率较低，其成活率和诱导率均较高。
在培养基中添加 PPM 只在籽苗茎段灭菌中具
有良好效果，对于幼苗及成年植株叶片和茎段的灭
菌效果并不显著。在植物组织培养中使用抗菌剂成
本较高，应谨慎考虑其适用范围。
不同取材部位及取材时间对外植体的消毒难易
程度有极大影响［9 － 13］。取材时间对多数植物的组
织培养都有一定的影响［14 － 17］。该研究发现，4 月及
12 月采集的外植体其消毒效果优于 8 月，可能与 4
月之后温度上升导致菌类活跃性上升有关。另外，
由于 4 月植物生长较旺盛，因而此时取材的外植体
诱导效果更好。同时，消毒时选用幼嫩叶片及带顶
芽茎段比下部茎段消毒效果更好。因为其生长时间
不长，杂菌等附着物较少，因而较容易灭菌。但花榈
木成年植株茎段的消毒仍有待进一步研究。
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(责任编辑 王 海)
32717 期 乔 栋等:珍稀树种花榈木组培不同外植体的无菌繁殖体系构建