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粉葛种苗离体繁殖技术初步研究



全 文 :粉葛种苗离体繁殖技术初步研究
马崇坚1,郑声云2,卓海标1
(1.韶关学院英东农业科学与工程学院,广东 韶关 512005;2.韶关市曲江区农业局大塘农技站,广东 韶关 512158)
摘 要:为获得粉葛的离体繁殖技术,以地理标志火山粉葛嫩枝为外植体,通过调整基本培养基、生长调节剂种类和配比,选出
适合的诱导、继代增殖和生根培养基配方。 结果显示,粉葛嫩茎尖是诱导愈伤组织的最佳材料。 培养基MS+6-BA 0.1 mg/L + 2,4-
D 0.1 mg/L有利于粉葛茎段侧芽的萌发,而MS+6-BA 0.5 mg/L + 2,4-D 1.0 mg/L则能高效诱导茎段产生愈伤组织。 但在对粉葛嫩
茎尖的诱导试验中, 培养基MS+6-BA 0.1 mg/L + 2,4-D 0.5 mg/L体现出促进芽萌发、 愈伤组织形成并高效分化丛生芽的综合特
点。 培养基MS + NAA 0.5 mg/L能较好地诱导粉葛试管苗形成不定根。
关键词:粉葛;地理标志;组织培养
中图分类号:S668.4 文献标识码:A 文章编号:1004-874X(2013)15-0028-03
Study on micropropagation of Pueraria thomsonii Benth in vitro
MA Chong-jian1, ZHENG Sheng-yun2, ZHUO Hai-biao1
(1.Henry Fok College of Agricalture Science & Engineering,Shaoguan University,Shaoguan 512005,China;
2.Datang Agrotechnical Station of Shaoguan City Qujiang Borough Bureau of Agriculture ,Shaoguan 512158,China)
Abstract: To provide much more high quality seeding for farmer, the different factors affect on buds and tissues of Huoshan Kudzu
(Pueraria thomsonii Benth) in vitro. The tender branch of Kudzu, include shoots, stems, were used as explants and cultivated in different
media. The optimum media for inducing buds, proliferation and rooting were selected by adjusting the kinds and doses of plant hormones
and special compounds.The result showed that the tender stem apexes of Pueraria thomsonii Benth was the best materials for inducing
tissues. The optimal media to induce sprouting from stems were MS + 6-BA 0.1 mg/L + 2, 4-D 0.1 mg/L. And media MS + 6-BA 0.5
mg/L + 2, 4-D 1.0 mg/L was suitable for induce much more tissues from stems. Otherwise, media MS + 6-BA 0.1 mg/L + 2, 4-D 0.5 mg/
L had the abilities to induce sprouting, tissues formation and buds polarization effectually. The media MS + NAA 0.5 mg/L was used for
roots inducing, the rooting rate was 73.3%.
Key words: Pueraria thomsonii Benth;Geographical indication;tissue culture
收稿日期:2013-04-12
基金项目:广东省韶关市科技计划项目(313-140518)
作者简介:马崇坚(1975-),男,博士,副教授,E-mail: ma_chj@
hotmail.com
粉葛(Pueraria thomsonii Benth)又名甘葛藤、葛根、干
葛,是葛根中的优质品。粉葛具很高药用价值,是天然绿
色保健食品 [1-3]。 目前,随着国际市场对于葛根需求急剧
增加,国内市场逐渐的升温,粉葛的发展前景也极大提
升 [4]。
对于葛根的研究与开发也逐渐热门起来, 在种苗繁
殖方面的研究多以传统扦插繁殖的方式为主。 这种方式
育苗需要消耗大量的粉葛茎段,不能满足生产的需求。 而
且传统方式繁殖粉葛苗周期长,繁殖系数低,容易受季节
气候条件的限制,品种改良难以突破。 目前,由于连年的
扦插繁殖,病毒积累严重,病毒病已成为粉葛种性退化、
产量下降、品质变劣的重要原因。 还有粉葛生产难以规模
化、产业化等诸多弊端,越来越限制粉葛产业快速高效发
展,急需新的技术解决这些瓶颈问题[5-6]。 目前对野葛的组
织培养研究取得了一些进展 [7-13],并利用悬浮培养生产活
性成分的探索 [1,7,9],而粉葛组培快速育苗还处于初步研究
阶段,相关粉葛组织培养繁殖的研究较少见于报道[14]。 针
对以上问题,开展粉葛的离体种苗繁殖研究十分迫切,必
将为粉葛种苗质量的改善, 为今后粉葛的产业化育苗和
大规模推广种植提供保障。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试粉葛材料取自韶关学院农业生态科技园标本圃,
为我国地道的地理标志粉葛中的一种火山粉葛, 经韶关
学院刘发光鉴定为豆科植物甘葛藤 (Pueraria thomsonii
Benth)植株。
1.2 试验方法
选取野外种植的粉葛植株茎尖、嫩茎、老茎、嫩叶、老
叶等经 75%酒精浸泡 1 min 左右, 然后加入 0.1% HgCl2
消毒 3~5 min, 无菌水冲洗数次后将材料切成 0.5 cm 长,
分别接种于装有诱导培养基的试管中,培养基为 MS 附加
4%蔗糖、不同浓度的 6-BA及 2,4-D组合。 每根试管接种
1 小片(段),各处理设 3 次重复,每重复 10 支试管。 接种
后置于培养室内,培养温度为 25(± 2)℃ ,光照时间为 12
h/d,光强在 1 500~2 000 lx。
1.3 数据分析
定期观察记录外植体的变化过程及材料的发育情况,
包括愈伤组织诱导的启动、增殖和分化的时间,不定芽和
不定根的诱导数等。 试验数据应用 SPSS10.0 软件进行差
异显著性测验。
广东农业科学 2013 年第 15 期28
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2013.15.050
2 结果与分析
2.1 野外种植粉葛外植体的消毒与接种
从表 1 可以看出,当消毒时间超过 3 min 后,不同材
料的死亡率达 30%以上。 相对而言,老材料的污染率较高
成活率较低,而嫩材料的成活率则均在超过 60%。 一方面
可能是因为老材料被的绒毛过于密集,清洗时较难洗去,
从而影响消毒的彻底性。 另一方面,可能是因为老材料木
质化程度较重,生命力较弱而导致死亡率较高。 因此,较
为幼嫩的粉葛材料比较适宜作为组织培养外植体, 消毒
时间以 1~3 min较佳。
2.2 不同器官粉葛愈伤组织的诱导
从应用基础诱导培养基 MS+6-BA 1.0 mg/L +2,4-
D1.0 mg/L诱导不同粉葛器官的试验结果来看, 幼嫩组织
的愈伤诱导率明显高于较老化的组织(表 2)。较老的组织
如茎段和叶柄生长较慢,愈伤组织较致密,颜色较深,容
易褐化。 嫩茎尖和嫩茎段的愈伤诱导率显著高于嫩叶柄,
其愈伤诱导速度快、数量多,愈伤生长状况更佳(图 1,封
二),故嫩茎尖和嫩茎段用于诱导愈伤组织较为适宜。 其
中嫩茎段的愈伤组织诱导率相对最高, 但后期褐化速度
仍较嫩茎尖诱导的材料快。 而嫩茎尖在消毒前处理时不
容易清洗,且易损伤而导接种后死亡率较高。 然而嫩茎尖
诱导的愈伤组织更为疏松,膨大速度更快,维持旺盛生长
的时间更长,可见粉葛嫩茎尖的愈伤诱导潜力是最强的。
2.3 粉葛茎段诱导培养及不定芽、不定根的诱导
2.3.1 粉葛嫩茎段的诱导培养 粉葛外植体具有很强的
分裂增生能力,形成愈伤组织的能力非常强,大多数的培
养材料均在接触培养基的部位产生了愈伤组织,而茎段侧
芽的萌发与愈伤组织的形成有互为消长的关系。 在各处
理中,以处理Ⅰ侧芽的萌芽率最高,且幼苗生长情况也相
对最好,但是接触培养基的外植体部分的愈伤诱导情况受
到抑制,形成愈伤率相对较低,体积小且愈伤生长速度慢
(表 3)。 而处理Ⅷ粉葛侧芽萌芽率最低,但其愈伤诱导情
况相对最好,愈伤诱导率高且膨大速度快。试验中观察到,
随着附加激素 6-BA 和 2,4-D 浓度的提高,粉葛茎段愈伤
诱导率明显增加,而侧芽萌发率却明显下降。综合分析,为
获得无菌粉葛植株,组培方案Ⅰ是最好的选择。 所以对于
通过野外粉葛植株来获得大量愈伤组织,处理Ⅷ的效果最
好。 综合表 3可以发现,粉葛愈伤的诱导会抑制粉葛茎段
的萌芽,但当侧芽处于生长状态时,对维持外植体以及愈
伤组织的生命力有促进作用,表现在未进入不定芽分化或
未有侧芽处于生长状态下的外植体或愈伤组织在培养一
段时间后颜色容易产生褐变,材料很快进入衰老状态而失
去增殖和分化的能力。而那些存在不定芽分化或侧芽生长
中的外植体,维持生长状态而颜色发生褐变的时间明显增
长,甚至一直处于较旺盛的增殖生长状态中。
表 1 不同外植体消毒试验效果比较
取材部位
灭菌时间
(min)
茎尖、嫩茎、
嫩叶柄
老茎
1
3
5
2
4
6
10
30
33.3
13.3
36.7
56.7
死亡率
(%)
16.7
6.7
6.7
50
36.7
30
污染率
(%)
73.3aA
63.3aA
60.0bB
36.7cC
26.6cC
13.3dD
成活率
(%)
注:表中同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著,大写
英文字母不同者表示差异极显著,表 2、表 3、表 4同。
表 2 不同粉葛材料愈伤组织诱导率的差异
材料 愈伤诱导率(%)
80.0aA
86.7aA
40.0cC
66.7bB
23.3dD
嫩茎尖
嫩茎段
老茎段
嫩叶柄
老叶柄
愈伤生长情况
生长快、多,呈浅褐色,疏松
生长快、多,呈浅褐色,疏松
生长慢、少,呈灰白色,疏松
生长快、少,呈浅褐色,致密
生长慢、少,呈黑褐色,致密
表 3 不同配方对嫩粉葛茎段诱导培养的差异









MS + 6-BA0.1 + 2,4-D0.1
MS + 6-BA0.5 + 2,4-D0.1
MS + 6-BA1.0 + 2,4-D0.1
MS + 6-BA0.1 + 2,4-D0.5
MS + 6-BA0.5 + 2,4-D0.5
MS + 6-BA1.0 + 2,4-D0.5
MS + 6-BA0.1 + 2,4-D1.0
MS + 6-BA0.5 + 2,4-D1.0
MS + 6-BA1.0 + 2,4-D1.0
基部愈伤大小
10d 20d 30d
**
**
**
**
**
**
**
**
***
**
***
***
***
**
***
***
****
****
***
*****
*****
****
****
*****
****
******
*****
处理 培养基(mg/L) 萌芽率(%)
93.3aA
76.7bBC
70.0bcBC
76.7bBC
80.0bAB
63.3cdCD
53.3dD
33.3eE
36.7eE
生长快、健壮、苗粗长、枝叶繁茂
生长快、健壮、苗粗长、枝叶繁茂
生长慢、健壮、苗粗长、枝叶繁茂
生长快、健壮、苗粗长、枝叶繁茂
生长快、健壮、苗粗长、枝叶繁茂
生长慢、健壮、苗粗长、枝叶少
生长慢、瘦弱、苗粗短、枝叶少
生长慢、瘦弱、苗粗短、枝叶少
生长慢、瘦弱、苗粗短、枝叶少
生长情况
注: 愈伤组织生长大小:** 表示愈伤块直径¢≤0.4cm;*** 表示 0.4 cm <¢≤ 0.6 cm;**** 表示 0.6 cm <¢≤0.8 cm;***** 表示愈 0.8cm<¢
≤1.0cm;****** 表示¢>1.0cm。
2.3.2 粉葛嫩茎尖的诱导培养 植株茎尖处于非常活跃的
生长状态,用茎尖组织培养方法进行粉葛的快速繁殖,可在
短期内繁殖出大批量种苗,保持品种优良性状,缩短推广时
间[13],提高产量和品质。 在试验的 9个处理中,茎尖诱导时接
29
表 5 不同培养基外植体不定根的诱导情况
处理 培养基
1
2
3
4
MS
1/2MS
MS+0.5mg/L NAA
1/2MS+0.5mg/LNAA
26.7
33.3
73.3
60
诱导率
(%)
叶浅绿、量少、较粗、生根速度较慢
叶浅黄色、量少、细长、生根速度较慢
叶浅绿、主根较粗、须根多、生根速度快
叶浅黄色、须根多、细长、生根速度较快
生长状况
触培养基的基部均明显形成愈伤组织, 其中以附加激素 6-
BA和 2,4-D浓度较高的处理,愈伤诱导率组织体积较大,愈
伤形成及膨大的速度明显高于激素浓度较小的处理, 其中
以处理Ⅷ的愈伤组织块体积最大。 从表 4可以看出,附加激
素 6-BA和 2,4-D浓度在 0.1~0.5 mg/L范围内的愈伤诱导率
相对较高,超过 0.5 mg/L后愈伤组织诱导率又有所下降。
表 4 粉葛茎尖在 9种培养基的培养情况
处理









86.7
73.3
66.7
66.7
80.0
73.3
60.0
86.7
80.0
愈伤诱导率(%)
93.3abAB
93.3abAB
86.7bcBC
100.0aA
85.0bcBC
93.3abAB
91.7abAB
78.3cC
80.0cC
不定芽分化率 (%)
2.3
2.5
2.2
2.5
2.0
2.1
2.1
1.8
2.5
不定芽增殖(倍) 不定芽长势
生长快、植株较高,健壮、叶繁茂,叶色黄
生长快、植株较高,健壮、叶繁茂,叶色浅绿
生长快、株高中等,健壮、叶繁茂,叶色浅绿
生长快、植株较高,健壮、叶繁茂,叶色浓绿
生长较慢、株高中等,健壮、叶繁茂,叶色浓绿
生长慢、植株较矮,健壮、叶繁茂,叶色浓绿
生长慢、植株矮小,健壮、叶繁茂,叶色浓绿
生长慢、植株矮小,健壮、叶繁茂,叶色浓绿
生长慢、植株极矮,健壮、叶繁茂,叶色浓绿
而与愈伤组织形成相反的是,随着附加激素 6-BA 和
2,4-D 浓度的提高,茎尖愈伤组织分化不定芽以及芽体增
殖的潜力明显下降,表现为不定芽分化率呈下降趋势,而
且芽的增殖亦以附加激素 6-BA 和 2,4-D 浓度较低的处
理生长相对最好,其中以处理 IV整体效果最好,表现在愈
伤组织形成率适中,茎尖出现明显生长,同时愈伤组织分
化程度明显,丛生芽状态最佳(图 2A,封二)。 附加激素 6-
BA和 2,4-D浓度高于 0.5 mg/L的处理愈伤组织多处于旺
盛生长态势, 而芽分化以及芽的生长增殖则受到较大程
度的抑制,幼芽一般较小矮小,节间短,叶片小,植株整体
长势较弱。 其中以处理 VIII 的不定芽分化以及生长状态
最差,即使已分化的不定芽,长时间处于初始状态,未见明
显生长。 可见,诱导粉葛茎尖愈伤组织形成并分化不定芽
需要一定浓度的激素参与, 但过高浓度的激素反而会抑
制芽的生长和增殖, 使愈伤组织较长时间停留在初始分
化状态,分化出的不定芽节间极短(图 2B,封二)。 试验中
观察到,9个处理的培养基方案均未能诱导出不定根。
2.3.3 粉葛不定根的初步诱导 从表 5 可以看出, 在新设
计的 4 种生根诱导培养基组合中, 粉葛都均诱导出不定
根, 不同处理间体现出较大的差异。 以处理 3 即 MS+0.5
mg/L NAA的不定根诱导率最高、达 73.3%,而且生根效果
最好,表现为不定根根诱导的时间短,主根较粗,须根多,
细长。 同时植株生长正常,叶色绿,节间中等(图 3,封二)。
而 MS 培养基不定根诱导率相对最低,根少较短,植株浅
黄色。 可见,适度的添加生长素类有利于粉葛不定根的诱
导和形成。在试验中 MS培养基大量元素的减少并未能明
显促进不定根的诱导和生长,可见 MS 中大量元素的量对
不定根的生长的影响有待进一步研究。
3 结论与讨论
不同生理状态的粉葛材料对消毒时间的要求有较大
的差异,本试验结果显示,粉葛老组织消毒成功率较低,均
在 40%以下, 而幼嫩组织较容易消毒, 成功率均超过
60%,其中以消毒 1 min 的处理效果最好。 对野外种植粉
葛材料的取材,以嫩茎和嫩茎尖诱导效果最好,其中以嫩
茎尖诱导愈伤组织的成功率以及愈伤组织状态相对最佳,
诱导率达 80%。 而对嫩茎段进行诱导培养出现两种培养
基, 其中以MS+6-BA 0.1 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L 培养基进
行诱导培养时,侧芽的萌芽率最高,且幼苗生长情况也相
对最好。 而 MS + 6-BA 0.5 mg/L + 2,4-D 1.0 mg/L 配方的
愈伤组织诱导率相对最高且膨大速度最快,愈伤组织状态
最优。而以 MS + 6-BA 0.1 mg/L + 2,4-D 0.5 mg/L 对嫩茎尖
的诱导培养,既能形成愈伤组织,并出现明显的分化现象,
形成状态极佳的丛生芽。 以 MS + 0.5 mg/LNAA 培养基对
不定芽进行不定根的诱导,可获得较好的生根效果。
粉葛枝叶被密集绒毛,较难清洗消毒 [5],清洗时间过
长,容易损伤而致使消毒处理时更容易坏死,而清洗时间
和消毒时间过短,消毒效果较差而不彻底。 因而,野外种
植材料的清洗处理的技巧比较关键。
本试验中幼嫩部位粉葛愈伤的诱导率可达到 66.7%
以上, 接种后 2~3 d 就可以看出有愈伤组织生成。 但嫩
茎段的愈伤组织诱导分化的难度明显较茎尖大, 茎尖最
容易诱导产生丛生芽。 在较低激素配比条件下, 嫩茎尖
能具备芽生长和愈伤组织形成并快速分化丛生芽等多方
面的综合优势, 可能跟茎尖细胞旺盛的生长和分化能力
有关[11]。 试验中嫩茎尖在不同配比中的表现仍不太稳定,
诱导丛生芽及愈伤组织增殖更为高效的培养基配方仍有
待进一步系统研究。 本试验仅对试管苗进行了初步的生
根诱导, 已取得了较为理想的生根效果, 更为系统高效
的生根诱导试验仍需要进行深入研究。 本试验的成功进
(下转第 35页)
30
行, 将为粉葛离体种苗繁殖体系的构建, 以及利用离体
粉葛材料进行更深层次的研究, 比如将为粉葛葛根形成
及膨大的过程和机制研究奠定了良好的基础。
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