全 文 ：·药理·
收稿日期:2012-12-24
* 通讯作者:姚向超，Tel:020-87330541，E-mail:yxc129@ 163. com。
LC-MS /MS同时测定大鼠血浆中黄芪成分芒柄花素、
毛蕊异黄酮和异鼠李素的浓度及其药动学研究
林 青1，李 媛1，谭晓梅1，姚向超2*
(1. 中山大学附属第一医院黄埔院区，广东 广州 510700;2. 中山大学中山眼科中心，广东 广州 510060)
摘要 目的:建立大鼠血浆中芒柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素浓度的测定方法，并研究其药动学参数。方
法:取大鼠 10 只灌胃给予 10 g /kg黄芪，检测给药前和给药后 24 h 内芒柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素的血浆浓
度，并计算其药动学参数;采用液相色谱-串联质谱法，以芦丁为内标，色谱柱为 Alltima C18，流动相:甲醇-水溶液，梯
度洗脱，流速为 0. 3 mL /min，柱温为 40 ℃，电喷雾负离子源，扫描方式为多反应离子监测。芒柄花素、毛蕊异黄酮、
异鼠李素和芦丁的选择检测离子质荷比(m/z)分别为 m/z 267. 0→251. 9，m/z 283. 1→268. 2，m/z 315. 4→300. 1 和
m/z 609. 4→300. 1。结果:芒柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素检测浓度的线性范围分别为 5 ～ 1 000(r = 0. 9996)、
3. 91 ～ 500(r = 0. 9989)、0. 5 ～ 100(r = 0. 9992)ng /mL，最低检测限分别为 0. 625、0. 5 和 0. 1 ng /mL，药动学参数分
别为:t1 /2β(10. 43 ± 2. 94)、(6. 91 ± 1. 33)和(5. 07 ± 1. 21)h，Cmax(398. 5 ± 103. 7)、(138. 7 ± 32. 8)和(58. 3 ± 14. 5)
ng /mL，AUC0→12h(1238. 8 ± 311. 3)、(669. 5 ± 159. 7)和(274. 1 ± 83. 9)ng·h /mL。结论:本方法专属性强、灵敏度
高、准确性好，可用于芒柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素的血药浓度测定，大鼠灌胃给 10 g /kg黄芪后，芒柄花素、毛
蕊异黄酮和异鼠李素在大鼠体内的药动学符合二室模型特征。
关键词 黄芪;芒柄花素;毛蕊异黄酮;异鼠李素;液相色谱-串联质谱法;药动学参数
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)04-0589-05
Simultaneous Determination of Formononetin，Calycosin and Isorhamnetin from Astragalus
mongholicus in Ｒat Plasma by LC-MS /MS and Application to Pharmacokinetic Study
LIN Qing1，LI Yuan1，TAN Xiao-mei1，YAO Xiang-chao2
(1. Huangpu District of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510700，China;2. Zhongshan Ozhthalmic
Centre，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510060，China)
Abstract Objective:To establish a method to determine the concentration of formononetin，calycosin and isorhamnetin from As-
tragalus mongholicus in rats plasma using LC-MS /MS and calculate their pharmacokinetic parameters. Methods:The contents of form-
ononetin，calycosin and isorhamnetin in plasma were detected before and 24 h after 10 rats were treated with 10 g /kg Astragalus mong-
holicus. Ｒutin was used as internal standard. Agilent 1 200 HPLC system with Alltima C18(150 mm ×2. 1 mm，5 μm)was used. Mobile
phase was methanol-water solution with gradient elute at a flow rate of 0. 3 mL /min. The column temperature was 40 ℃. The LC-MS /
MS system was operated using an electrospray ionization probe in negative ion mode;Scan mode:multiple reaction ion monitoring
(MＲM)mode. The ion of monitor:m/z 267. 0→251. 9 for formononetin，m/z 283. 1→268. 2 for calycosin，m/z 315. 4→300. 1 for isorh-
amnetin and m /z 609. 4→300. 1 for rutin(internal standard)，respectively. Ｒesults:The linear range of formononetin，calycosin and
isorhamnetin was 5 ～ 1 000(r = 0. 9996) ，3. 91 ～ 500 (r = 0. 9989)and 0. 5 ～ 100 ng /mL(r = 0. 9992) ，respectively. The lowest limit
of quantification(LLOQ)of formononetin，calycosin and isorhamnetin was 0. 625，0. 5 and 0. 1 ng /mL，respectively. The pharmacokinet-
ic parameter，t1 /2β，of formononetin，calycosin and isorhamnetin was(10. 43 ± 2. 94)，(6. 91 ± 1. 33)and(5. 07 ± 1. 21)h，respective-
ly. The Cmax of formononetin，calycosin and isorhamnetin was(398. 5 ± 103. 7)，(138. 7 ± 32. 8)and(58. 3 ± 14. 5)ng /mL，respective-
ly. The AUC0→12h of formononetin，calycosin and isorhamnetin was(1238. 8 ±311. 3)，(669. 5 ±159. 7)and(274. 1 ±83. 9)ng·h /mL，re-
spectively. Conclusion:A sensitive，accuracy and suitable LC-MS/MS method for determination of formononetin，calycosin and isorhamnetin
is developed and successfully applied to the pharmacokinetic study of 10 g /kg Astragalus mongholicus after oral administration in rats.
Key words Astragalus mongholicus;Formononetin;Calycosin;Isorhamnetin;LC-MS /MS;Pharmacokinetics
黄芪是中药补益药中应用最为广泛的药材品
种，也是许多中药复方之主药，为历代中医最为常用
的药材之一。具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮、
生肌等功效〔1〕。黄芪含有化学成分较多，包括多
·985·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 4 期 2013 年 4 月
糖、皂苷、黄酮、氨基酸和微量元素等〔2〕。黄芪中的
黄酮类成分为其主要的有效成分群之一，在免疫应
答、抗肿瘤、抗炎抗菌和雌激素方面均有较好的生理
或药理作用〔3-5〕。目前，对黄芪药材中黄酮类成分的
测定多以 HPLC法为主〔6，7〕，已报道的测定方法灵敏
度低，分析时间周期较长。目前，国内尚无液相色
谱-串联质谱(LC-MS /MS)同时测定血浆中芒柄花
素、毛蕊异黄酮和异鼠李素的报道。本文建立一种
快速、灵敏、简便的 LC-MS /MS法测定大鼠血浆中芒
柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素的浓度，旨在为黄芪
及其制剂的临床应用提供简便、快速的测定方法。
1 仪器与材料
1. 1 实验动物 雄性 SD 大鼠 12 只，体质量 300
～ 320 g，由广东省医学实验动物中心提供，许可证:
SCKX(粤)2008-0002。
1. 2 试药 芒柄花素(批号:2005-2024，质量分数
＞ 98. 5%)、毛蕊异黄酮(批号:2004-2027，质量分数
＞ 98. 3%)、异鼠李素(批号:110809，质量分数 ＞
98%)、芦丁(批号:110301，纯度质量分数 ＞ 98%)
对照品由中国药品检定研究院提供;迪玛 C18固相萃
取小柱由 Dikma 公司提供;甲醇为色谱纯，水为超
纯水，其余试剂均为分析纯。
1. 3 主要仪器 API4000 型液相色谱 /质谱联用
仪，包括电喷雾离子源(ESI)、Analyst 1. 5. 1 数据处
理系统(美国 AB 公司);1200 液相色谱系统(美国
Agilent公司)。
2 方法与结果
2. 1 血浆样品处理 取血浆样品 100 μL，依次加
入 500 ng /mL 芦丁对照品溶液 10 μL 和 500 μL 的
超纯水，涡旋振荡 30 s，过已活化好的迪玛 C18固相
萃取小柱(预先用 1 mL 甲醇和 1 mL 超纯水活化)
后，加入 1 mL超纯水淋洗后，用 1 mL 甲醇洗脱，并
收集洗脱液，8 000 r /min 离心 10 min，取上清液用
氮气吹干，加入 100 μL 流动相复溶，20 000 r /min
高速离心 15 min，取上清液 5 μL，进样测定。
2. 2 色谱条件与质谱条件 色谱柱:Alltima C18
(150 mm × 2. 1 mm，5 μm);采用梯度洗脱，洗脱程
序见表 1。流动相为甲醇-水(V /V)，流速:0. 3 mL /
min;进样量:5 μL;柱温:40 ℃。电喷雾离子源(ESI
源);检测方式:负离子检测;扫描方式:多反应离子
监测(MＲM);芒柄花素、毛蕊异黄酮、异鼠李素和芦
丁的选择检测离子质荷比(m/z)分别为 m/z 267. 0
→251. 9，m/z 283. 1→268. 2，m/z 315. 4→300. 1 和
m/z 609. 4→300. 1。雾化气流速:25 L /min;干燥气
流速:30 L /min;干燥气温度:400 ℃;检测器电压:
－ 4 500 V，其他的测定参数见表 2。
表 1 甲醇-水梯度洗脱程序
时间 /min 甲醇 /% 水 /%
0. 1 30 70
0. 6 30 70
1. 1 90 10
6. 5 90 10
8. 5 30 70
15. 0 30 70
表 2 芒柄花素、毛蕊异黄酮、异鼠李素和芦丁质谱参数优化结果
化合物 MＲM/(m/z) Dwell time /ms DP /V EP /V CE /V CXP /V
芒柄花素 267. 0→251. 9 200 － 67. 2 － 10. 5 － 25. 7 － 5. 8
毛蕊异黄酮 283. 1→268. 2 200 － 76. 7 － 9. 8 － 25. 1 － 7. 4
异鼠李素 315. 4→300. 1 200 － 90. 8 － 15. 5 － 27. 3 － 13. 6
芦丁 609. 4→300. 1 200 － 117. 1 － 10. 1 － 37. 6 － 14. 4
2. 3 溶液的制备 精密称取芒柄花素、毛蕊异黄
酮、异鼠李素和芦丁对照品各 10 mg，分别置于 10
mL容量瓶中，加 5 mL流动相使其溶解，用流动相定
容至 10 mL，得浓度均为 1 mg /mL 母液，用时用流
动相稀释至所需浓度对照品溶液即可。
2. 4 方法专属性考察 取大鼠空白血浆 +芒柄花
素对照品 +毛蕊异黄酮对照品 +异鼠李素对照品、
血浆样品(给药 1 h后)，按“2. 1”项下方法处理，进
样测定。另取空白血浆进样测定，记录色谱。结果
表明，空白杂质对检测无干扰，芒柄花素、毛蕊异黄
酮、异鼠李素和芦丁内标的保留时间分别是 6. 3、
5. 9、6. 2、5. 6 min。色谱见图 1。
2. 5 线性关系与最低检测限( LLOQ) 考察 取空
白血浆 100 μL，加入芒柄花素、毛蕊异黄酮、异鼠李
素混合对照品溶液 10 μL，制成芒柄花素浓度为 5、
10、20、50、100、200、500、1 000 ng /mL;毛蕊异黄酮
浓度为 3. 91、7. 81、15. 63、31. 25、62. 5、125、250 ng /
mL;异鼠李素浓度为 0. 5、1、2、5、10、20、50、100 ng /
mL的标准溶液，按“2. 1”项下方法处理，进样测定。
以浓度(X)为横坐标，芒柄花素、毛蕊异黄酮、异鼠
·095· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 4 期 2013 年 4 月
图 1 代表性血浆中芒柄花素、毛蕊异黄酮、异鼠李素和芦丁液相色谱-串联质谱图
A. 空白血浆 B. 空白血浆 +芒柄花素 +毛蕊异黄酮 +异鼠李素 +芦丁内标 C. 血浆样品 +芦丁(内标)
1. 芒柄花素 2. 毛蕊异黄酮 3. 异鼠李素 4. 芦丁(内标)
李素与内标峰面积之比(Y)为纵坐标绘制标准曲
线。芒柄花素的回归方程为:Y = 0. 854X + 0. 347(r =
0. 9996)，其检测浓度的线性范围为 5 ～ 1 000 ng /
mL，最低检测限(LLOQ)为 0. 625 ng /mL(S /N ＞ 3);
毛蕊异黄酮的回归方程为:Y = 0. 0414X － 0. 0083(r =
0. 9989)，其检测浓度的线性范围为 3. 91 ～ 250 ng /
mL，最低检测限(LLOQ)为 0. 5 ng /mL(S /N ＞ 3)。
异鼠李素的回归方程为:Y = 0. 0133X + 0. 0024(r =
0. 9992)，其检测浓度的线性范围为 0. 5 ～100 ng /mL，
最低检测限(LLOQ)为 0. 1 ng /mL(S /N ＞3)。
2. 6 回收率与精密度考察 取空白血浆 100 μL，
加入芒柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素混合对照品
·195·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 4 期 2013 年 4 月
溶液，制成低、中、高浓度(芒柄花素、毛蕊异黄酮和
异鼠李素:10、100、500 ng /mL，7. 81、125、200 ng /mL
和 1、10、50 ng /mL)的标准溶液，按“2. 1”项下方法
处理，进样测定，进行 5 样本分析，连续测定 3 d，根
据当天标准曲线计算绝对回收率、相对回收率、日内
ＲSD和日间 ＲSD。见表 3。
表 3 回收率和精密度考察结果(珔x ± s，n =5)
药物 浓度
/
(ng /mL)
回收率
绝对
回收率 /%
相对
回收率 /%
ＲSD
日内
精密度 /%
日间
精密度 /%
芒柄花素 10 73. 4 ± 8. 2 98. 3 ± 7. 5 7. 6 6. 1
100 78. 1 ± 6. 3 105. 2 ± 5. 4 5. 1 7. 7
500 80. 3 ± 4. 7 96. 9 ± 4. 1 42 3. 8
毛蕊异黄酮 7. 81 68. 7 ± 5. 8 93. 7 ± 6. 8 7. 3 9. 2
125 73. 8 ± 5. 9 102. 2 ± 5. 2 5. 1 7. 3
200 77. 4 ± 3. 5 101. 3 ± 3. 3 4. 7 4. 4
异鼠李素 1 71. 6 ± 8. 3 95. 2 ± 7. 8 8. 2 7. 9
10 75. 5 ± 6. 1 97. 8 ± 6. 4 6. 5 6. 1
50 78. 4 ± 4. 6 100. 2 ± 3. 1 3. 1 3. 5
2. 7 稳定性考察 取空白血浆 100 μL，加入芒柄
花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素混合对照品溶液，制成
低、中、高浓度(芒柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素:
10、100、500 ng /mL，7. 81、125、200 ng /mL 和 1、10、
50 ng /mL)的标准溶液，各 2 份，分别于 － 20 ℃放置
30 d(测定时间为放置 1、7、14、21、30 d)及 － 70 ℃
反复冻融 5 次(测定时间为冻融后 2、4、8、12、24
h)，于相应测定时间测定各标准溶液中芒柄花素、
毛蕊异黄酮和异鼠李素的浓度。结果表明，芒柄花
素、毛蕊异黄酮和异鼠李素在 － 20 ℃放置及反复冻
融条件下稳定性较好。见表 4。
表 4 稳定性考察结果(珔x ± s，n =5)
药物 浓度 /(ng /mL)
反复冻融稳定性 /
(ng /mL) ＲSD /%
长期稳定性 /
(ng /mL) ＲSD /%
芒柄花素 10 9. 37 ± 0. 65 6. 9 10. 3 ± 7. 9 7. 8
100 99. 4 ± 5. 9 5. 8 101. 2 ± 4. 3 4. 2
500 484. 3 ± 13. 1 2. 7 523. 8 ± 10. 1 1. 9
毛蕊异黄酮 7. 81 7. 53 ± 0. 62 9. 1 7. 67 ± 0. 78 10. 2
125 123. 7 ± 9. 6 7. 7 116. 7 ± 5. 8 4. 9
200 208. 1 ± 8. 8 4. 1 200. 1 ± 7. 8 3. 9
异鼠李素 1 0. 94 ± 0. 05 5. 9 1. 03 ± 0. 06 6. 7
10 10. 3 ± 0. 73 7. 3 9. 88 ± 0. 47 5. 1
50 47. 4 ± 2. 3 4. 8 52. 7 ± 1. 9 4. 2
2. 8 药物提取及药动学实验 取 1 kg 黄芪(购于
广州市吉祥平价药店，经广州中医药大学鉴定教研
室贺海波教授鉴定为黄芪饮片)加 10 倍量的 50%
乙醇，回流提取 2 次，每次 1. 5 h，合并滤液，减压浓
缩，冷冻干燥至干粉，得率约为 15. 5%生药，采用李
小兵等〔9〕报道的方法，测定芒柄花素、毛蕊异黄酮
和异鼠李素的含量为 1. 473 ± 0. 23、0. 295 ± 0. 05 和
0. 083 ± 0. 004 mg /g生药。取大鼠 12 只，实验前 12
h禁食不禁水，按 10 g /kg 黄芪生药灌胃给予大鼠，
于给药前和给药后 0. 083、0. 167、0. 25、0. 5、0. 75、1、
1. 5、2、4、8、12、24 h 颈总动脉插管采血 300 μL，置
于 1. 5 mL肝素化的塑料管中，于 4 ℃、3 000 r /min
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离心 10 min分离血浆，置于 － 20 ℃冷冻储存备用，
作为样品血浆。测定时，取样品血浆按“2. 1”项下
方法处理，进样测定血药浓度。并用 DAS 2. 0 版本
药动学软件对血药浓度结果进行分析，机选药动学
参数。芒柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素的平均药-
时曲线图见图 2，在大鼠体内的药动学参数见表 5。
芒柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素在体内迅速吸
收，随后缓慢消除和代谢，符合二房室模型药动
学特征。
图 2 芒柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素
的平均药-时曲线图(珔x ± s，n =12)
表 5 芒柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素在
大鼠体内的药动学参数(珔x ± s，n =12)
参数 芒柄花素 毛蕊异黄酮 异鼠李素
Ke /h － 1 0. 101 ± 0. 023 0. 067 ± 0. 009 0. 139 ± 0. 037
t1 /2β /h 10. 43 ± 2. 94 6. 91 ± 1. 33 5. 07 ± 1. 21
tmax /h 0. 63 ± 0. 16 0. 52 ± 0. 17 0. 86 ± 0. 17
Cmax /(ng /mL) 398. 5 ± 103. 7 138. 7 ± 32. 8 58. 3 ± 14. 5
AUC0→12 h /(ng·h /mL) 1238. 8 ± 311. 3 669. 5 ± 159. 7 274. 1 ± 83. 9
AUC0→∞ /(ng·h /mL) 1486. 5 ± 293. 9 733. 3 ± 183. 4 287. 3 ± 88. 4
Vd /(L /h) 145. 59 ± 25. 48 40. 09 ± 7. 93 21. 16 ± 5. 44
CL tot /L 9. 69 ± 1. 21 4. 02 ± 0. 82 22. 17 ± 2. 9
3 讨论
本实验建立了同时测定血浆中芒柄花素、毛蕊
异黄酮和异鼠李素的超灵敏 LC-MS /MS 方法，能满
足生物样品分析的要求，可用于芒柄花素、毛蕊异黄
酮和异鼠李素动物体内血药浓度的测定，为进一步
研究芒柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素体内测定方
法奠定了基础。
在优化 LC-MS /MS测定方法时，曾采用等度洗
脱，尽管分析物的保留时间较短，但是发现芒柄花
素、毛蕊异黄酮和异鼠李素的峰形较差，灵敏度较
低，而采用梯度洗脱，芒柄花素、毛蕊异黄酮、异鼠李
素和芦丁在色谱柱的色谱分离良好，保留时间较合
适，峰形较好，且流动相的 pH 对待测物的保留和峰
形均无影响。
提取溶剂的选择实验中曾分别选用甲醇、乙腈
作为蛋白沉淀剂，发现在加入相同体积沉淀剂后，芒
柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素的基质效应明显，干
扰多且提取率低;选用有机溶剂如正丁醇、乙酸乙
酯、乙醚等，研究发现芒柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠
李素提取率较低，分析测定的灵敏度较差;考虑到芒
柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素具有较强的极性，本
实验采用固相萃取进行提取，研究发现采用 Dikma
C18固相萃取小柱进行提取时，芒柄花素、毛蕊异黄
酮和异鼠李素的绝对回收率超过 70%。因此本实
验采用固相萃取进行提取。
根据化学结构相似原则，曾选用芫花素、槲皮
素、山柰酚作为内标，结果发现在该流动相下峰形不
理想而具有较强的离子抑制作用;在选用芦丁做内
标时，发现芦丁的离子化效应、色谱保留时间与待测
物相类似，因此采用芦丁做内标进行定量测定。
参 考 文 献
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