全 文 ：中国农业科学 2013,46(3):534-544
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.03.010

收稿日期：2012-08-13；接受日期：2012-11-07
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（201103018）
联系方式：何旭峰，E-mail：hxufeng005@126.com。通信作者彭德良，Tel：010-62815611；E-mail：dlpeng@ippcaas.cn


植物罹病组织中象耳豆根结线虫的 LAMP 快速检测方法
何旭峰 1,2，彭 焕 1，丁 中 2，贺文婷 1，黄文坤 1，彭德良 1
（1中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；2湖南农业大学生物安全科技学院，长沙 410128）

摘要：【目的】建立一种基于环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，
从植物罹病组织中直接检测象耳豆根结线虫（Meloidogyne enterolobii）的快速检测方法，为象耳豆根结线虫的
监测和防治提供技术支持。【方法】根据象耳豆根结线虫与其它根结线虫 ITS 序列差异设计 LAMP 特异性引物，通
过对 LAMP 反应条件中的 Mg2+、dNTPs、甜菜碱和反应时间进行优化，同时对检测体系的特异性和灵敏度进行验证，
建立一种从罹病植物组织中检测象耳豆根结线虫的 LAMP 快速检测方法。【结果】象耳豆根结线虫 LAMP 检测体系
优化结果表明在 Mg2+的浓度为 5.0 mmol·L-1、dNTPs 的浓度为 2.4 mmol·L-1、不添加甜菜碱、反应时间为 45 min 的
条件下，扩增效率最优。本研究建立的 LAMP 检测方法能够从 11 个植物线虫种群中特异检测出象耳豆根结线虫，
检测灵敏度为 1/200000 头线虫 DNA，比普通 PCR 灵敏 100 倍，能够直接从植物根结中检测出象耳豆根结线虫，准
确度为 100%。【结论】本研究以 rDNA-ITS 序列为靶基因建立象耳豆根结线虫 LAMP 快速分子检测方法，具有特异
性强、灵敏度高、简单、快速、经济等特征，能够从罹病植物组织中快速准确地检测出象耳豆根结线虫，具有极
高的实践应用价值。
关键词：象耳豆根结线虫；环介导恒温扩增；特异性；灵敏度；快速检测

Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Diagnosis
of Meloidogyne enterolobii Directly from Infected Plants
HE Xu-feng1,2, PENG Huan1, DING Zhong2, HE Wen-ting1, HUANG Wen-kun1, PENG De-liang1
(1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural
Sciences, Beijing 100193; 2College of Biosafety Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128)

Abstract: 【Objective】 The objective of this study is to establish a rapid diagnostic method for Meloidogyne enterolobii from
the infected plants based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP), and to provide technical supports for monitoring
and prevention of M. enterolobii. 【Method】 The LAMP specific primers were designed according to the distinction of ITS (internal
transcribed spacer) sequences between M. enterolobii and other Meloidogyne spp.. The reaction conditions of LAMP, including the
concentrations of Mg2+, dNTPs, betain and reaction times were optimized, and the specificity and sensitivity of the LAMP were
testified. A rapid method for M. enterolobii from infected plants by LAMP was established on this basis. 【Result】 The optimum
conditions for LAMP reaction could be carried out under the concentrations of 5.0 mmol·L-1 Mg2+ and 2.4 mmol·L-1 dNTPs, without
betain and 45 minutes of reaction. The method developed in this paper was able to specifically detect M. enterolobii from 11 species
of plant nematodes and to sensitivity detect DNA as low as 1/200000 nematode DNA. The sensitivity of LAMP reaction was 100
times higher than the conventional PCR method, which was capable of detecting M. enterolobii directly from the infected roots with
100% accuracy.【Conclusion】The rapid detection of M. enterolobii by LAMP assay targeted the ITS region of ribosomal DNA was
built. The method is high specificity, sensitivity, and economic value, which makes it possible for quick and accurately detecting
M. enterolobii from the infected plant tissue, and has higher actual application value.
3期 何旭峰等：植物罹病组织中象耳豆根结线虫的 LAMP快速检测方法 535
Key words: Meloidogyne enterolobii; LAMP; specificity; sensitivity; diagonosis

0 引言
【研究意义】根结线虫（Meloidogyne spp.）是一
类植物根系专性内寄生物，由该病原引起的病害遍布
世界大部分地区，每年给农业生产造成巨大的经济损
失[1]。截止目前，全世界共记录了 106 种根结线虫，
其数量还在不断增加 [2]。象耳豆根结线虫（M.
enterolobii）最先在中国海南省象耳豆树（Enterolobium
sp.）上发现 [3]，Xu 等认为玛雅古根结线虫（M.
mayaguensis）和象耳豆根结线虫是同一个种[4]。目前
象耳豆根结线虫在亚洲[5-6]、非洲[7-8]、欧洲[9]、美洲[10-11]
等地均有分布，其中中国南方地区分布广泛，且危害
较为严重。象耳豆根结线虫能够寄生包括豆科
（ Fabaceae）、葫芦科（ Cucurbitaceae）、茄科
（Solanaceae）、桃金娘科（Myrtaceae）、番荔枝科
（Annonaceae）和竹芋科（Marantaceae）等多种植
物[12]，并可克服 Mi 抗原基因的抗性[13-15]，同时不会
被最具控制植物根结线虫生防前景的穿刺巴氏杆菌
（Pasteuria penetrans）寄生[16]。由于象耳豆根结线虫
特殊的生物学特性，一旦大面积扩散或定殖，将会造
成毁灭性的灾难，现已经成为中国热带、亚热带地区
作物的一个重要潜在病原物。目前，欧洲和地中海植
物保护组织（EPPO）将其列入警报名录[17]，美国和韩
国将其列为植物检疫对象[11]。由于象耳豆根结线虫的
形态检测难度大，传统分子检测需要专业的仪器才能
够进行，因此，亟需建立一种快速、便捷的直接从罹
病植物组织中检测象耳豆根结线虫的 LAMP 检测技
术，从而为该病害的田间检测和监测提供有力的技术
支持。【前人研究进展】象耳豆根结线虫的会阴花纹
与南方根结线虫（M. incognita）非常相似，常规方法
很难对其进行准确的判定[6]。Blok等[18]发现象耳豆根
结线虫的 IGS 序列和其它 4 种根结线虫具有明显差
异；Blok等[10]根据根结线虫 mtDNA差异，开发出象
耳豆根结线虫 PCR 检测方法；Xu 等[4]通过对多种根
结线虫的 mtDNA进行 PCR-RFLP分析，开发出象耳
豆根结线虫的快速检测技术；Long等[19]根据象耳豆根
结线虫与其它根结线虫 IGS的差异，设计出象耳豆根
结线虫特异性 PCR检测引物；Adam等[20]根据南方根
结线虫、爪哇根结线虫（M. javanica）、花生根结线
虫（M. arenaria）、玛雅古根结线虫、北方根结线虫
（M. hapla）、奇诺伍德根结线虫（M. chitwoodi）和
伪哥伦比亚根结线虫（M. fallax）7种根结线虫的RAPD
标记设计出检测玛雅古根结线虫的特异性引物；
Tigano等[21]开发出 SCAR标记引物特异性的检测象耳
豆根结线虫的技术；Hu 等[12]开发出从植物根结中检
测象耳豆根结线虫的多重 PCR检测技术。环介导等温
扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，
LAMP）是 Notomi等[22]发明的一种新式恒温核酸扩增
技术，在 60—65℃恒温条件下使用该技术，1 h内即
可完成对靶标物的扩增和检测。目前 LAMP技术在植
物线虫快速检测中已得到广泛应用。Kikuchi 等[23]开
发出松材线虫（Bursaphelenchuh xylophilus）LAMP
快速检测体系，能在 1 h内从病木中检测出松材线虫；
Niu等[24]开发出南方根结线虫的 LAMP检测体系，能
够从根结中直接检测南方根结线虫；Niu 等[25]根据象
耳豆根结线虫 IGS 的差异建立了 LAMP 检测体系；
Peng 等[26]建立了从罹病植物组织中检测香蕉穿孔线
虫（Radopholus similis）的 LAMP检测体系。【本研
究切入点】目前针对象耳豆根结线虫的快速分子检测
体系已有多次报道，但其检测的靶基因主要为 IGS和
mtDNA，以象耳豆根结线虫 ITS为靶标的快速分子检
测尚未见报道。【拟解决的关键问题】探索以象耳豆
根结线虫核糖体 DNA-ITS区为新靶标，建立一种能够
从罹病植物组织中检测象耳豆根结线虫的LAMP检测
方法，以期丰富象耳豆根结线虫分子检测手段，为该
病害的田间检测和监测提供有力的技术支持。
1 材料与方法
试验于 2010年 5月至 2011年 12月在中国农业科
学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验
室完成。
1.1 供试线虫
本研究所用植物线虫种群从全国各地采集，并由
本实验室分离纯化，在中国农业科学院植物保护研究
所温室扩繁保存（表 1）。
1.2 试剂
rTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker购自宝
生物工程（大连）有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒
和 DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限
公司；pGEM-Teasy克隆载体购于美国 Promega公司；
蛋白酶 K购自德国 Roche 公司；SYBR GreenⅠ购自
美国 Invitrogen 公司；甜菜碱购自美国 Sigma公司；
536 中 国 农 业 科 学 46卷
表 1 线虫种类
Table 1 Nematode species
样品代号
Code
群体种类
Species
采样地点
Origin of
population
寄主植物
Host plant
样品来源
Sample origin
MEDT 象耳豆根结线虫M. enterolobii 海南 Hainan 光棍树
Euphorbia tirucalli
本实验室采集 Collected by our laboratory
MEXED 象耳豆根结线虫M. enterolobii 海南 Hainan 象耳豆
Pacara earpod tree
本实验室采集 Collected by our laboratory
MIDX 南方根结线虫M. incognita 北京 Beijing 番茄 Tomato 本实验室采集 Collected by our laboratory
MILF 南方根结线虫M. incognita 河北 Hebei 黄瓜 Cucumber 本实验室采集 Collected by our laboratory
MILH 南方根结线虫M. incognita 北京 Beijing 芦荟 Aloe 本实验室采集 Collected by our laboratory
MJYN 爪哇根结线虫M. javanica 云南 Yunnan 番茄 Tomato 云南农业大学胡先奇教授馈赠
Provided by professor Hu Xian-qi of Yunnan Agricultural University
MAYC 花生根结线虫M. arenaria 云南 Yunnan 烟草 Tobacco 云南农业大学胡先奇教授馈赠
Provided by professor Hu Xian-qi of Yunnan Agricultural University
MHYJ 北方根结线虫M. hapla 北京 Beijing 月季 Chinese rose 本实验室采集 Collected by our laboratory
MHYN 北方根结线虫M. hapla 云南 Yunnan 花生 Peanut 云南农业大学胡先奇老师馈赠
Provided by professor Hu Xian-qi of Yunnan Agricultural University
AMRS 香蕉穿孔线虫
R. similis
澳门 Aomen 红掌 Anthium 深圳动植物检疫局李一农老师馈赠
Provided by Li Yi-nong of Shenzhen Animal and Plant Quarantine Bureau
PLD 短体线虫 Pratylenchus coffeae 海南 Hainan 露兜 Pandanus 本实验室采集 Collected by our laboratory
DdCL 甘薯茎线虫 Ditylenchus destructor 河北 Hebei 甘薯 Sweet potato 本实验室采集 Collected by our laboratory
GS-14 大豆孢囊线虫 Heterodera glycines 甘肃 Gansu 大豆 Soybean 本实验室采集 Collected by our laboratory
GS-11 禾谷孢囊线虫 H. avenae 甘肃 Gansu 小麦Wheat 本实验室采集 Collected by our laboratory
BX 松材线虫
B. xylophilus
- - 南京农业大学李红梅教授馈赠
Provided by professor Li Hong-mei of Nanjing Agricultural University

Bst DNA 聚合酶大片段购自美国 NEB公司；LFD试
纸购自德国Milenia Biotec公司。
1.3 方法
1.3.1 线虫DNA提取 DNA提取方法参考万新龙等[27]
的方法略有改动。在显微镜下挑取单头供试线虫放入
装有 10 L ddH2O的 0.2 mL离心管中，加入 8 L的
10×PCR buffer溶液（TaKaRa），2 L蛋白酶 K溶
液，采用冻融法反复冻融6—7次，-80℃下保存30 min，
65℃温育 90 min，95℃反应 10 min，反应完成后，
12 000 r/min离心 1 min，上清液作为线虫 DNA模板
直接用于 LAMP和 PCR反应。
1.3.2 象耳豆根结线虫 rDNA-ITS 扩增 采用
rDNA-ITS区的通用引物[28]，以基因组 DNA为模板，
PCR 扩增根结线虫种群 ITS 区。PCR 反应体系：
10×Buffer（含Mg2+）5 µL，10 mmol·L-1 dNTP 4 µL，
引物 rDNA1和 rDNA2（10 μmol·L-1）各 1 µL，rTaq
酶（5 U·µL-1，TaKaRa）2.5 U，模板 DNA 5 µL，ddH2O
补足至 50 µL。扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，
54℃ 30 s， 72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min；
4℃保存。扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，EB
染色，回收、连接、转化按照试剂盒说明书进行，阳
性克隆经菌液 PCR 验证后送北京六合华大科技有限
公司测序。
1.3.3 LAMP 引物的设计 根据象耳豆根结线虫
rDNA-ITS测序结果，同时从 NCBI下载 10种其它
根结线虫 ITS 序列，采用 MEGA4.0[29]比对分析根
结线虫 rDNA-ITS 差异性。根据分析结果，采用
PrimerExplorerV4软件（http://primerexplorer.jp）设计
LAMP 引物（表 2）。引物由上海生工生物工程技术
服务有限公司合成。
1.3.4 LAMP 反应体系建立 LAMP 反应条件参照
Notomi 等[22]所述，对反应中起关键作用的 Mg2+、
dNTPs、甜菜碱的浓度和反应时间等条件进行优化。
反应体系包括外引物 MEF3 和 MEB3 各 0.2
μmol·L-1，内引物MEFIP和MEBIP各 1.6 μmol·L-1，
环引物MELB为 0.4 μmol·L-1，dNTPs（0、0.4、0.8、
1.2、1.6、2.0、2.4 mmol·L-1），20 mmol·L-1 Tris-HCl
（pH 8.8），10 mmol·L-1 KCl，MgSO4（2.0、3.0、4.0、
3期 何旭峰等：植物罹病组织中象耳豆根结线虫的 LAMP快速检测方法 537
5.0、6.0、7.0、8.0 mmol·L-1），10 mmol·L-1 (NH4)2SO4，
0.1% Triton x-100，甜菜碱（0、0.1、0.2、0.3、0.4、
0.5、0.6、0.7 mol·L-1），8 U Bst DNA 聚合酶大片段，
1 µLDNA模板，用灭菌双蒸馏水补全到 25 µL。混合
均匀后，置于 60—65℃恒温水浴中保温 30—90 min，
82℃保温 5 min。
1.3.5 LAMP 扩增产物检测 LAMP 扩增产物检测采
用 3种方法。SYBR GreenⅠ显色法：LAMP反应结束
后，加入 2 µL 100×SYBR GreenⅠ，混匀后肉眼直接
观察颜色变化；琼脂糖凝胶电泳法：取 2 µL扩增产物
在 2%的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，结果在凝胶成
像系统中观察；LFD试纸法：采用 Primer 5.0软件在
F3和 B3序列之间设计探针引物，5′端用 FITC标记，
MEFIP引物的 5′端用生物素标记。LAMP反应结束后，
加入 5 µL FITC标记的探针（20 pmol·L-1），63℃保
温 5 min，冷却到室温。取 8 µL的杂交液加入 100 µL
PBS缓冲液中，混合均匀后将 LFD试纸浸入到杂交后
的溶液中，5 min后观察照相。
1.3.6 象耳豆根结线虫特异性检测 分别提取象耳
豆根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根
结线虫、北方根结线虫、香蕉穿孔线虫、短体线虫
（Pratylenchus coffeae）、甘薯茎线虫（Ditylenchus
destructor）、大豆孢囊线虫（Heterodera glycines）、
禾谷孢囊线虫（H. avenae）和松材线虫的基因组 DNA
（表 1）作为模板进行 LAMP 检测，同时使用 Long
等[19]的特异性引物（表 2）进行普通 PCR扩增，作为
对照，反应体系和反应条件参照 1.3.2所述。
1.3.7 象耳豆根结线虫灵敏度检测 将单头象耳豆
根结线虫雌虫 DNA 按 10 倍梯度稀释成 7 个浓度（1
—1.0×10-6）作为模板，按照 1.3.4 优化的体系进行
LAMP 反应和检测。同时以上述稀释 DNA 为模板，
以 MEF3 和 MEB3 为引物，进行常规 PCR 检测作为
对照，反应体系和条件参照 1.3.2所述。
1.3.8 罹病番茄根组织中象耳豆根结线虫的 LAMP 直
接检测 从人工接种象耳豆根结线虫和南方根结线虫
的番茄根系分别取 10 个根结，同时从温室培养的 5
种常见根结线虫（表 1）的番茄根部随机取 15个根结，
同时取健康番茄根作为阴性对照，将上述罹病根系的
根结和健康番茄根分别放入装有 17.5 μL的 10×PCR
buffer 的离心管中，加入 7.5 μL 的蛋白酶 K（600
μg·mL-1）和 25 μL无菌水，混合均匀后离心，放入液
氮中速冻，用研磨棒充分捣碎，点动离心后，将离心
管放入 65℃条件下温育 90 min，95℃下反应 10 min，
冷却至室温，12 000 r/min离心 1 min后的上清液即可
作为 DNA 模板进行 LAMP 试验和常规 PCR 检测，
以健康植物根的 DNA作为对照。

表 2 引物序列
Table 2 Primer sequences
引物名称
Primer name
序列（5′- 3′）
Sequence (5′-3′)
作用
Function
文献
Reference
rDNA1 TTGATTACGTCCCTGCCCTTT 根结线虫 ITS扩增
ITS amplification of root-knot nematodes
文献[28]
Reference [28]
rDNA2 TTTCACTCGCCGTTACTAAGG
Me-F AACTTTTGTGAAAGTGCCGCTG 象耳豆根结线虫特异性检测
Specific detection of M. enterolobii
文献[19]
Reference [19]
Me-R TCAGTTCAGGCAGGATCAACC
MEF3 GGCTGTATATGTGGTGACAT LAMP 本研究 This study
MEB3 AGTTCGCAAAACTTATCGC
MEFIP GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGAT
MEBIP AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA
MELB TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG
ME-FITC-Probe AGCCTTTCCGGTGGATCACT

2 结果
2.1 象耳豆根结线虫 ITS 序列分析及 LAMP 引物设计
采用通用引物扩增获得象耳豆根结线虫（MEDT
和MEXED）ITS序列长度为 770 bp，NCBI序列注册
号分别为 JX024149和 JX024150。Blast比对结果发现，
538 中 国 农 业 科 学 46卷
本研究的象耳豆根结线虫与已报道的象耳豆根结线虫
ITS序列（GenBank：JF309153和 JQ082448）相似性
为 99%，与其它的根结线虫 ITS区的相似性为 85%—
90%。根据象耳豆根结线虫 ITS 非保守序列和 LAMP
引物设计结果，获得 5条 LAMP引物，包括 2条外引
物（MEF3和MEB3）、2条内引物（MEFIP和MEBIP）
和 1条环引物（MELB）。同时采用 Primer5.0软件在
MEF3和MEB3之间设 1条杂交探针 Probe，5′端加上
FITC标记，MEFIP5′端采用生物素标记，用于扩增产
物的 LFD检测，具体见图 1和表 2所示。

MJ
MI
MA
MMI
MG
MH
MF
MET
MC
MMA
ME
MJ
MI
MA
MMI
MG
MH
MF
MET
MC
MMA
ME
MJ
MI
MA
MMI
MG
MH
MF
MET
MC
MMA
ME
73
73
73
76
74
74
79
74
78
76
73
147
147
147
151
153
147
152
147
155
147
145
226
226
226
230
232
226
231
226
234
226
224
FITC-probe
LB B2 B1
BlcFlc
F2F3


MJ：爪哇根结线虫（AY438555）；MI：南方根结线虫（JQ405212）；MA：花生根结线虫（AY438554）；MMI：微小根结线虫（GU432775）；
MG：水稻根结线虫（HM623442）；MH：北方根结线虫（AF516722）；MF：伪哥伦比亚根结线虫（AY281853）；MET：埃塞俄比亚根结线虫（EU204644）；
MC：奇诺伍德根结线虫（MCU96302）；MMA：马里兰根结线虫（JN241880）
MJ: M. javanica (AY438555); MI: M. incognita (JQ405212); MA: M. arenaria (AY438554); MMI: M. minor (GU432775); MG: M. graminicola (HM623442);
MH: M. hapla (AF516722); MF: M. fallax (AY281853); MET: M. ethiopica (EU204644); MC: M. chitwoodi (MCU96302); MMA: M. marylandi (JN241880)

图 1 象耳豆根结线虫 LAMP 引物设计位点
Fig. 1 Design for M. enterolobii specific LAMP primers based on rDNA-ITS sequences

2.2 象耳豆根结线虫 LAMP 反应体系优化
Mg2+浓度优化结果表明，当 Mg2+的浓度在 2.0—
8.0 mmol·L-1 时，LAMP 扩增效率呈现先增高后降低
（图 2-A）。反应体系中Mg2+浓度为 2.0、3.0 mmol·L-1
时，没有检测到扩增产物，Mg2+浓度为 4.0 mmol·L-1
时，可以检测到少量扩增产物，Mg2+浓度为 5.0
mmol·L-1时，LAMP 扩增效率最高；Mg2+浓度增加到
6.0、7.0和 8.0 mmol·L-1时，扩增效率随之降低，由此
确定 ME-LAMP 反应体系中 Mg2+浓度的最佳浓度为
5.0 mmol·L-1。在 dNTPs浓度为 0—2.4 mmol·L-1的条
件下，LAMP 扩增效率呈现逐渐提高（图 2-B）。在
dNTPs 浓度为 0—1.6 mmol·L-1 时没有扩增条带，当
dNTPs浓度为 2.0 mmol·L-1时，可以观察到微弱条带，
在 dNTPs浓度为 2.4 mmol·L-1时可以看到清晰、较亮
3期 何旭峰等：植物罹病组织中象耳豆根结线虫的 LAMP快速检测方法 539
的特异性条带，由此确定，本反应体系的 dNTPs的最
佳浓度为 2.4 mmol·L-1。在甜菜碱浓度为 0—0.6
mmol·L-1 的条件下（图 2-C），随着甜菜碱浓度的增
加，LAMP扩增产物随之减少，在甜菜碱浓度为 0的
条件下扩增效率最强，因此本体系中不需要添加甜菜
碱。反应时间为 15 min 时，没有 LAMP 扩增产物，
反应 30 min后可以检测到大量的扩增产物，但随着时
间的进一步延长，扩增产物没有明显差异（图 2-D）。
为了保证试验结果的稳定，本试验选取的反应时间为
45 min。
综上所述，象耳豆根结线虫 LAMP检测方法，经
优化后的反应体系：Mg2+的浓度为 5.0 mmol·L-1、
dNTPs的浓度为 2.4 mmol·L-1、不添加甜菜碱、反应时
间为 45 min。

M 21 3 4 5 6 7 8
2000
1000
750
500
250
100
bp
C M 1 2 3 4 5 6 7 8
500
bp
100
250
1000
2000
750
D M 1 2 3 4 5 6
2000
1000
750
500
250
100
bp
B
2000
1000
750
500
250
100
bp
A M 1 2 3 4 5 6 87

M：D2000 DNA标准分子量；A：1—7代表镁离子浓度分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和 8.0 mmol·L-1的 LAMP扩增结果，8：无模板对照；B：
1—7代表 dNTPs浓度分别为 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和 2.4 mmol·L-1的 LAMP扩增结果，8：无模板对照；C：1—7代表甜菜碱浓度分别为 0、
0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和 0.6 mmol·L-1的 LAMP扩增结果，8：无模板对照；D：1—5代表时间分别为 15、30、45、60和 75 min的 LAMP检测结
果，6：无模板对照
M: Marker D2000; A: 1-7 stand for the Mg2+ concentrations were 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 and 8.0 mmol·L-1, respectively, 8: Negative control with no template
DNA in reaction; B: 1-7 stand for the dNTPs concentrations were 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0 and 2.4 mmol·L-1, respectively, 8: Negative control with no template
DNA in reaction; C: 1-7 stand for the betain concentrations were 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 and 0.6 mmol·L-1, 8: Negative control with no template DNA in
reaction; D: 1-5 stand for the reaction times were 15, 30, 45, 60 and 75 min, respectively, 6: Negative control with no template DNA in reaction

图 2 象耳豆根结线虫 LAMP 反应 Mg2+（A）、dNTPs（B）、甜菜碱（C）的浓度及反应时间（D）优化
Fig. 2 Optimization of the concentrations of Mg2+ (A), dNTPs (B), betain (C) and reaction time (D) for LAMP reaction

2.3 象耳豆根结线虫 LAMP 检测体系建立
采用优化的 LAMP扩增体系，检测 2个象耳豆根
结线虫种群。2个象耳豆根结线虫种群的 LAMP扩增
产物采用 3种方法均能够成功检测：向 LAMP反应产
物中加入 SYBR GreenⅠ染料，肉眼观察发现，阳性
结果呈现绿色，阴性对照则呈现橘红色（图 3-A）；
LAMP 反应产物在 2%琼脂糖凝胶上分离，阳性结果
可见 LAMP扩增的特异性的梯形条带，阴性结果则无
条带（图 3-B）；LFD 试纸的检测结果显示，阳性结
果可以看到试纸条上同时出现 2个检测条带，而阴性
结果只有 1个带（图 3-C）。
2.4 象耳豆根结线虫 LAMP 特异性检测
以 5 种根结线虫和 6 种其它植物线虫 DNA 为模
板，进行 LAMP和 PCR扩增，测试 ME-LAMP检测
体系的特异性。结果表明，只有在以象耳豆根结线虫
DNA 为模板的 LAMP 反应中才能检测到扩增产物，
其它植物线虫均未检测到扩增产物（图 4-A）。同时
采用象耳豆根结线虫特异性引物进行 PCR 反应验证
（图 4-B），PCR 扩增也只在象耳豆根结线虫中有大
小约为 300 bp的条带，其它样品均无扩增结果。LAMP
540 中 国 农 业 科 学 46卷


A：SYBR GreenⅠ检测；B：电泳检测；C：LFD试纸检测；M：DNA标准分子量 DL 2000。1：象耳豆根结线虫MEDT群体；2：象耳豆根结线虫
MEXED群体；3：无模板对照
A: LAMP products were detected by SYBR GreenⅠ; B: LAMP products were detected by Gel electrophoresis; C: LAMP products were detected by LFD; M:
Marker DL2000. 1: MEDT; 2: MEXED; 3: Negative control with no template DNA in reaction

图 3 象耳豆根结线虫 LAMP 体系建立及扩增产物检测
Fig. 3 The detection results of M. enterolobii by LAMP

1000
2000
750
500
250
100
bp
A 3 5 7 11 13 15 16M 1 2 4 6 8 9 10 12 14
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16B
2000
1000
750
500
250
100
bp

M：D2000 DNA标准分子量；1：MEDT；2：MEXED；3：MIDX；4：MILF；5：MILH；6：MJYN；7：MAYC；8：MHYJ；9：MHYN；10：AMRS；
11：PLD；12：DdCL；13：GS-14；14：GS-11；15：BX；16：阴性对照
M: Marker D2000; 1：MEDT; 2: MEXED; 3: MIDX; 4: MILF; 5: MILH; 6: MJYN; 7: MAYC; 8: MHYJ: 9: MHYN; 10: AMRS; 11: PLD; 12: DdCL; 13:
GS-14; 14: GS-11; 15: BX; 16: Negative control without template DNA in reaction

图 4 象耳豆根结线虫 LAMP 法（A）和特异性引物（B）特异性检测结果
Fig. 4 The specificity results of M. enterolobiiby LAMP (A) and specific primers (B)

扩增结果与 PCR特异性扩增结果完全一致，由此确定
本研究建立的象耳豆根结线虫LAMP检测法具有很高
的特异性。
2.5 象耳豆根结线虫 LAMP 法灵敏度检测
将象耳豆根结线虫单头雌虫DNA按照 10倍梯度
进行稀释作为模板进行 LAMP 和 PCR 扩增，检测和
比较 LAMP检测方法的灵敏度。结果表明，单头线虫
DNA在稀释到 10-4后，仍能够检测到扩增产物，继续
将 DNA浓度稀释到 10-5后，没有检测到 LAMP扩增
产物（图 5-A）；普通 PCR 扩增结果显示，当模板
3期 何旭峰等：植物罹病组织中象耳豆根结线虫的 LAMP快速检测方法 541
DNA稀释到 10-2倍时，可看到微弱的条带，继续稀释
时则不能检测（图 5-B）。由此可见象耳豆根结线虫
LAMP检测的最低模板阈值为 1/200000头根结线虫雌
虫 DNA，PCR检测的最高灵敏度为 1/2000头根结线
虫雌虫 DNA，由此可见，LAMP检测方法比常规 PCR
的灵敏度至少高 100倍，具有极高的检测灵敏度。

M 1 2 3 4 5 76 31 2M 654 7
2000
1000
750
500
250
100
bp
2000
1000
750
500
250
100
bp
A B



M：D2000 DNA标准分子量；1—7模板浓度分别为：单头线虫、 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和阴性对照
M: Marker D2000; 1-7: Template concentration: Single nematode, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, negative control with no template DNA in reaction

图 5 象耳豆根结线虫 LAMP（A）和常规 PCR 检测方法（B）的灵敏度检测结果
Fig. 5 The sensitivity detection of M. enterolobii by LAMP (A) and PCR (B)

2.6 罹病番茄根组织中象耳豆根结线虫的 LAMP 直接
检测
对人工接种番茄培养的象耳豆根结线虫和南
方根结线虫的根结进行 LAMP 和 PCR 检测结果表
明，从人工接种象耳豆根结线虫的番茄根部获得的
10个根结，采用 LAMP法检测，用 SYBR GreenⅠ、
电泳检测、LFD 试纸 3 种方法进行观测，均显示
阳性结果，接种南方根结线虫植株的根结和健康的
植株均显示阴性。而用 PCR扩增方法，从 10个象
耳豆根结线虫的根结中仅成功检测出 7个为阳性，
南方根结植株的根结和健康的植株均显示阴性（表
3）。

表 3 LAMP 和 PCR 法从植物根结中直接检测象耳豆根结线虫的结果
Table 3 Detection of M. enterolobii from plant knots using LAMP and PCR
LAMP检测 LAMP detection 样本
Sample
根结内雌虫数目（平均数）
Female M. enterolobii number
in root-knot (average)
SYBR green I 电泳检测
Electrophoresis detection
LFD
PCR检测
PCR detection
Me 根结 Me root-knot 1.43 10/10 10/10 10/10 7/10
Mi 根结 Mi root-knot 1.34 0/10 0/10 0/10 0/10
健康植株根 Root of healthy plant - 0/10 0/10 0/10 0/10

随机检测 15个根结的结果表明，在象耳豆根结线
虫 LAMP检测为阳性的 3个根结中，PCR检测也获得
阳性结果（图 6）。由此确定本研究建立的象 LAMP
检测体系能够直接中根结中直接检测象耳豆根结线
虫，具有很高的实际应用价值。
3 讨论
3.1 建立象耳豆根结线虫 LAMP 检测方法的作用及意
义
象耳豆根结线虫分布广泛，在中国南方地区发生
较广，且危害严重，由于其能抵御 Mi 基因的抗性，
因此严重制约着抗性品种在中国南方地区的推广和应
用。如何简便、快捷、有效地检测象耳豆根结线虫，
是亟待解决的技术难题。本研究以 rDNA-ITS 序列作
为靶基因，通过一系列完整实验，建立了简便、快速、
灵敏度高、特异性强等特点的、直接从植物根结中检
测象耳豆根结线虫 LAMP检测方法，能够在 1 h内直
接从植物根结中检测该线虫。该检测方法的建立对象
542 中 国 农 业 科 学 46卷
1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1514 162A
B
2000
1000
750
500
250
100
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16


M：D2000 DNA标准分子量；1—15：从植物根结中检测随机抽取的根结样品；16：阴性对照
M: Marker D2000; 1-15: The random samples from plant knot; 16: The negative control with no template DNA

图 6 LAMP（A）和 PCR（B）法从植物根结中直接检测象耳豆根结线虫
Fig. 6 Detection of M. enterolobii from diseased plant tissues using LAMP (A) and PCR (B）

耳豆根结线虫的发生分布和监测具有重要的意义，在
农业生产一线和口岸检测中具有很大的应用前景。
由于象耳豆根结线虫 ITS，IGS及 mtRNA与其它
根结线虫差异较大[4,11,18]，象耳豆根结线虫 ITS序列比
对结果表明，它与其它根结线虫的相似性为 85%—
90%（图 1），Brito等认为，核糖体 DNA-ITS序列是
象耳豆根结线虫分子检测的潜在靶标[11]。目前已开发
的象耳豆根结线虫快速分子检测体系中，主要以 IGS、
mtDNA和RAPD特异性片段等为检测靶基因[4,10,18-20]。
本研究开发的象耳豆根结线虫 LAMP 检测方法是以
rDNA-ITS序列作为靶基因，从 rDNA-ITS的 7个位点
上设计出 5条引物，相对于常规 PCR的 2条引物而言，
极大的提高了特异性。以象耳豆根结线虫 ITS为靶基
因开发出快速分子检测技术尚未见报道。
3.2 本研究建立的象耳豆根结线虫 LAMP 检测方法的
特点
本研究建立的直接从植物根结中检测象耳豆根结
线虫 LAMP 检测方法，具有以下特点：（1）快速、
便捷、准确。只需要 45 min 即可完成反应，比常规
PCR 检测节省 2 h以上，而且对仪器设备要求低，不
需要 PCR仪、凝胶电泳和成像系统等昂贵仪器，使用
水浴锅即可完成检测。反应结果可以加入荧光染料，
通过肉眼观察即可判定结果。同时，运用 LFD试纸对
LAMP检测结果进行验证，通过特异性探针和 LAMP
扩增产物杂交后，插入横向流动试纸，通过试纸的指
示带即可判定结果，该方法可以有效的避免由于非特
异性扩增或引物二聚体而出现的假阳性结果，极大的
提高了检测的准确度。
（2）灵敏度高。相比常规 PCR检测方法，象耳豆
根结线虫 LAMP检测具有更高的灵敏度。象耳豆根结
线虫LAMP法检测极限可低至 1/200000头线虫DNA，
采用MEF3/MEB3为引物的 PCR检测灵敏度为 1/2000
头线虫，相比而言 LAMP 法的灵敏度比常规 PCR 高
100倍。比 Tigano等采用 SCAR标记引物检测象耳豆
根结线虫的检测灵敏度为单头线虫 DNA[21]，灵敏度则
更高。Niu 等报道的以 IGS 为靶基因的象耳豆根结线
虫 LAMP法的灵敏度为 1/2000头线虫 DNA[25]。与其
它植物线虫 LAMP 检测方法相比，松材线虫 LAMP
检测的灵敏度为 1/25000头线虫 DNA[23]，香蕉穿孔线
虫 LAMP 检测方法的灵敏度为 1/20000 头线虫
DNA[26]。可见，本研究建立的象耳豆根结线虫 LAMP
检测方法的灵敏度极高，能够检测到痕量的象耳豆根
结线虫 DNA。
（3）特异性强。在特异性检测结果中，本研究
建立的 LAMP检测方法能够特异的扩增象耳豆根结
线虫，其它 4 种常见根结线虫和 6 种植物线虫均未
检测到阳性结果，具有较高的的特异性。不足的是，
本研究只检测了根结线虫的 5 个种，较之于目前已
3期 何旭峰等：植物罹病组织中象耳豆根结线虫的 LAMP快速检测方法 543
报道的 106 个根结线虫种而言，样本量相对偏小。
在下一步工作中将检测更多的样品，以确保该方法
的特异性。
（4）DNA提取简便快速。本研究只利用了 PCR
buffer和蛋白酶 K溶液，2 h即可从植物根结组织中
即可分离象耳豆根结线虫 DNA，进行 LAMP和 PCR
检测。结果表明 LAMP 检测方法从 10 个含有象耳
豆根结线虫的根结中均检测阳性结果，成功率为
100%，而 PCR 检测只成功的检测到 7 个，在含有
南方根结线虫根结和健康的植物均为阴性结果，其
结果与 Niu 等的报道类似[24]。目前已有多个从植物
组织中提取线虫 DNA的报道，Rahman等[30]从植物
组织中提取线虫 DNA时，需要配制 DNA抽提缓冲
液，加入蛋白酶 K、醋酸钾、SDS、异丙醇等多种
分离试剂，样品还需 65℃过夜，后续操作还需要苯
酚抽提纯化等步骤，Hu等[12]从根结中提取根结线虫
DNA 的方法需要和 KOD 高保真 DNA 聚合酶配合
使用，相比而言，本研究采用的方法更为简便快速
有效。
3.3 LAMP 检测中应特别注意的问题
由于 LAMP反应具有极高的扩增效率（109/h），
反应完成后，开盖加入 SYBR GreenⅠ等荧光染料过
程中，气溶胶容易扩散到空气中，造成实验室污染，
影响后续 LAMP检测的结果，因此建议在通风橱中进
行操作，反应液中加入少量石蜡油密封等步骤可以有
效的避免假阳性的出现。
4 结论
以 rDNA-ITS 序列为靶基因建立的象耳豆根结线
虫 LAMP检测方法，在Mg2+的浓度为 5.0 mmol·L-1、
dNTPs的浓度为 2.4 mmol·L-1、不添加甜菜碱、反应时
间为 45 min的条件下，扩增效率最优。能够在 1 h内
直接从罹病植物组织中检测到象耳豆根结线虫，具有
极高的特异性，检测灵敏度可以达到 1/200000头线虫
DNA，从根结中直接检测象耳豆根结线虫的检出率为
100%，结果可通过肉眼直接观察，不需要特殊的设备。
该检测体系在田间和口岸的象耳豆根结线虫检测中具
有较广泛的应用前景，将为象耳豆根结线虫的检测和
监测提供有力的技术手段。

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（责任编辑 岳梅）