全 文 ：△通信作者。E － mail:jasmvip@ 163． com
毒扁豆碱对异氟醚麻醉后大鼠海马炎性反应、
caspase － 3 表达及认知功能的影响
杨锋，李玉兰△，刘玉强，刘景景
兰州大学第一医院麻醉科(兰州 730000)
【摘要】 目的 探讨毒扁豆碱对异氟醚麻醉后大鼠海马炎性反应、caspase － 3 表达及认知功能的影响。方法
2 月龄 SD大鼠 80 只，体重 280 ～ 320 g，分为 4 组( n = 20) : C组吸入含有 30%氧气的空氧混合气体 6 h; I组吸入
1. 4%的异氟醚 6 h; PI组与 P组腹腔注射毒扁豆碱 100 μg /kg，每 8 h 1次，共 3次，首次给药后，PI组吸入 1. 4%的异
氟醚 6 h，P组吸入同浓度载气 6 h。麻醉结束行动脉血气分析，12 h后取海马组织 ELISA法检测 TNF － α、IL － 1β、
IL － 6 含量，RT － PCR法检测 caspase － 3 mRNA的表达。光镜下观察海马 CA1 区锥体细胞形态学变化;麻醉后第
2 ～ 7 天评估认知功能。结果 4 组间血气水平差异无统计学意义( P ＞ 0. 05) 。与 C、P 组比较，I、PI 组 IL － 1β、
IL － 6 含量及 caspase － 3 mRNA水平升高，逃避潜伏期延长，探索时间缩短( P ＜ 0. 05) ，海马 CA1 区锥体细胞凋亡
增多;与 I组比较，PI组 IL － 1β、IL － 6 含量及 caspase － 3 mRNA表达降低( P ＜ 0. 05) ，逃避潜伏期缩短，探索时间
延长( P ＜ 0. 05) ，CA1 区锥体细胞凋亡减少。P组与 C组比较差异无统计学意义( P ＞ 0. 05) 。TNF － α在 4 组间差
异无统计学意义( P ＞ 0. 05) 。结论 毒扁豆碱可改善异氟醚麻醉引起的大鼠认知功能损害，其机制可能与抑制海
马炎性反应及神经元凋亡有关。
【关键词】 毒扁豆碱; 异氟醚; 炎症; 凋亡; 认知
术后认知功能障碍是老年患者术后常见的并发
症，临床表现为以记忆力下降为主的认知功能减退。
研究［1］表明，异氟醚麻醉后认知功能障碍发生率较高，
其机制可能与异氟醚麻醉使脑内乙酰胆碱递质水平下
降及异氟醚诱发的脑部炎症反应导致的神经元损伤及
凋亡有关。毒扁豆碱是从非洲毒扁豆中提取的一种生
物碱，为一类可透过血脑屏障的抗胆碱酯酶药。近年
的研究［2］表明，毒扁豆碱作用广泛，除了传统的抑制胆
碱酯酶活性外，尚有抑制中枢炎症反应、抑制细胞凋亡
等作用。在异氟醚麻醉时，给予毒扁豆碱能否预防或减
轻其诱发的中枢炎症反应及神经元凋亡从而改善认知
尚未见报道。2013年 10 月至 2014 年 3 月，本研究拟探
讨异氟醚麻醉时毒扁豆碱对大鼠海马炎症反应、神经元
凋亡及认知功能的影响。
1 材料与方法
1． 1 动物选择与分组 健康雄性清洁级 SD 大鼠 80
只，2 月龄，体重 280 ～ 320 g，由甘肃省中医学院实验动
物中心提供。采用随机数字表法，将大鼠分为 4 组
(n = 20):C组吸入含有 30%氧气的空氧混合气体 6
h;I组吸入 1. 4%异氟醚(美国 Baxter 公司)6 h;PI 组
腹腔注射 100 μg /kg 毒扁豆碱(上海伊卡生物 批号
EKKS1016)，每 8 h 1 次，共 3 次，第 1 次给药后立刻置
于麻醉箱中吸入 1. 4%异氟醚 6 h;P 组同上方法给予
毒扁豆碱，第 1 次给药后吸入含有 30%氧气的空氧
混合气体 6 h，麻醉箱放入 35℃恒温箱内与麻醉机相
连，以含 30%的空氧混合气体作为载气，通气流量为
2 L /min。
1． 2 标本及指标测定 (1)麻醉结束每组随机取 5 只
大鼠，用 32 号针头取左心室血液 200 μL，应用 I －
STAT便携血气分析仪(雅培公司，美国)测定血糖水
平，并行血气分析。(2)麻醉结束后第 12 小时，每组取
5 只大鼠，腹腔注射 0. 3 mL /100 g水合氯醛，待大鼠翻
正反射消失后，提尾断头打开颅腔，取出脑组织，于冰
上迅速分离一侧大脑海马，液氮速冻后 － 80℃冰箱保
存，另一侧大脑半球用 4%甲醛固定 24 h，经脱水、透
明、浸蜡、包埋后，沿视交叉后 4 mm行连续冠状切片，
切片行 HE染色后观察海马 CA1 区锥体细胞形态及数
量变化。(3)一侧冷冻海马组织经匀浆、离心后取上
清液，采用 ELISA 法测定 TNF － α、IL － 1、IL － 6 的含
量，试剂盒购自南京建成生物工程公司。(4)采用 RT －
PCR 法测定海马组织 caspase － 3 mRNA 的表达。
caspase － 3 上游引物 5 － GCAGCAGCCTCAAATTGTT-
GACTA －3，下游引物 5 － TGCTCCGGCTCAAACCATC －
3，扩增片段长度 147 bp。以 β － actin 作为内参，β －
actin上游引物 5 － TGACAGGATGCAGAAGGAGA － 3，
下游引物 5 － TAGAGCCACCAATCCACACA － 3，扩增
片段长度 104 bp。所有引物由上海生工生物工程有限
公司合成。反应体系:5 × 逆转录 buffer 4 μL，oligo
(dT)0. 5 μL，dNTPs 0. 5 μL，逆转录酶 MMLV 1 μL，
DEPC处理水 10 μL，RNA 模板 4 μL，总体积 20 μL。
反应条件:37℃1 h，95℃ 5 min，灭活 MMLV。PCR 扩
增条件:95℃变性 15 min 后，按 94℃ 15 s，55℃ 30 s，
72℃ 32 s，扩增 45 个循环，最后 72℃延伸 5 min。采用
ABI － 7500 Real － Time 检测仪(ABI 公司，美国)自带
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DOI:10.13820/j.cnki.gdyx.2015.03.008
软件进行分析，以 2 －△△CT反应 caspase － 3 mRNA 的表
达水平。
1． 3 认知功能测定 每组剩余 10 只大鼠于第 2 ～ 7
天进行 Morris 水迷宫实验。Morris 水迷宫为直径 120
cm、高 50 cm的圆形水池，水色为不透明黑色，在水池
边缘上等距离设东、西、南、北 4 个标记点，将水池分为
4 个象限。水池水深 30 cm，在第三象限正中距池壁 30
cm放圆形透明站台，水面高出站台表面 1． 5 cm。水温
控制在 22 ～ 23℃。以大鼠入水至找到平台的时间为
逃避潜伏期，将 60 s 内找不到平台的大鼠置于平台上
停留 10 s，潜伏期记为 60 s。连续训练 5 d，4 次 /d，每
次从不同的象限采用随机入水点，取每天测试的平均
值作为学习记忆成绩。第 7 天撤去平台，各组从同一
入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录探索时间(大鼠
60 s内在平台所在象限的停留时间)。
1． 4 统计学方法 采用 SPSS 13. 0 统计软件，计量资
料组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用重复
测量设计的方差分析。
2 结果
2． 1 4 组大鼠动脉血气指标和血糖水平比较 4 组间
动脉血气指标和血糖水平差异无统计学意义(P ＞
0. 05)，见表 1。
2． 2 4组大鼠 TNF －α、IL －1β、IL －6含量及 caspase －3
mRNA表达比较 与 C 组和 P 组比较，I 和 PI 组海马
IL －1β、IL －6含量升高，caspase －3表达上调(P ＜0. 05);
表 1 4 组大鼠动脉血气指标和血糖水平比较(n = 5) 珋x ± s
组别 pH值
PaCO2
(mmHg)
PaO2
(mmHg)
血糖
(mmol /L)
C组 7． 36 ± 0． 03 35． 8 ± 4． 4 103 ± 6 4． 8 ± 0． 7
I组 7． 31 ± 0． 05 38． 1 ± 3． 0 98 ± 8 4． 4 ± 0． 5
P组 7． 33 ± 0． 05 36． 5 ± 4． 1 100 ± 5 4． 2 ± 0． 7
PI组 7． 32 ± 0． 07 37． 2 ± 4． 0 99 ± 7 3． 9 ± 0． 8
与 I 组比较，PI 组海马 IL － 1β、IL － 6 含量降低，
caspase － 3 表达下调(P ＜ 0. 05)，P组与 C 组上述指标
差异无统计学意义(P ＞ 0. 05)，4 组间 TNF － α 含量差
异无统计学意义(P ＞ 0. 05)。见表 2。
表 2 4 组大鼠 TNF － α、IL － 1β、IL － 6 含量及
caspase － 3 mRNA表达比较(n = 5) 珋x ± s
组别
TNF － α
(pg /g)
IL － 1β
(pg /g)
IL － 6
(pg /g)
caspase － 3
mRNA
C组 128 ± 20 106 ± 20 45 ± 6 1． 00 ± 0． 00
I组 136 ± 14 167 ± 26＊▲ 82 ± 7＊▲ 3． 26 ± 0． 31＊▲
P组 124 ± 16 98 ± 13 43 ± 5 0． 97 ± 0． 23
PI组 131 ± 13 140 ± 21＊△▲ 67 ± 5＊△▲ 1． 78 ± 0． 20＊△▲
* 与 C组比较 P ＜0. 05;△与 I组比较 P ＜ 0. 05;▲与 P组比较 P ＜
0. 05
2． 3 4组大鼠认知功能比较 与 C组和 P组比较，I和
PI组第 4 ～ 6 天逃避潜伏期延长，探索时间缩短(P ＜
0. 05);与 I组比较，PI 组第 4 ～ 6 天逃避潜伏期缩短，
探索时间延长(P ＜ 0. 05)，P组与 C组逃避潜伏期及探
索时间的差异无统计学意义(P ＞ 0. 05)，见表 3。
表 3 4 组大鼠认知功能的比较(n = 10) (珋x ± s)s
组别
逃避潜期
第 2 天 第 3 天 第 4 天 第 5 天 第 6 天
探索时间
(第 7 天)
C组 51 ± 6 42 ± 5 30 ± 4 20 ± 5 11 ± 2 38 ± 2
I组 55 ± 4 44 ± 6 42 ± 3＊▲ 38 ± 5＊▲ 19 ± 4＊▲ 25 ± 3＊▲
P组 50 ± 5 41 ± 3 28 ± 3 19 ± 6 8 ± 3 40 ± 3
PI组 53 ± 2 44 ± 3 32 ± 3＊△▲ 27 ± 7＊△▲ 15 ± 5＊△▲ 32 ± 3＊△▲
* 与 C组比较 P ＜ 0. 05;△与 I组比较 P ＜ 0. 05;▲与 P组比较 P ＜ 0. 05
2． 4 海马 CA1 区锥体细胞形态学变化 C 组和 P 组
细胞形态完整、排列整齐紧密，神经细胞大小较均匀。
I组和 PI组 CA1 区神经元排列疏松，胞核深染、细胞核
固缩、核溶解现象增多，部分神经元有空泡形成，但 PI
组改变较 I组轻微。见图 1。
3 讨论
研究表明，1. 4%及更高浓度的异氟醚麻醉 6 h 可
导致啮齿类动物学习、记忆功能损伤［3］，故本研究中异
氟醚采用该剂量和时间处理大鼠，毒扁豆碱的给药途
径和剂量参照文献［4］。研究显示，异氟醚麻醉诱发大
鼠海马促炎性因子 TNF － α、IL －1β、IL －6和 caspase －3
表达上调呈动态变化，并且促炎因子和 caspase －3分别
A:C组;B:P组;C:PI组;D:I组
图 1 海马 CA1 区锥体细胞形态学变化(HE，× 400)
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在麻醉结束后 6 ～ 24 h和 2 ～ 12 h 表达接近峰值［5 － 7］，
因此本研究测定了麻醉结束后 12 h 大鼠海马中促炎
性因子的含量和 caspase － 3 的表达。
研究表明［8］，异氟醚可以剂量依赖性地抑制乙酰
胆碱(ACh)合成的限速酶———胆碱乙酰基转移酶活
性，降低大鼠海马 ACh 水平，导致认知功能损害。此
外，异氟醚麻醉导致的炎症反应亦与术后认知障碍关
系密切，特别是促炎因子 IL － 1β可能起重要的介导作
用。异氟醚麻醉诱发的炎症反应损伤了神经元功能，
抑制了长时程增强的形成，长时程增强被广泛认为是
增强学习记忆的细胞内机制，并且异氟醚麻醉诱发的
炎症反应诱导了 caspase － 3 激活，由此引起的神经细
胞凋亡亦可能是异氟醚麻醉造成术后认知功能障碍的
另一重要原因［9］。本研究中，与 C 组比较 I 组促炎因
子 IL － 1β、IL － 6 含量和 caspase － 3 表达升高，Morris
水迷宫测试中潜伏期延长，平台象限停留时间缩短，与
上述研究结果一致，但促炎因子 TNF － α 升高不明显，
差异无统计学意义，其机制有待继续探讨。
本研究中，与 I 组比较，PI 组海马促炎因子 IL －
1β、IL － 6 含量减少 caspase － 3 表达降低，Morris 水迷
宫认知功能测定潜伏期缩短，平台象限停留时间延长，
表明毒扁豆碱抑制了大鼠海马炎症反应及神经元凋
亡，改善了异氟醚麻醉导致的术后认知功能障碍。
毒扁豆碱是一类可以透过血脑屏障的胆碱酯酶抑
制剂，可以通过多种机制改善异氟醚麻醉造成的术后
认知功能障碍，在丙泊酚麻醉原理的研究中［10］，向志
愿者给予毒扁豆碱可导致听觉诱发电位、脑电双频谱
指数的变化。合适剂量的毒扁豆碱能够可逆性抑制胆
碱酯酶活性，减少胆碱酯酶对突触间隙 ACh 的水解，
升高 ACh递质水平，加强了 ACh 能神经的作用，从而
改善认知。近年胆碱能抗炎通路的发现证明 ACh 不
仅是一种重要的神经递质，亦是一种重要的抗炎介
质［1］。胆碱能抗炎通路是调节免疫系统的一种神经生
理机制，它通过迷走神经及其递质 ACh 与免疫系统相
互作用，广泛作用于肝、脾和胃肠道等网状内皮系统。
主要通过抑制核转录因子(NF － κB)及激活 Janus 激
酶 2 /转录激活因子 3 控制炎症反应。研究表明动物中
枢也存在与外周相似的胆碱能抗炎通路［11］，ACh 可与
小胶质细胞表面的 α7 烟碱型 ACh 受体结合，抑制促
炎因子的释放。因此，毒扁豆碱可以通过胆碱能抗炎
通路抑制促炎因子的释放，减轻促炎因子对神经细胞
的损伤及炎症介导的凋亡，改善认知。此外，研究表
明，乙酰胆碱酯酶(AChE)活性增加可促进细胞凋
亡［12］，该作用与其水解 ACh 作用无关。在凋亡过程
中，胆碱酯酶可进入细胞核，活化 caspase － 3 诱导凋亡
小体的形成，促进细胞凋亡。如果使用反义核酸的方
法来抑制 AChE 的表达，就可以挽救部分细胞免于凋
亡。毒扁豆碱可以通过抑制 AChE活性，减弱 AChE对
caspase － 3 的活化，减少神经元的凋亡，从而改善认知
功能。
综上所述，毒扁豆碱可改善异氟醚麻醉造成的术
后认知功能障碍，其机制可能与毒扁豆碱增加胆碱能
系统功能、抑制胆碱酯酶活性、抑制炎症反应减少细胞
凋亡有关。
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(收稿日期:2014 － 07 － 09 编辑:祝华)
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