全 文 ：紫花苜蓿杂交后代遗传变异的 AFLP分析
马向丽 ,毕玉芬 ,张凤仙
(云南农业大学 动物科技学院 ,云南 昆明　650201)
　　摘要:利用扩增片段长度多态性(AFLP)标记对德钦苜蓿♀×Acrora♂杂交组合的杂交亲本与杂
交 F1代 、F2代的遗传变异进行分析 ,结果如下:(1)36对引物中筛选出 4对引物 ,共检测到 199个扩增片
段 ,其中 ,有 172个多态性位点 ,多态性位点比率为 90.5%,可以用于杂种后代遗传变异分析;(2)与杂交
亲本比较 ,杂交 F1和杂交F 2代的 Nei基因多样性指数(H)、Shannon多样性信息指数和有效等位基因数
(Ne)发生了显著的变化 ,遗传多样性增大 ,杂交 F2代遗传变异程度最高 ,说明 F2代发生了较大的性状分
离;(3)杂交后代的基因分化系数(Gst)为 0.218 ,基因流(Nm)为 0.874 ,表明杂交子代出现了较高的遗
传分化;(4)杂交亲本及杂交后代遗传距离分布在 0.128 ～ 0.284 ,其中 ,F 1代与亲本的遗传距离最小 ,为
0.128 ,而 F2代与亲本之间的遗传距离最大 ,为 0.284。表明F 1群体变异较小 ,F 2群变异较大。依据 Nei′
s遗传距离系统树图可以看出 ,在杂交子代中 ,F1代群体与亲本的系统发育关系更为接近 。
　　关键词:紫花苜蓿;遗传变异;AFLP 标记
　　中图分类号:S 54;S 32　　文献标识码:A　　文章编号:1009-5500(2010)02-0050-06
　　紫花苜蓿(Medicago sat iva)起源于近东和中亚 ,
是世界上最重要的饲料作物 ,有“牧草之王”的美称[ 1] 。
云南是南方草地面积第 2大省 ,发展畜牧业需要大量
的豆科牧草 ,在云南苜蓿利用的主要限制因素是缺乏
适应当地耐酸 、耐瘠薄和耐干热条件的品种 。德钦野
生苜蓿(2n=4x=32)[ 2] 是云南发现的唯一成群落分布
的品种 ,生长在野生环境中 ,能适应本地环境 ,具有较
强的抗逆性。通过杂交选育利用特异遗传资源 ,将德
钦苜蓿抗性基因源转入到新品种中。毕玉芬 ,王小云
等[ 3-7]对云南德钦苜蓿资源开展了相关的研究 ,王小
云[ 7]通过人工杂交实现了德钦苜蓿与引进苜蓿遗传物
质的结合 , 2002 年获得 12个杂交组合的杂交种。并
通过自交于 2006年获得 F2代种子 ,形态学研究表明
F2代性状出现了很大的分离 。
　　收稿日期:2009-12-28;修回日期:2010-04-08
　　基金项目:国家自然科学基金项目“云南野生和逸生苜蓿
资源特异耐受性机理的研究”(30860198)资助
　　作者简介:马向丽(1980-), 女 , 湖北襄樊人 , 在读博士 , 研
究方向为牧草遗传育种。
E-mail:xfmaxiang li@126.com
毕玉芬为通讯作者。
　　扩增片段长度多态性(AFLP)是 1992年由荷兰科
学家 Zabeau等创建的一种新的 DNA 多态性检测方
法。利用这一方法 ,不需要事先知道 DNA 序列信息 ,
可以同时进行多数 DNA 酶切片段的 PCR扩增 ,且多
态性丰富 ,能在短时间内获取巨大的信息量。因此 ,
AFLP 被认为是十分理想 、高效的分子标记技术 ,己经
被广泛应用到水稻等作物的遗传多样性分析 、种质鉴
定 、基因定位和连锁图谱构建等方面[ 8 , 9] 。同时 ,国内
外也有将 AFLP 技术应用于苜蓿的遗传多样性和种质
鉴定等方面的报道[ 10 , 11] 。
　　为了探寻紫花苜蓿杂交后代的变异规律 ,研究以
杂交亲本(♀德钦苜蓿 , ♂Acrora)、F1代 、F 2代为材料 ,
运用 AFLP 分子标记技术 ,对紫花苜蓿的遗传变异进
行分析 ,以期从分子水平上探明苜蓿杂交后代的遗传
变异规律 ,为选育适合云南种植的苜蓿品种提供理论
依据 。
1　材料和方法
1.1　试验地概况
　　试验地设在云南农业大学后山草业科学试验实习
基地 ,地理位置为 N 25°, E 103°,海拔 1 931 m ,年均温
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度 14.7 ℃,年均降水量 900 ～ 1 100 mm ,年均日照时
数 2 411.8 h ,土壤为红壤 , pH 6.6。试验温室地设在
云南农业大学园林园艺学院温室园 。
1.2　材料
　　德钦苜蓿♀×A cro ra♂杂交亲本(亲本小区面积
1 m ×2 m ,采用群体杂交实验)、杂交 F 1 、F2代为实验
材料 。2002年进行大量的人工杂交 ,同年收获杂交种
子;2003年将 F 1代栽种在温室;2004年从 F 1代中随机
选取营养体 ,建立无性系。无性系区采用完全随机区
组设计 ,株距 15 cm ,行距 20 cm 。每小区扦插 6行 ,共
扦插 30株 。扦插的杂交种材料取自温室 ,每个杂交种
扦插 6行 ,每行扦插 5株 。2006年选取 F1代的单株进
行人工自交 ,同年收获种子。2006 年将种子播于温
室 ,获得自交 F2代。
　　试验期间进行常规的除草 、浇水 、施肥 、病虫害防
治等管理工作。实验所用杂交亲本及杂交后代材料
(表 1)。
1.3　方法
1.3.1　提取基因组 DNA　苜蓿叶片总 DNA 的提取
采用文献[ 12]CTAB法进行 ,0.8%的琼脂糖凝胶电泳
检测基因组 DNA 的大小和完整性 ,并用 UV-1700紫
外分光光度计测定 DNA 的浓度和质量 ,检测结果显
示 ,OD260/OD280比值 1.7 ～ 1.9 ,DNA 纯度较高。并将
DNA 浓度调整至 200 ng/μL , -20 ℃下保存备用 。
1.3.2　AFLP 反应条件和程序　利用 M seI和 EcoR
Ⅰ两种内切酶对 DNA 双酶切并连接特定接头序列 ,
反应总体积 25μL:模版DNA 5μL ,M se Ⅰ(10 U/μL)
0.5 μL , EcoR Ⅰ(10 U/μL)0.5μL , Mbuffer 2 μL , E
buf fer 2 μL , E-adapto r(50 pmo l/L)1 μL , M-adaptor
(50 pmo l/ l)1 μL , T4 ligase(5 U/μL)0.3 μL , T4
buf fer2.5 μL , AT P(10 mmol/L)2 uL ,双蒸水 8.2
μL;离心混匀 ,37 ℃过夜 , -20 ℃保存。
表 1　供试杂交亲本及杂交后代材料
Table 1　List of tested materials
类型 材料名称 材料来源
亲本 ♀德钦 云南野生种 ,云南省肉牛牧草中心提供
♂Acror a 澳大利亚 ,卢欣石提供
F1 代 2002(1)172 2002(1)184 均为 2002 年杂交后获得
2002(1)185 2002(1)187
2002(1)191 2002(1)196
2002(1)236 2002(1)238
2002(1)247 2002(1)248
2002(1)251 2002(1)256
F2 代 2002(1)172-1 2002(1)172-2 均为 2006 年自交后获得
2002(1)172-6 2002(1)184-1
2002(1)184-4 2002(1)184-12
2002(1)185-1 2002(1)187-3
2002(1)187-8 2002(1)191-1
2002(1)196-1 2002(1)236-1
2002(1)238-1 2002(1)247-1
2002(1)247-3 2002(1)248-1
2002(1)251-7 2002(1)256-5
　　注:F1 为2002 年杂交后获得的杂种1 代 , F2为 F1自交后获得的杂种2 代 , 2002(1)238-1 表示 2002 年杂交第 1 组合 F1 第238
株 F2 第 1 株 ,表中 F2 依次类推
51第 30卷　第 2期　　　　　　　　　　　草 原 与 草 坪 2010年
　　(1)预扩增反应总体积 20 μL:酶切链接产物 2
μL , E00(50 ng/μL)0.8 μL , M00(50ng/μL)0.8 μL ,10
×PCR Buffer2 μL , MgCl2(25mM)1.2 μL , dN TP
(2.5 mM)0.45 μL , Taq 酶(5U/μL)0.3 μL ,双蒸水
10.45μL;(2)预扩增反应条件:94 ℃变性 3 min;94 ℃
变性 30 s ,56 ℃复性 30 s ,72 ℃延伸 60 s , 30个循环;
72 ℃延伸 5 m in。
　　再进行选择性扩增 ,将预扩增产物 1∶20稀释 ,作
为选择模板 ,在 0.2 mL 离心管中加入 25μL 选择性扩
增体系:预扩增稀释样品 4μL , 10×PCR buffer 2 μL ,
dN TPs 0.45 μL , ECRI 引物 0.8 μL , M se Ⅰ0.8 μL ,
Taq酶(5 U/μL)0.3μL ,双蒸水 10.35 μL。混匀离心
数秒 ,按下列参数进行聚合酶链式反应(PCR)循环:94
℃变性 3 min;94 ℃变性 30 s ,56 ℃退火 30 s , 72 ℃延
伸80 s;以后每个循环退火温度递减 0.7 ℃,其他不变 ,
扩增 13个循环;94 ℃变性 30 s ,56 ℃退火 30 s , 72 ℃
延伸 80 s ,30个循环;最后采用荧光 AFLP电泳 ,
1.4　数据处理和分析
　　对每一个体在每个位点上的扩增结果进行纪录 ,
有带记为“1” ,无带记为“0” ,从而获得所有个体在所有
位点上的 AFLP 信息。谱带纪录原则以清晰可重复为
准 ,对相同分子量的不考虑带的强弱 ,与空白对照反应
有相同迁移率的带均视为污染带 ,不予记录 ,为确保准
确 ,所有条带均为人工读带。对 0 , 1 矩阵利用 POP-
GENE32软件 ,分别计算多态位点比率 P , Shannon s
信息指数(I),Nei基因多样性指数(H),用来表述遗传
多样性的丰富程度。根据 Nei[ 13] 基因多样度法计算基
因分化系数(Gst),利用 N TSYS-PC2.1的软件计算遗
传距离。
2　结果与分析
2.1　引物筛选
　　选用 36对引物对供试材料进行 AFLP 扩增 ,筛选
出在父 、母本中扩增的 DNA 片段有明显差异的引物 8
对(表 2)。由图 1 可知 , AFLP 带纹丰富 ,在不同的材
料间表现出丰富的多态性 。
2.2　紫花苜蓿亲本及杂交后代的遗传变异参数分析
　　运用 Popgene 32软件计算得到杂交亲本及杂交
后代的遗传多样性指标(表 3), Nei基因多样性指数
(H)是衡量遗传多样性最常用的指标。结果显示 ,杂
交 F2代具有最高的 Nei基因多样性(0.292 5),亲本的
最低(0.055 2),自交 F 1代(0.175 8)居中。
　　Shannon s信息指数(I)分析结果也表现相同的
模式 , 以杂交 F2 代的最大(0.4361), 亲本的最小
(0.080 6),杂交 F1代(0.262 1)居中。
　　有效等位基因数(Ne)反映等位基因在群体中的重
要性 , Ne 越大 ,说明等位基因在群体中的作用越大 。
本研究有效等位基因数(Ne)以杂交 F2 代最高
(1.510 8),亲本最低(1.094 3),杂交 F 1代(1.305 4)居
中 。
表 2　AFLP 选择性扩增引物产生的多态带
Table 2　Numbers of AFLP fragment generated with four primer
combinations of alfalfa
引物组合 总谱带数 多态带数 多态带百分率/ %
E6-M6 60 56 93.3
E5-M5 55 48 87.3
E1-M6 45 40 88.9
E2-M3 39 36 92.3
总计 199 180 90.5
平均值 49.8 45.0 90.5
表 3　紫花苜蓿亲本及杂交后代的遗传多样性参数
Table 3　The parameter of genetic variance of the hybrid parents
and their generations of alfalfa
Nei基因多
样性指数(H)
Shannon信息
指数(I)
有效等位
基因(Ne)
多态条带
百分率(P)
亲本 0.055 2 0.080 6 1.094 3 13.3
杂交 F1代 0.175 8 0.262 1 1.305 4 50.0
杂交 F2代 0.292 5 0.436 1 1.510 8 85.0
总计 0.364 0 0.873 6 1.532 9 90.5
2.3　紫花苜蓿杂交后代的基因分化系数及基因流
　　依据Wright[ 14] 对遗传分化系数的大小与分化程
度的关系的规定 ,分化系数在 0.05 ～ 0.15 ,分化程度为
中等;分化系数在 0.15 ～ 0.25 ,分化程度大 ,大于 0.25
表明分化程度极大 。由表 4 可知 , 本研究 Gst 值为
0.218 ,表明杂交后代出现了较高的遗传分化 ,即在总
遗传变异中 ,有 78.2%的变异源于杂交 F 1代和杂交 F 2
代内部 。
52 　　　　　　GRASSLAND AND T URF(2010)　　　　　　　　　　　　Vol.30 No.2
图 1　苜蓿 AFLP 指纹图谱(引物组合 E6-GGC/M6-GGA)
Fig.1　AFLP fingerprint of afalfa(Primer combination
E6-GGC/M6-GGA)
　　基因流受到选择 、遗传漂迁及突变的影响 ,一般认
为基因流大于 1 时 ,才可以有效克服由遗传漂迁所造
成的群体间的遗传分化 。根据 AFLP 的分析结果显
示 ,苜蓿杂交后代间的基因流 Nm 为0.874 ,属于较低
水平(表 4)。说明杂交 F 1代对杂交 F 2代的遗传分化有
一定的影响。
2.4　紫花苜蓿亲本及杂交后代的遗传距离
　　从表 5可看出 ,亲本及杂交后代遗传距离分布在
0.128 ～ 0.284 ,其中 ,杂交 1代与亲本的遗传距离最小
0.128 ,而杂交 2代与亲本之间的遗传距离最大 0.284。
表明杂交 F 1代群体与亲本差异较小 ,而杂交 F 2代群体
与亲本差异较大 ,杂交 F2代发生了较大的性状分离。
杂交 F 1代与杂交 F2代的遗传距离为0.184 ,表明苜蓿
杂交具有很近的亲缘关系 。
表 4　紫花苜蓿杂交后代的基因分化系数及基因流
Table 4　The gene differentiation coefficient and gene flow of
hybrid generations of alfalfa
分析内 基因分化系数 基因流
平均值 0.218 0.874
表 5　紫花苜蓿杂交亲本及后代的遗传距离
Table 5　The genetic distance between parents and their generations
类型 亲本 杂交 F1代 杂交 F2代
亲本 ＊＊＊＊
杂交 F1代 0.128 ＊＊＊＊
杂交 F2代 0.284 0.184 ＊＊＊＊
图 2　依据 Nei′s(1979)遗传距离绘制的系统树
Fig.2　Dendrogram based on Nei′s(1979)genetic distance
3　讨论
　　在植物育种中 ,每一种分子标记都具有其优点和
缺点 ,与其他分子标记相比 , AFLP 结合了 RFLP 及
RAPD各自的优点 ,方便快速[ 8 -11 , 15-19] 。
　　利用 AFLP 标记对德钦苜蓿♀×Acro ra♂杂交组
合的杂交亲本与杂交 F1代 、F2代的遗传变异情况进行
分析 ,4对引物共检测到 199个扩增片段 ,其中 ,有 172
个多态性位点 , 多态性位点比率为 90.5%, 比胡晓
宁[ 19] 利用 RAPD 进行 检测的多态性位点比率
(88.9%)高 , 与其他牧草相比 , 多态性水平也较
高[ 20 , 21] 。一个种群的多态性位点比率高 ,说明这个种
群适应环境能力较强 。因此 ,可以推断云南野生紫花
苜蓿及其杂交后代适应性较强 ,为进一步选择新品种
提供了条件 。
　　图谱分析表明 ,绝大部分引物在不同材料上均有
主特征带 ,表现出基因组的同一性 ,证明利用 AFLP 标
记可以建立清晰的紫花苜蓿指纹图谱 。苜蓿杂交后代
间的基因流属于较低水平(0.874),低于柠条锦鸡儿居
群间的基因流(Nm =1.7)[ 22] ,高于混交系统的植物种
(Nm =0.727)[ 23] ,产生上述这种现象的原因还不清
楚 ,是否与紫花苜蓿同源 4倍体有关还需进一步探索。
　　Nei基因多样性指数(H)、Shannon多样性信息指
数和有效等位基因数(Ne)分析表明杂交 F 2代的遗传
多样性最大 ,基因分化系数(Gst)分析也表明杂交子代
出现了较高的遗传分化。杂交子代扩增条带中除了具
有与亲本互补的带以外 ,还出现了亲本没有的扩增条
带 。本研究没有涉及这种现象机理的研究。据有关研
究报道 ,这种现象可能是来源于不同长度的等位核苷
酸序列之间形成的异源双链体所致。也可能是配子形
成过程中 ,染色体的交换及 DNA分子碱基修饰引起的
突变等原因所造成的位点丢失[ 24 , 25] 。还有人认为这些
例外情况发生是由于竞争性抑制作用 ,杂合双链 DNA
可能表现对某些引物结合的空间干扰或竞争作用 ,使
得杂种本应显现的条带受到了完全的或部分的抑制 ,
或者使杂种出现双亲都不具有的扩增带[ 25 , 26] 。
　　从总体分析 , AFLP 分子标记可以有效的揭示苜
蓿种质资源的遗传多样性 ,可用于紫花苜蓿杂交后代
遗传变异程度的分析 。作为紫花苜蓿育种变异程度鉴
定的手段 ,可为杂交育种和新品种选育提供条件。
53第 30卷　第 2期　　　　　　　　　　　草 原 与 草 坪 2010年
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AFLP analysis of genetic variation for the
hybrid progenies of alfalfa
M A Xiang-li ,BI Yu-fen ,ZHANG Feng-xian
(Yunnan Agricul tural University ;K unm ing 650201 ,China)
　　Abstract:AFLP molecular marker w as applied to de tect the genetic v ariat ion in the parents ,F1 and F2 of the
hybrid o f Med icago sativa cv.Deqin(♀)and M.sativa cv .Acro ra(♂).The results show ed that:1)4 primers
54 　　　　　　GRASSLAND AND T URF(2010)　　　　　　　　　　　　Vol.30 No.2
were screened out f rom 36 A FLP primers to amplify the alfalfa genome DNAs o f the materials effect ively.A-
mong amplified 199 sites ,172 were polymorphic and the ratio of po lymo rphic lo ci w as 90.5%,which pro ved that
AFLP marker could be used to analy ze genet ic v ariat ion.2)In terms of Shannons index ,Neis index and ef fective
number of al leles , the genetic diversi ty of the parents w as the low est , and that of F2 w as the highest.3)The
gene different iation coeff icient o f 0.218 and the gene f low of 0.874 o f the hybrid progenies suggested that a
higher genetic different iation resided among F1 and F2.4)The genetic distance betw een parents and their F1
and F2 w as ranged from 0.128 to 0.284.The smallest genetic distance o f 0.128 occurred be tw een the parents
and F1 while the largest of 0.284 w as detected betw een the parents and F2.The systemat ical cluster analy sis
show ed that the re w as a close r phy logene tic relationship be tw een parents and F1.
　　Key words:Medicago sat iva;genetic variation;AFLP marker
(上接 49页)
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Effect of soaking treatments on germination of
Chamaecrista rotundif olia cv.Minyin seeds
LUO Xu-hui1 , 2 ,ZHAN Jie1 ,CHEN Yi-ping3 ,YING Zhao-yang1 ,
H UANG Rong-hui2
(1.Agricul tural Ecology Insti tute ,Fuj ian Academy o f Agricul tural Sciences/Fuj ian Engineering and
Technolog y Research Center for H i l ly Pratacul ture ,Fuzhou 350013;2.School o f L i f e Sciences ,Fuj ian
Agriculture and Forestry Universi ty , Fuz hou 350002;3.College of A gricul ture ,Y angtze
Universi ty , J ingzhou 434023 ,China)
　　Abstract:The impact of seed soaking treatments(ho t w ater and 98% o f H2 SO 4 solution)on ge rminat ion of
of Chamaecrista rotund i f olia cv.M iny in w as studied.Results showed that the hardness rate of ripen seeds
reached 87.7%.The seeds t reated w ith 100 ℃wate r fo r 5 to 30 min performed very well and the seed ha rdness
rate w as decreased to 9.7% to 13.0%, germination rate w as increased to 87.0% to 90.3%, germination poten-
tial w as increased to 85.0% to 88.0%, and germination index w as increased to 48.2 to 56.5 ,which w as bet ter
than o ther hot w ater t reatments.A s fo r the H 2SO 4 solution t reatment for 10 min , the hardness rate w as below
2.0%, ge rmination rate w as 98.3%, germination po tential w as 97.3% and germinat ion index w as 87.0.
　　Key words:Chamaecrista rotundi folia cv.M inyin;seed hardness;do rmancy ;seed soaking
55第 30卷　第 2期　　　　　　　　　　　草 原 与 草 坪 2010年