全 文 ：收稿日期:2010-06-15。基金项目:国家自然科学基金资助项目(21065007);南昌大学食品科学与技术国家重点实验室基金资助项目(SKLF-MB-
200807 andSKLF-TS-200919)。作者简介:倪永年(1946-), 男 ,教授 , 博士生导师。 E-mail:ynni@ncu.edu.cn。
　　文章编号:1006-0464(2011)01-0146-05
光谱法研究刺芒柄花素与牛血清白蛋白的相互作用
倪永年a, b,张方圆b,张秋兰a, b
(南昌大学 a.食品科学与技术国家重点实验室 , 江西 南昌　330047;b.化学系 ,江西 南昌　330031)
摘　要:在生理 pH 7.4条件下 , 应用光谱法研究药物小分子刺芒柄花素与牛血清白蛋白相互作用机理。通过荧光
法和紫外吸收光谱法确定了刺芒柄花素对牛血清白蛋白的荧光猝灭机制。采用 Stern-Volmer方程求出相互作用的
猝灭常数 , 双对数方程求出结合常数 Ka和结合位点数 n,进而利用热力学公式判别作用力类型。结果表明:刺芒柄
花素与牛血清白蛋白的相互作用的荧光猝灭属于静态方式 , 298K时结合常数 Ka为 1.39×106 L· mol-1 ,结合位点
数为 1,而主要作用力类型是静电作用。用紫外与同步荧光光谱法研究了刺芒柄花素对 BSA构象的影响。
关键词:刺芒柄花素;牛血清白蛋白;相互作用;荧光光谱;紫外吸收光谱
中图分类号:O657　　　　文献标志码:A
　　刺芒柄花素 (Formononetin,简称 FOR)是一种
取自于豆科植物花絮和刺芒柄花全草的黄酮类化合
物 。它具有一定的抗癌作用和雌激素作用 [ 1] ,临床
上常用作利尿剂 。其分子结构式如图 1所示:
图 1　刺芒柄花素的化学结构式
牛血清白蛋白(BSA)是血浆中最为丰富的蛋白
质 ,它不仅对维持渗透压起着重要作用 ,而且能与进
入血液中的大多数内源和外源性物质如药物等进行
可逆的结合从在体内而起到转运的作用[ 2] 。药物
与牛血清白蛋白亲和力大小也影响到药物在体内的
分布 、清除以及通过改变血液组织或组织中游离药
物浓度来影响药效 。因此 ,研究药物与血清白蛋白
的结合作用对理解药物的作用机制具有重要意
义 [ 3] 。本文采用荧光光谱法和紫外吸收光谱法研
究了刺芒柄花素与牛血清白蛋白的结合作用 ,求得
其结合常数和热力学常数 ,探讨了在人体生理 pH
条件下刺芒柄花素与牛血清白蛋白的结合作用机制
以及刺芒柄花素对牛血清白蛋白构象的影响。
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
PELS-55荧光分光光度计(美国 ,带恒温槽装
置);Agilent8453紫外 -可见分光光度计(美国 ,带
恒温槽装置)。BSA(合肥博美生物科技有限公司 ,
纯度 99%,分子量 68 000)用二次水配制成 1.76 ×
10
-3 mol·L-1和 5.0×10-5 mol· L-1储备液 ,于(1
～ 4)℃冰箱中保存。刺芒柄花素用乙醇配制成
7.47×10-4 mol· L-1和 3.73×10-5 mol· L-1标准
溶液 。缓冲液为 Tris-HCl溶液(pH=7.40):先配制
0.2 mol·L-1的 Tris溶液 ,准确称取 2.422g三羟基
甲基氨基甲烷(上海蓝季科技发展公司),溶于二次
水中后 ,再移入 100 mL的容量瓶中并定容 ,取出此
溶液 25.0 mL于 100 mL的容量瓶中 ,再加入 45.0
mL0.1mol· L-1的盐酸溶液 ,用二次水定容 [ 4] 。实
验中所用水均为二次蒸馏水 。
1.2　实验方法
准确移取 3.0mLTris-HCl缓冲溶液于 1 cm石
英比色皿中 ,固定 BSA为 6.67 ×10-8 mol· L-1 ,逐
步多次加入刺芒柄花素溶液([ FOR] :[ BSA] =0,
0.5, 1.0, …, 4.0)。将上述溶液置于恒温槽中 ,调
节水温至 298 K,放置 3 min,固定激发波长为 280
nm,入射和发射狭缝宽均为 10 nm,记录 250 ～ 600
nm的发射荧光光谱。分别在 302、306 K温度条件
下重复以上荧光测定实验 。另外于 1 cm石英比色
第 35卷第 2期
2011年 4月 　　　 　　　
南昌大学学报(理科版)
JournalofNanchangUniversity(NaturalScience)
Vol.35 No.2
Apr.2011 　
皿中准确移取 3.0 mLTris-HCl缓冲溶液 ,固定 BSA
为 2.35×10-6 mol· L-1 ,不断加入刺芒柄花素溶液
([ FOR] :[ BSA] =0, 0.85, 1.70, …, 7.65),记录
200 ～ 900nm的紫外吸收光谱 。
2　结果与讨论
2.1　刺芒柄花素对 BSA的荧光猝灭光谱
BSA分子含有 583个氨基酸 ,其中色氨酸 、酪氨
酸及苯丙氨酸残基能发射荧光。由于色氨酸 、酪氨
酸和苯丙氨酸残基在蛋白质分子内部的空间距离为
7 ～ 10 nm,彼此之间的共振能量转移会导致酪氨酸
及苯丙氨酸残基的荧光猝灭 ,所以在很多情况下 ,蛋
白质的荧光光谱似乎只显示色氨酸的荧光 ,其峰值
在 350 nm左右[ 5] 。实验研究了 298、302、306 K3
个不同温度下 ,刺芒柄花素对 BSA荧光的猝灭作用
(见实验方法部分)。图 2为 298 K时的荧光光谱 ,
从图中可以看出在固定 BSA浓度条件下 ,随着刺芒
柄花素浓度的增加 , BSA的最大荧光发射峰逐渐降
低 ,而峰形无明显变化 。同时在 459nm处出现刺芒
柄花素的荧光峰 ,且在 408 nm处有 1个等发射点 ,
说明反应过程中存在一平衡关系[ 6] ,而且 BSA与刺
芒柄花素形成了新的复合物[ 7] 。
图 2　298 K时 , 刺芒柄花素对 BSA的荧光猝灭图
[ BSA] =5.0×10 -5 mol· L-1 ,
[ FOR] :[ BSA] =0, 0.5, 1.0, … , 4.0
2.2　猝灭机理分析及结合常数确定
荧光猝灭作用因猝灭机制不同分为动态猝灭和
静态猝灭。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态
分子之间的相互作用过程 ,而静态猝灭是猝灭剂和
荧光物质分子在基态时生成不发荧光的复合物 ,从
而导致荧光物质的荧光强度降低的过程。对于动态
猝灭 ,温度升高会加快分子扩散速度 ,将有利于荧光
体和荧光猝灭剂分子的有效碰撞 ,并可以促进电子
的转移过程 ,使 KSV随温度的升高而增大;若是静态
猝灭 ,温度升高 ,产物的稳定性降低 ,静态猝灭结合
常数 K将减小。动态猝灭过程可由 Stern-Volmer方
程表示[ 8] ,
F0 /F=1 +Kqτ0 [ Q] =1 +KSV[ Q] (1)
式中:F0和 F分别为未加入和加入化合物时 BSA的
荧光强度 , KSV为动态猝灭常数 , Kq动态猝灭速率常
数 , [ Q]为猝灭剂的浓度 , τ0为猝灭剂不存在时荧光
分子的荧光寿命(对于生物大分子 , τ0 =10-8 s[ 9] )。
根据该方程可绘制出 298、302和 306K时的 F0 /F-
[ Q] 曲线 ,如图 3所示。
图 3　298、302和 306 K时刺芒柄花素对
BSA猝灭的 Stern-Volmer图
实验结果表明:随着温度的升高 , Stern-Volmer
曲线的斜率降低 , KSV减小 ,刺芒柄花素对 BSA猝灭
过程的 Kq远大于 2 ×1010 L· mol-1 ×s-1(各类猝灭
剂对荧光分子的最大扩散碰撞猝灭常数),见表 1。
由此 ,可推断出该体系的荧光猝灭作用不是由于动
态碰撞所引起 ,而是由于形成了复合物而引起的静
态猝灭。
2.3　结合常数和结合位点数的计算
在静态猝灭中 ,结合常数和结合位点数可以通
过双对数公式求出 [ 10] 。设生物大分子有 n个相同且
独立的结合位置 ,可以通过公式推导得到:
logF0 /FF =logK+nlog[ Q] (2)
以 log[ (F0 -F)/F] 对 log[ Q] 作图(图 4),由斜率
和截距可求出药物分子与蛋白质分子作用的结合常
数 Ka和结合位点数 n。所得结果列于表 1中 。所得数
据表明 ,刺芒柄花素与 BSA有一定的结合能力 ,可形
成一个结合位点 ,能在体内被蛋白质储存和转运 。并
且随着温度的升高 ,结合常数减小 ,进一步验证了静
态猝灭的机理 。
·147·第 2期　　　　　 倪永年等:光谱法研究刺芒柄花素与牛血清白蛋白的相互作用
图 4　298、302和 306K时刺芒柄花素对
BSA猝灭的双对数图
2.4　紫外吸收光谱
固定 BSA不断加入刺芒柄花素的紫外吸收曲
线 ,如图 5所示。从图中可以看到 ,刺芒柄花素的加
入使 BSA的紫外吸收发生了明显的变化 ,且吸收峰
有红移现象 ,从 279 nm红移至 310 nm。BSA在 279
nm处的吸收峰是由于肽链上的色氨酸和酪氨酸的
苯杂环 π-π＊跃迁引起的 ,吸收强度随着药物浓度
的增加而加强 ,说明药物与 BSA发生了作用 ,诱导
BSA分子链发生了类似降低 pH值所出现的蛋白质
肽链伸展现象[ 11] 以致本来被包含在 BSA内色氨酸
和酪氨酸残基的芳环疏水基团裸露出来 ,使吸收强
度增加 ,同时疏水基团之间的疏水作用减弱。由于刺
芒柄花素与 BSA生成了新的共轭体系 ,增加了新的
π ～ π＊跃迁 ,使得吸收峰发生了红移 [ 12] 。
2.5　刺芒柄花素与 BSA作用力类型的判断
药物等有机小分子与蛋白质等生物大分子常借
助于静电作用力 、氢键作用力 、范德华力和疏水作用
力等相互结合形成超分子复合物 [ 13] 。不同小分子与
蛋白质结合的作用力类型也不同 。Ross等 [ 14]根据
图 5　298K时 , 不同刺芒柄花素浓度下 ,
BSA的紫外吸收光谱图
[ BSA] =5.0 ×10-5 mol· L-1 ,
[ FOR] :[ BSA] =0, 0.85, 1.70, … , 7.65
大量的实验结果总结出判断生物大分子与小分子结
合性质的热力学规律 ,即 ΔS>0可能是疏水和静电
作用力;ΔS<0可能为氢键和范德华力;ΔH>0, ΔS
>0为典型的疏水作用力;ΔH<0, ΔS<0为氢键和
范德华力;ΔH≈ 0或较小 , ΔS>0为静电作用力;
ΔH<0是静电作用力为主要作用力。当温度变化不
大的情况下可以把反应的焓变 ΔH近似看作一个常
数。根据热力学公式:
lnK2K1 =(
1
T1 -
1
T2)
ΔH0
R (3)
ΔG=ΔH-TΔS=-TRlnK (4)
式中:R为常数(8.314 J· mol-1·K-1)。求算出不同
温度下反应的自由能 ΔG、焓变 ΔH和熵变 ΔS,结果
列于表 1中。由表中数据判断在生理条件下刺芒柄
花素与 BSA之间的作用力主要为静电作用力。
表 1　不同温度下刺芒柄花素与 BSA相互作用的 Stern-Volmer猝灭常数 、结合常数 、结合位点数和热力学常数
T/K KSV(L·mol-1) Ka(L· mol-1) R n ΔG(kJ· mol-1) ΔH(kJ· mol-1) ΔS(J· mol-1· K-1)
298 7.2 ×105 1.39 ×106 0.996 0.87 -35.05 -30.65 14.7
302 6.0 ×105 1.18 ×106 0.998 0.86 -35.11
306 5.4 ×105 0.96 ×106 0.994 0.87 -35.04
2.6　刺芒柄花素对 BSA构象的影响
蛋白质中的氨基酸残基的最大发射波长与它所
处的环境的极性有关 ,同步荧光光谱因具有简化光
谱 、窄化谱带和减小光谱重叠等特点 ,常被用来判断
蛋白质的构象变化 [ 15] 。由 λΔ=15nm和 60nm所得
的同步荧光光谱分别显示酪氨酸残基和色氨酸残基
的光谱特性 [ 16] 。图 6a～ 6b为 BSA中酪氨酸和色氨
酸残基的荧光光谱 ,随着刺芒柄花素浓度的增加 ,酪
氨酸的发射峰逐渐减小 ,但峰形基本不变;而图 6b
中色氨酸残基荧光峰从 278.5nm蓝移至 275 nm。这
表明药物的加入使得色氨酸残基所处的环境极性减
小 ,疏水性增强 , 而酪氨酸残基所处的环境保持不
变[ 17] 。
·148· 南昌大学学报(理科版) 2011年　
图 6　加入刺芒柄花素后 BSA的同步荧光光谱
a:Δλ=15nm;[ FOR] :[ BSA] =0, 0.5, 1.0, … , 4.5;
b:Δλ=60 nm;[ FOR] :[ BSA] =0, 0.5, 1.0, … , 4.5
3　结论
本实验采用荧光光谱法和紫外 -可见吸收光谱
法研究了刺芒柄花素与牛血清白蛋白的相互作用机
制 。实验结果表明刺芒柄花素能与牛血清白蛋白之
间通过静电作用力形成亲和力较强的复合物。它不
仅可以与牛血清白蛋白结合 ,通过血液循环到达作
用部位 ,而且对蛋白质分子的构象有一定的影响 。
这些结论将有助于了解药物在体内的运输和分布情
况 ,对阐明药物的作用机制 、药物动力学有一定的帮
助 。
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·149·第 2期　　　　　 倪永年等:光谱法研究刺芒柄花素与牛血清白蛋白的相互作用
InteractionbetweenFormononetinandbovine
serumalbuminbyspectroscopy
NIYong-niana, b＊ , ZHANGFang-yuanb, ZHANGQiu-lana, b
(a.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology, NanchangUniversity, Nanchang330047, China;
b.DepartmentofChemistry, NanchangUniversity, Nanchang330031, China)
Abstract:Theinteractionbetweenformononetinandbovineserumalbumin(BSA)wasstudiedunderphysiological
conditionbyspectroscopicmethod.ThequenchingmechanismofthefluorescenceofBSAbyformononetinwasstud-
iedwiththefluorescenceandUV-visspectrosmetry.Thebindingconstants, numberofbindingsitesandtypesofthe
bindingforcewereevaluatedbyusingtheStern-Volmer, double-reciprocalandthermodynamicequations.Itwas
foundthatfluorescencequenchingoftheinteractionwasduetothestaticquenching.Thereisonebindingsitebe-
tweenformononetinandBSA, andthebindingforceiselectrostaticinteraction.Thesynchronousfluorescencespectra
showedthatthebindingofformononetintoBSAconfirmsomemicro-environmentalandconformationalchangesof
BSA.
Keywords:Formononetin;bovineserumalbumin;interaction;fluorescenceandUV-visspectra
(上接第 145页)
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Dimensionalmodelfortouristdestinationbrandloyaltyanditsapplication
ZHANGChun-qina, LIUShanb, PENGYana
(a.TouristSchool;b.MatheraticsandComputerSchool, JiangxiTeachers ColegeofScienceandTechnology, Nanchang330038, China)
Abstract:Brandloyaltyiskeytotheestablishmentofabrand.Itissignficantfortourists traveldecisions, the
spreadofbrand sreputation, andthemarketingoftouristdestinationaswel.Basedonthetheoriesofbrandloyal-
ty, thispapertargetedtheelementwhichwouldhelprealizetheroyaltytosometouristdestination, usesSPSS13.0
asanindextotestify, andbuiltadimensionalmodelfortouristbrandloyalty.Themodelwasputintothepractical
establishmentofJiangxiRedTourism, andshouldprovideasolidbasisforJiangxitouristpolicydecisions.
Keywords:brandloyalty;dimensionalmodel;touristdestination
·150· 南昌大学学报(理科版) 2011年