全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2011，23:1148-1150，1155
文章编号:1001-6880(2011)06-1148-04
收稿日期:2010-01-26 接受日期:2010-06-12
基金项目:山东省科技攻关项目(2006GG3202038)
* 通讯作者 Tel:86-531-82605352;E-mail:hliukch@ keylab． net
高速逆流色谱分离制备甘草中的甘草苷和芒柄花苷
袁延强1，王祖林2，刘秀河2，韩利文1，刘可春1*
1山东省科学院生物研究所，济南 250014;2 山东轻工业学院食品与生物工程学院，济南 250353
摘 要:应用高速逆流色谱分离制备甘草中的甘草苷和芒柄花苷。将甘草乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱粗分后，
30%乙醇洗脱物用高速逆流色谱进一步分离，所用两相溶剂系统为乙酸乙酯-水(5∶ 5，v /v) ，转速 850 rpm，流速
2． 0 mL /min，检测波长 254 nm，从 50 mg30%乙醇洗脱物中得到甘草苷 8． 7 mg、芒柄花苷 4． 2 mg，纯度分别为
99． 5%和 97． 3%。所得产物的结构经核磁共振谱(NMR)鉴定。利用该方法可以对甘草中的甘草苷和芒柄花苷
进行快速的分离和纯化。
关键词:高速逆流色谱;甘草;甘草苷;芒柄花苷
中图分类号:R284. 2 文献标识码:A
Preparative Separation of Liquiritin and Ononin from Glycyrrhiza
uralensis by High-speed Counter-current Chromatography
YUAN Yan-qiang1，WANG Zu-lin2，LIU Xiu-he2，HAN Li-wen1，LIU Ke-chun1*
1Biology Institute of Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China;
2College of Food ＆ Bioengineering，Shandong Institute of Light Industry，Jinan 250353，China
Abstract:High-speed counter-current chromatography(HSCCC)was used to isolate and produce liquiritin and ononin
from Glycyrrhiza uralensis． Firstly，the ethyl acetate extract of G． uralensis was purified by polyamide column chromatog-
raphy，and then，the samples eluted by 30% ethanol-water were further purified by HSCCC． By using a two-phase solvent
system composed of ethyl acetate-water (5∶ 5，v /v) ，8． 7 mg of liquiritin and 4． 2 mg of ononin were isolated from 50 mg
samples with purities of 99． 5% and 97． 3% under the conditions of the flow rate of 2． 0 mL /min，the rotational speed of
850 r /min and the detection wavelength of 254 nm． The structures of the obtained products were analyzed by NMR． The
results indicated that HSCCC was an efficient method for isolation and purification of liquiritin and ononin．
Key words:high-speed counter-current chromatography;Glycyrrhiza uralensis;liquiritin;ononin
甘草为豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis
Fisch．、胀果甘草 G． inflata Bat．或光果甘草 G． glabra
L．的干燥根及根茎，有补脾益气，清热解毒，祛痰止
咳、缓急止痛，调和诸药等功效［1］。甘草中的黄酮
类化合物具有较强的生物活性，近年发现该类化合
物有抗氧化、抗炎、抗 HlV、抗肿瘤等多种药理作
用［2-5］。甘草苷和芒柄花苷是甘草的主要活性成分，
其中甘草苷具有抗炎、抗皮肤肿瘤、祛除皮肤色斑和
抗抑郁的作用［6，7］，芒柄花苷具有神经保护和抗氧
化的作用［8］。因此，为了对甘草活性成分进行更深
层次的药理药效研究，建立一种快速有效的分离制
备方法具有重要意义。
高速逆流色谱(HSCCC)是近年来发展起来的
一种液-液分配色谱新技术，其特点是被分离物质在
两相液体中进行分配，不需要任何固相载体，克服了
固相载体对样品吸附、损失、污染等缺点，具有适应
面广、高效、快速、制备量大、费用低等特点，因而在
天然产物的分离纯化领域得到了广泛的应用。目
前，利用高速逆流色谱已从甘草中成功分离到多种
黄酮类化合物，如甘草黄酮醇(licoflavonol)、甘草素
(liquiritigenin)、芒柄花素(formononetin)、甘草异黄
酮甲(licoisoflavone A)、异甘草素(isoliquiritigenin)、
甘草查儿酮甲(licochalcone A)等［9-11］。
本实验先用聚酰胺树脂对甘草乙酸乙酯提取物
进行处理，然后采用 HSCCC 法对其进一步分离，得
到了纯度均大于 97%的甘草苷和芒柄花苷，为从甘
草中制备甘草苷和芒柄花苷提供了一种新方法。
DOI:10.16333/j.1001-6880.2011.06.033
1 材料
甘草粗提物制备及 HSCCC 分离用溶剂(石油
醚、乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙醇等)均为分析纯
(天津广成化学试剂公司) ;HPLC 分析用甲醇为色
谱纯(天津科密欧化学试剂公司) ;水为超纯水;聚
酰胺树脂(80 ～ 100 目，浙江省台州市路桥四甲生化
塑料厂)。
甘草购于济南建联中药店，产地内蒙古，由宋广
运研究员鉴定。
TBE-300A高速逆流色谱仪(上海同田生化技
术有限公司) ;HITACHI L-2000 高效液相色谱仪(日
本日立公司) ;HX-1050 恒温器(北京博医康实验仪
器有限公司) ;色谱柱:Apollo C18(5 μm，250 mm ×
4． 6 mm i． d．) (美国 Alltech公司) ;INOVA-600 型核
磁共振仪(美国 Varian公司)。
2 方法
2． 1 样品的预处理
2． 1． 1 甘草乙酸乙酯浸膏的制备
称取 1 kg 甘草，干燥，粉碎至 80 目粒径，以 6
倍质量的 70%乙醇水溶液加热回流提取 3 次，减压
回收乙醇后，将浸膏溶于 3 L热水中，先用等体积的
石油醚萃取 5次，再用等体积的乙酸乙酯萃取 5次，将
乙酸乙酯萃取物减压蒸馏，得 30 g乙酸乙酯浸膏。
2． 1． 2 聚酰胺层析柱分离
将上述乙酸乙酯浸膏用少量乙醇溶解，加入 2
倍重量的聚酰胺树脂，搅拌均匀后加入已处理好的
聚酰胺(300 g)柱(5 cm × 100 cm)上，依次用蒸馏
水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗
脱，每个梯度分别用 5 倍柱体积溶液冲洗，流速 0． 3
BV /h。将 30%乙醇洗脱物浓缩干燥后得 4． 26 g 样
品，置于冰箱中备用。
2． 2 HPLC分析条件
色谱柱:Apollo C18(5 μm，250 mm × 4． 6 mm i．
d．) ;检测波长:254 nm;流动相:甲醇-0． 5%乙酸，以
0 ～ 50 min 甲醇从 20%到 100%进行梯度洗脱;流
速:1 mL /min;柱温:35 ℃;进样量:20 μL。
2． 3 两相溶剂系统及样品溶液的制备
HSCCC溶剂系统乙酸乙酯-水(5∶ 5，v /v) ，按比
例将两种溶剂加入分液漏斗中，振荡使溶液充分混
合，静置平衡后分得上相和下相，分别超声脱气 15
min以备用。称取约 50 mg 甘草预处理样品，加入
溶剂系统的上、下相各 10 mL，振荡使之溶解，以备
HSCCC进样。
2． 4 HSCCC分离过程
以 10 mL /min将乙酸乙酯-水(5∶ 5，v /v)的上相
(固定相)泵入 HSCCC 螺旋管，待螺旋管完全充满
固定相后，开启 HSCCC主机，旋转方向为顺时针，使
转速逐渐增加到 850 rpm，同时以 2． 0 mL /min 的流
速泵入下相(流动相)。当流动相从螺旋管尾端流
出时，系统即达到动力学平衡，此时将“2． 3”制备的
样品溶液注入样品环。紫外检测器检测波长为 254
nm，根据色谱图收集各流分。
3 结果与分析
3． 1 甘草预处理样品的 HPLC分析
采用“2． 2”节的色谱条件，对甘草预处理样品
进行分离，色谱图见图 1。结果表明，在该条件下，
样品可以得到很好的分离效果，A 和 B 为 254 nm
检测到的主要色谱峰。
图 1 甘草预处理样品的 HPLC图
Fig. 1 HPLC chromatogram of pretreatment samples of
Glycyrrhiza uralensis
3． 2 高速逆流色谱分离条件的优化
溶剂系统的选择是高速逆流色谱分离的关键环
节，不同的溶剂系统会对不同的成分产生不同的溶
解分配能力，从而造成分配系数的差异，对分离效果
产生显著的影响。通常对 HSCCC 最合适的分配系
数 K值范围是 0． 5 ～ 5。如果分配系数 K过小，出峰
时间太快，峰之间的分离度较差;而分配系数 K 过
大时出峰时间太长且峰形变宽。根据待分离组分的
极性，本实验考察了乙酸乙酯-水系统，通过加入正
己烷、甲醇、正丁醇等溶剂调整成分 A 和 B 的分配
系数(依据文献［12］计算分配系数) ，结果见表 1。
表 1 成分 A和 B在不同两相溶剂系统中的分配系数
Table 1 The K-values of compound A and B in different two-
phase solvent systems
溶剂系统 Solvent system KA KB
正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (5∶ 5∶ 5∶ 5，v /v) ＜ ＜ 0． 5 ＜ ＜ 0． 5
9411Vol. 23 袁延强等:高速逆流色谱分离制备甘草中的甘草苷和芒柄花苷
正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (1∶ 5∶ 1∶ 5，v /v) 0． 14 0． 41
乙酸乙酯-正丁醇-水 (5∶ 1∶ 5，v /v) 2． 38 5． 97
乙酸乙酯-水 (5∶ 5，v /v) 0． 71 2． 13
在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶ 5∶ 5∶ 5，v /v)系
统中成分 A 和 B 的分配系数太小，通过降低正己
烷、甲醇的比例，增大正丁醇的比例使 KA、KB 增大。
根据以上实验结果，成分 A、B在乙酸乙酯-水(5∶ 5，
v /v)系统的分配系数较合适。
本实验还对进样量进行了考察，由于该样品在
乙酸乙酯-水(5∶ 5，v /v)系统中的溶解性较差，若进
样量太大，样品不溶解，易导致固定相流失。因此本
实验最终选择进样量为 50 mg。
3． 3 HSCCC分离制备的结果
选择乙酸乙酯-水(5∶ 5，v /v)为溶剂系统，采用
“2． 4”的条件进行 HSCCC 分离，在此条件下，固定
相保留率为 53%，分离时间 4 h，HSCCC 图见图 2。
根据 HSCCC 图收集成分 A 和 B，减压干燥得 A
(8. 7 mg)和 B(4． 2 mg) ，将成分 A和 B通过 HPLC
检测(见图 3) ，面积归一化确定其纯度分别为
99. 5%和 97． 3%。
3． 4 成分 A、B的结构鉴定
A(白色粉末)1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ:
7. 65(1H，d，J = 8. 4 Hz，H-5) ，7. 45(2H，d，J = 8. 4
Hz，H-2，6) ，7. 07(2H，d，J = 8. 4 Hz，H-3，5) ，
6. 51(1H，dd，J = 9. 0，1. 8 Hz，H-6) ，6. 35(1H，d，J =
1. 8 Hz，H-8) ，5. 53(1H，dd，J = 12. 6 Hz，2. 4，H-2) ，
4. 89(1H，d，J = 7. 2 Hz，glc-H-1) ，3. 14(1H，dd，J =
16. 2，12. 6 Hz，H-3-trans) ，2. 67(1H，dd，J = 16. 2，
2. 4 Hz，H-3-cis)。13 C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ:
79. 34(C-2) ，43. 84(C-3) ，190. 61(C-4) ，129. 09(C-
5) ，111. 24 (C-6) ，165. 32 (C-7) ，103. 26 (C-8) ，
163. 73(C-9) ，114. 22(C-10) ，133. 01(C-1) ，128. 69
(C-2，6) ，116. 83(C-3，5) ，158. 12(C-4) ，100. 95
(glc-C-1) ，73. 88(glc-C-2) ，77. 72(glc-C-3) ，70. 36
(glc-C-4) ，77. 28(glc-C-5) ，61. 35(glc-C-6)。以上
波谱数据与文献［13］报道一致，故鉴定为甘草苷。
B(白色粉末)1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ:
8. 45(1H，s，H-2) ，8. 06(1H，d，J = 9. 0 Hz，H-5) ，
7. 54(2H，d，J = 9. 0 Hz，H-2，6) ，7. 25(1H，d，J =
1. 8Hz，H-8) ，7. 15(1H，dd，J = 9. 0 Hz，1. 8 Hz，H-
6) ，7. 0(2H，d，J = 9. 0 Hz，H-3，5) ，5. 11(1H，d，J
= 7. 8Hz，glc-H-1) ，3. 79(3H，s，-OCH3)。
13 C NMR
(150 MHz，DMSO-d6)δ:154. 34(C-2) ，124. 04 (C-
3) ，175. 34 (C-4) ，127. 63 (C-5) ，116. 31 (C-6) ，
162. 12 (C-7) ，104. 07(C-8) ，157. 72(C-9) ，119. 12
(C-10) ，124. 67(C-1) ，130. 76(C-2，6) ，114. 30
(C-3，5) ，159. 70(C-4) ，100. 64(glc-C-1) ，73. 79
(glc-C-2) ，77. 14(glc-C-3) ，70. 29(glc-C-4) ，77. 88
(glc-C-5) ，61. 30(glc-C-6) ，55. 83(-OCH3)。以上
波谱数据与文献［14］报道一致，故鉴定为芒柄花苷。
4 讨论
本文采用聚酰胺树脂和高速逆流色谱相结合的
方法分离纯化甘草中的黄酮类成分，实验结果表明，
通过两种方法的联用可以分离制备高纯度的甘草苷
和芒柄花苷。本文的研究为甘草中黄酮类成分的分
离提供了一条新的技术路线，为甘草黄酮成分的进
一步药理活性研究奠定了良好的基础。
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(下转第 1155 页)
0511 天然产物研究与开发 Vol. 23
3 结论
通过紫外-可见分光光度计法对高速逆流色谱
仪分离芦荟多糖的溶剂系统进行研究，探索出分离
芦荟多糖的溶剂系统为 w(PEG600)∶ w(KH2PO4)
∶ w(K2HPO4)∶ w (H2O) = 5 ∶ 15 ∶ 15 ∶ 65，加入的
NaCl的质量分数为 2%。采用此系统在转速为 600
r /min，固定相流速为 8 mL /min，流动相流速为 2
mL /min，水浴温度为 30 ℃条件下，成功分离出芦荟
多糖的两个组分。经 Sephadex G-100 凝胶柱层析和
高效凝胶渗透色谱技术初步分析两组分的纯度，结
果显示均为单一组分。但是，采用高速逆流色谱分
离多糖所消耗试剂较多，流动相剩余量大，因此怎样
合理地利用并节省试剂资源正在研究之中。此外，
经超声提取后所得的芦荟多糖粗品在进高速逆流之
前应需要初步纯化，如何让高速逆流色谱经一步分
离纯化得到单一成分将是本课题今后的研究重点。
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