全 文 ：收稿日期:2013 － 11 － 07 修回日期:2013 － 11 － 18
基金项目:福建省科技重点基金项目(2009N003) ;国家“十二五”科技支撑项目(2011BA101B06)。
作者简介:翁剑(1990 －) ，男，硕士研究生，从事林木生物技术研究。通讯作者郑郁善(1960 －) ，男，教授，博士生导师，从事森林培育学和中
药材研究。
凹叶厚朴 TＲAP － PCＲ体系建立
翁 剑，李单琦，李书平，荣俊冬，周少卿，郑郁善
( 福建农林大学工业原料林研究所，福建 福州 350002)
摘要:结合均匀试验与正交试验对影响目标区域扩增多态性—聚合酶链式反应(TＲAP-PCＲ)效果的 5 个关键因素(DNA模
板、Mg2 +、dNTPs、引物及 Taq酶)进行优化研究，建立了适用于凹叶厚朴目标区域扩增多态性(TＲAP)分析体系。凹叶厚朴
TＲAP-PCＲ最优反应体系:总体积 25 μL，含模板 DNA 40 ng，Mg2 + 1．5 mmol·L －1，dNTPs 0．28 mmol·L －1，固定引物及随机引
物 0．3 μmol·L －1，Taq DNA聚合酶 0．75 U。PCＲ扩增程序:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 1 min，40 ℃复性 1 min，72 ℃延伸
1 min，5 个循环;将退火温度升至 50 ℃，其它条件不变进行 38 个循环;72 ℃延伸 10 min。利用所得优化体系对 16 个不同
种源凹叶厚朴进行扩增，结果表明该体系效果较好，可应用于凹叶厚朴相关研究。
关键词:凹叶厚朴;TＲAP;均匀试验;正交试验;优化
中图分类号:S567．1 + 1 文献标识码:A 文章编号:1001 － 389X(2014)02 － 0165 － 06
Establishment of TＲAP-PCＲ system for Magnolia officinalis subsp． biloba
WENG Jian，LI Dan-qi，LI Shu-ping，ＲONG Jun-dong，ZHOU Shao-qing，ZHENG Yu-shan
(Institute of Industrial Forest，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China)
Abstract:Uniform design and orthogonal design methods were applied in this paper to optimize 5 key factors (template DNA，
Mg2 +，dNTPs，primers and Taq polymerase)that could influence the effect of TＲAP-PCＲ． The TＲAP-PCＲ system was set up in
Magnolia officinalis subsp． biloba． The optimal system is in 25 μL reaction volume containing about 40 ng template DNA，
1．5 mmol·L －1 of Mg2 +，0．28 mmol·L －1 of dNTPs，0． 3 μmol·L －1 of fixed primer and arbitrary primer，and 0． 75 U Taq DNA
polymerase． PCＲ program:predenaturing 5 min at 94 ℃;the first five cycles run at 94 ℃，1 min，40 ℃，1 min，and 72 ℃，
1 min，for denaturing，annealing and extension，respectively;then the annealing temperature is raised to 50 ℃ for another 38
cycles;run 10 min at 72 ℃ for extension． Using the optimization system for amplification of 16 different provenances of M． officinalis
subsp． biloba，results showed that the system had good effect and could be used in the correlational studies of M． officinalis subsp． biloba．
Key words:Magnolia officinalis susbsp． biloba;TＲAP;uniform design;orthogonal design;optimization
凹叶厚朴(Magnolia officinalis subsp． biloba)为木兰科(Magnoliaceae)木兰属(Magnolia L．)落叶乔
木［1］，是厚朴的亚种，中国特有的药、材两用经济林树种，其药用部位特殊，导致资源受到严重破坏。目
前，野生厚朴(Magnolia officinalis)及凹叶厚朴资源极少，多为人工栽培。从分子水平上进行遗传多样性分
析、种质资源鉴定等研究，开展相关分子标记辅助育种，对保护及充分利用厚朴资源具有重要意义。
目标区域扩增多态性(target region amplification polymorphism，TＲAP)是由 Hu et al［2］于 2003 年从相
关序列扩增多态性(sequence related amplified polymorphism，SＲAP)技术改进而来的新型分子标记技术。
TＲAP扩增结果是对目标功能基因区的直接反应，将更适合遗传多样性的研究。与随机扩增多态性 DNA
(random amplified polymorphic DNA，ＲAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，
AFLP)、SＲAP等以往标记技术相比，其在作物的遗传育种，特别是抗性育种和标记辅助选择育种上具有其
独到优势［3］。此外，该标记技术操作容易、重复性好、多态性丰富、效率高，是构建遗传图谱的理想分子标
记技术。目前 TＲAP技术已经成功应用于多种植物的遗传图谱构建、重要性状基因标记、种质资源的多样
性研究及分子标记辅助育种等方面［4 － 5］。苗培明等［6 － 7］建立了棉花目标区域扩增多态性—聚合酶链式反
应(target region amplification polymorphism polymerase chain reaction，TＲAP-PCＲ)扩增体系，并利用 TＲAP
技术对棉花种质资源遗传多样性进行了研究。郭春芳等［8］应用简单序列重复区间扩增多态性(inter
福建林学院学报 2014，34(2) :165 － 170 第 34 卷 第 2 期
Journal of Fujian College of Forestry 2014 年 4 月
simple sequence repeat，ISSＲ)和 TＲAP技术对 11 个茶树品种遗传多样性进行了比较分析。然而，TＲAP技
术在厚朴上的应用国内外尚未见相关报道。通过优化 TＲAP-PCＲ 反应条件，建立适用于凹叶厚朴的
TＲAP分析体系，可为今后 TＲAP技术在凹叶厚朴上的基础研究及进一步应用提供重要参考价值。
1 材料与方法
1．1 试验材料
试验材料为 2013 年 5 月初采集于福建农林大学工业原料林研究所凹叶厚朴种源试验地的 16 个种源
凹叶厚朴嫩叶的基因组 DNA。种源包括:WFJya、WFJpn、WFJmx、WFJsc、WJXda、WJXls、WSCmy、WSCpzh、
WJSnj、WJSlyg、WAHhf、WHByc、WHBns、WHNxx、WSXxa、WHNdx，分别编号 1 － 16 号。TＲAP-PCＲ 反应体
系所用的固定引物、随机引物、Taq酶、dNTPs、Mg2 +、PCＲ buffer及凝胶检测所用 Marker均购自上海生工生物
工程技术服务有限公司。
1．2 试验方法
1．2．1 凹叶厚朴基因组 DNA提取与检测 凹叶厚朴基因组 DNA 采用天根植物基因组 DNA 提取试剂盒
提取，取 2 μL DNA 模板于 1． 2% 琼脂糖凝胶电泳检测质量，利用 NANO DＲOP 2000C (Thermo
SCIENTIFIC)微量分光光度计测定其浓度与纯度，并稀释至 100 ng·μL －1，置于 － 20 ℃冰箱中备用。
1．2．2 TＲAP-PCＲ 扩增程序 在郑志雷［9］厚朴 SＲAP-PCＲ 扩增程序基础上改进:94 ℃预变性 5 min;
94 ℃变性 1 min，40 ℃复性 1 min，72 ℃延伸 1 min，5 个循环;然后将退火温度升至 50 ℃，其它条件不变进
行 38 个循环;最后 72 ℃延伸 10 min。
1．2．3 引物设计 固定引物采用 Primer Premier 5． 0 软件设计:从美国国立生物技术信息中心(National
Center of Biotechnology Information，NCBI)数据库中找到凹叶厚朴相关基因的表达序列标签(expressed
sequence tag，EST) ;将 EST序列输入 Primer Premier 5．0 的输入框中，在功能区中选择 Primer;设置搜索目
的及搜索类型分别为 PCＲ Primers及 Sense Primer，引物长度设为 18 bp;选择排名在前、得分高、各项指标
达标的引物作为固定引物用于 TＲAP 分析。固定引物选用调节凹叶厚朴生长发育的相关基因 Leafy、
PHYA、GAI1，光合作用相关基因 psbA-trnH、rbcL、petD 及蛋白质生物合成相关基因 ＲPS16、5． 8 SrNA，共 8
条。随机引物选用在厚朴上扩增效果较好的 SＲAP下游引物 Em1 － Em9。引物序列见表 1。
表 1 凹叶厚朴 TＲAP-PCＲ引物
Table 1 TＲAP-PCＲ primers of M． officinalis subsp． biloba
固定引物 引物序列(5-3) 随机引物 引物序列(5-3)
Leafy GCCGAAGATGAGACACTA Em1 GACTGCGTACGAATTAAT
PHYA GGTATGACAGGGTGATGG Em2 GACTGCGTACGAATTTGC
GAI1 ATGAAACAAGGGCTCCAA Em3 GACTGCGTACGAATTGAC
psbA-trnH CTCCGCTCTAATTTCCAC Em4 GACTGCGTACGAATTTGA
rbcL GTTCAAAGCCCTACGAGC Em5 GACTGCGTACGAATTAAC
petD ACTATCGGAGTGAAACAA Em6 GACTGCGTACGAATTGCT
ＲPS16 CATTTATCAGAGGGAAGG Em7 GACTGCGTACGAATTCAA
5．8 SrNA GGGGATGGTGACGCTTGT Em8 GACTGCGTACGAATTAGC
Em9 GACTGCGTACGAATTACG
1．2．4 TＲAP反应体系参数优化 采用均匀试验初步选出扩增效果较理想的参数水平，根据所筛选的结
果进一步设计正交试验，选出适用凹叶厚朴的 25 μL TＲAP-PCＲ 最优反应体系。初步筛选出 15 号 DNA
模板作为此次优化试验的固定模板，引物组合 Leafy-Em1 作为固定引物。将影响 TＲAP-PCＲ 效果的 5 个
关键因素(DNA 模板、Mg2 +、dNTPs、引物、Taq 酶)作为试验优化的主要因子，参考茶树(Camellia
sinensis)［10］、花生(Arachis hypogaea)［11］等植物的 TＲAP反应体系以及厚朴的 SＲAP优化体系［12］，安排均匀试
验 U7(7
6) (表 2)。
根据均匀试验的结果，选择各因素水平(表 3)安排正交试验 L16(4
5)。
1．2．5 TＲAP-PCＲ产物检测 扩增产物采用 1．8%琼脂糖凝胶电泳，Gold View核酸染料染色。电泳条件:
取 10 μL PCＲ产物与 2 μL 6 × loading buffer 混匀，电压 120 V，电流 120 mA，于 DYY-8C 型电泳仪电泳
·661· 福 建 林 学 院 学 报 第 34 卷
55 min。电泳结果于 JS-680 全自动数码凝胶成像分析仪观察照相。
表 2 TＲAP体系优化均匀试验
Table 2 Uniform design of TＲAP system optimization
试验号
模板 DNA
ng·μL －1
MgCl2
mmol·L －1
dNTPs
mmol·L －1
引物
μmol·L －1
Taq DNA聚合酶
U
1 0．8 1．2 0．22 0．4 2．25
2 1．6 1．8 0．28 0．1 2．00
3 2．4 2．2 0．20 0．5 1．50
4 3．2 0．8 0．26 0．2 1．00
5 4．0 1．5 0．18 0．6 0．75
6 4．8 2．0 0．24 0．3 0．50
7 5．6 2．5 0．30 0．7 2．50
表 3 正交试验各因素及水平
Table 3 Factors and levels of orthogonal design
水平
因素
模板 DNA
ng·μL －1
MgCl2
mmol·L －1
dNTPs
mmol·L －1
引物
μmol·L －1
Taq DNA聚合酶
U
1 0．8 1．2 0．18 0．1 0．50
2 1．6 1．5 0．22 0．3 0．75
3 4．0 1．8 0．24 0．4 2．00
4 4．8 2．0 0．28 0．6 2．25
2 结果与分析
2．1 TＲAP-PCＲ均匀试验结果分析
根据均匀试验(表 2)对凹叶厚朴进行 TＲAP-PCＲ 扩增，结果如图 1 所示。7 个不同因素水平组合处
理，扩增结果存在明显差异。其中 4 号处理无扩增条带，这是由于 Mg2 +浓度过低;7 号处理条带最亮，然
而条带数少，拖尾严重，背影弥散，谱带不清晰，这是由于 Mg2 +、dNTPs、Taq酶浓度过高引起;3 号处理条带
较亮，然而拖尾较严重，谱带较模糊，这是由于 Mg2 +浓度偏高;1、2、5、6 号处理扩增效果相对较好，然而条
带数、条带亮度以及谱带清晰度存在明显差异。为得到最优反应体系，初步筛选出均匀试验中 1、2、5、6 号
处理的各因素水平作为依据进一步进行正交试验。
注:M为 DNA Marker，其片段由上至下分别为 1 000，900，800，700，600，500，400，300，200 bp;1 － 7 为 1 － 7 号均匀试验号。
图 1 凹叶厚朴均匀试验结果
Figure 1 Test results of uniform design of M． officinalis subsp． biloba
2．2 TＲAP-PCＲ正交试验结果分析
凹叶厚朴正交试验 TＲAP-PCＲ扩增结果见图 2。16 个正交处理试验结果中，条带亮度、条带数以及谱
带清晰度都存在较明显差异。1 号试验中无扩增条带出现，导致这一结果的原因是各因素浓度太低;15 号
试验中条带数较少且较模糊，这是由于 Taq酶量过少、dNTPs浓度偏低引起;4 号试验中扩增条带较亮，然
·761·第 2 期 翁剑等:凹叶厚朴 TＲAP-PCＲ体系建立
而拖尾较严重，这是由于 Taq酶量过多、Mg2 +浓度过高引起;12 号试验中条带数较多，谱带较清晰，但条带
较模糊，这是由于引物浓度太低引起;其中 7 号试验结果较理想，条带数较多且较亮，谱带较清晰。
注:M为 DNA Marker，其片段由上至下分别为 1 000，900，800，700，600，500，400，300，200 bp;1 － 16 为 1 － 16 号正交试验号。
图 2 凹叶厚朴正交试验结果
Figure 2 Test results of orthogonal design of M． officinalis subsp． biloba
为进一步客观分析以得到最优反应体系，根据条带数量、亮度及谱带清晰度对各试验结果进行打分，
每指标最低分为 0 分，最高分 10 分，各指标累加值为试验得分值，每试验 3 重复，平均得分值作为最终统
计指标，分析结果见表 4。由 k 值大小得出各因素最佳水平为:模板 DNA 40 ng、Mg2 + 1． 5 mmol·L －1、
dNTPs 0．28 mmol·L －1，固定引物及随机引物 0．3 μmol·L －1，Taq DNA聚合酶 0．75 U。由极差 Ｒ 值大小可
知 Taq DNA聚合酶为主导因子，各因素主次排列为 Taq DNA聚合酶 ＞ dNTPs ＞模板 DNA ＞ Mg2 + ＞引物。
表 4 TＲAP体系优化正交试验结果
Table 4 Orthogonal design and result of TＲAP system optimization
试验号
因素
模板 DNA
ng·μL －1
MgCl2
mmol·L －1
dNTPs
mmol·L －1
引物
μmol·L －1
Taq DNA聚合酶
U
平均得分
1 0．8 1．2 0．18 0．1 0．50 0
2 0．8 1．5 0．22 0．3 0．75 16
3 0．8 1．8 0．24 0．4 2．00 10
4 0．8 2．0 0．28 0．6 2．25 15
5 1．6 1．2 0．22 0．4 2．25 13
6 1．6 1．5 0．18 0．6 2．00 14
7 1．6 1．8 0．28 0．1 0．75 19
8 1．6 2．0 0．24 0．3 0．50 16
9 4．0 1．2 0．24 0．6 0．75 14
10 4．0 1．5 0．28 0．4 0．50 17
11 4．0 1．8 0．18 0．3 2．25 16
12 4．0 2．0 0．22 0．1 2．00 14
13 4．8 1．2 0．28 0．3 2．00 17
14 4．8 1．5 0．24 0．1 2．25 15
15 4．8 1．8 0．22 0．6 0．50 6
16 4．8 2．0 0．18 0．4 0．75 15
k1 10．250 11．000 11．250 12．000 9．750
k2 15．500 15．500 12．250 16．250 16．000
k3 15．250 12．750 13．750 13．750 13．750
k4 13．250 15．000 17．000 12．250 14．750
Ｒ 5．250 4．500 5．750 4．250 6．250
2．3 TＲAP优化体系效果验证
采用所建立的 TＲAP优化体系筛选引物组合，对 16 个不同种源凹叶厚朴 DNA 进行 PCＲ 扩增，图 3、
图 4 为引物组合 Leafy-Em6 及 PetD-Em7 的扩增结果。16 个凹叶厚朴种源 DNA图谱清晰、多态性丰富，体
·861· 福 建 林 学 院 学 报 第 34 卷
系稳定，表明所建立的 TＲAP-PCＲ优化体系效果较好，可应用于凹叶厚朴相关研究。
注:M为 DNA Marker，其片段由上至下分别为 3 000，2 000，1 500，1 200，1 000，900，800，
700，600，500，400，300，200，100 bp;1 － 16 为 1 － 16 号种源。
图 3 引物 Leafy-Em6 对 16 个种源凹叶厚朴扩增结果
Figure 3 Primer Leafy-Em6 amplification results of 16 provenances of M． officinalis subsp． biloba
注:M为 DNA Marker，其片段由上至下分别为 3 000，2 000，1 500，1 200，1 000，900，800，
700，600，500，400，300，200，100 bp;1 － 16 为 1 － 16 号种源。
图 4 引物 PetD-Em7 对 16 个种源凹叶厚朴扩增结果
Figure 4 Primer PetD-Em7 amplification results of 16 provenances of M． officinalis subsp． biloba
3 结论与讨论
均匀试验舍弃了正交试验中的整齐可比，大大减少了试验次数。在多因素多水平的试验中具有其特
有的优势。潘晓华等［13］采用均匀试验对樟树的 ＲAPD 扩增体系进行优化也得到了较理想的效果。然而
均匀试验只考虑试验点的均匀分布，直接得出的最优试验结果不一定是真正的最优组合，且由于体系优化
试验结果较难应用回归模型等手段进行客观分析，得到的结果有较强的主观性。正交试验不仅可以弄清
各因素对试验结果的影响情况，也可弄清因素间主次及交互作用关系，应用统计分析选出最优水平组合，
具有一定的客观准确性。然而 PCＲ体系优化试验，特别是新扩增体系的建立需要考查的因素及水平数往
往较多，若直接采用正交试验将大大增加试验次数。科学研究往往追求事半功倍，将均匀试验与正交试验
结合，首先采用均匀试验在水平数较多情况下选出效果较好的因素水平范围，并进一步应用正交试验在水
平数较少情况下，优上选优，选出最优水平组合。二者有效结合应用不仅可弥补双方的缺点，且有效地发
挥了各自的优势。由试验结果可知，该试验方法大大减少试验次数且效果较好，试验方法可行。
TＲAP技术作为一种新型分子标记技术具有诸多优点，是遗传多样性、遗传图谱构建等相关研究的理
想分子标记。TＲAP固定引物需依据 EST序列数据库设计而来，目前厚朴 EST数据库还不够庞大，这在一
定程度上限制了 TＲAP技术的应用。然而，随着测序技术的发展，大规模 EST序列信息将得到开发，TＲAP
技术将具有广阔的应用前景。通过优化试验，建立可应用于凹叶厚朴的 TＲAP-PCＲ优化体系，对今后的相
关研究及实践具有重要价值。建议在今后的研究中结合利用 TＲAP-PCＲ分子标记优化体系，进一步开展
·961·第 2 期 翁剑等:凹叶厚朴 TＲAP-PCＲ体系建立
凹叶厚朴 TＲAP-PCＲ亲缘关系和遗传多样性分析等相关研究，充分运用 TＲAP标记技术。
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( 责任编辑: 温凤英)
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