全 文 ：［收稿日期］ 20120412(010)
［基金项目］ 国家科技支撑计划项目(2009BAI74B 02-4) ;国家自然科学基金项目(81060340) ;贵州省科技创新人才团队建设项目(黔科
合人才团队(2011)4008) ;贵阳市科技计划项目( ［2010］筑科成合同字第 1-创-27 号) ;贵州省中药现代化科技产业研究开
发专项项目(黔科合中药专字［2007］5023 号)
［第一作者］ 张明，在读硕士研究生，中药学专业，E-mail:zhangming5363@ 126． com
［通讯作者］ * 周欣，博士，教授，从事中药、民族药质量控制、中药指纹图谱及中药新药研发等，Tel:0851-6702167，E-mail:alice9800@
sina． com
杠板归中总黄酮的含量测定
张明1，陈华国1，2，赵超1，2，周欣1，2* ，谭济苍3，薛静3，杨世林1，2
(1. 贵州师范大学天然药物质量控制研究中心，贵阳 550001;
2. 贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵阳 550001;
3. 贵州远程制药有限责任公司，贵阳 550018)
［摘要］ 目的:建立杠板归中总黄酮的含量测定方法。方法:以芦丁为对照品，以 0. 1 mol·L － 1 AlCl3 溶液、1 mol·L
－ 1 NaAc
溶液为显色剂，检测波长 413 nm。结果:芦丁吸光度与其浓度在 6. 24 ～ 21. 84 μg 线性良好(r = 0. 999 8) ，总黄酮回归方程为
Y = 38. 183X － 0. 001;平均加样回收率为 97. 4%，RSD 2. 2%。结论:方法简便、稳定，可用于杠板归中总黄酮的含量测定。
［关键词］ 杠板归;总黄酮;比色法;显色方式;提取;紫外-可见分光光度计
［中图分类号］ R284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2012)18-0077-04
［网络出版地址］ http:/ / www． cnki． net / kcms / detail /11． 3495． R． 20120711． 1207． 026． html
［网络出版时间］ 2012-7-11 12:07
Determination of Content of Total
Flavonoids from Polygonum perfoliatum
ZHANG Ming1，CHEN Hua-guo1，2，ZHAO Chao1，2，ZHOU Xin1，2* ，
TAN Ji-cang3，XUE Jing3，YANG Shi-lin1，2
(1. Research Center for Quality Control of Natural Medicine，Guizhou Normal University，
Guiyang 550001，China;2. Key Laboratory for Information System of Mountainous Areas and Protection
of Ecological Environment，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，China;
3. Guizhou Long-range Pharmaceutical Co．，Ltd．，Guiyang 550018，China)
［Abstract］ Objective: To establish a method for determination of total flavonoids in Polygonum
perfoliatum． Method: Total flavoaoids were determined by UV-Vis spectrophotometer with rutiu as reference
substance and 0. 1 mol·L － 1 AlCl3，1 mol·L
－ 1 NaAc as chromogenic agent;the detection wavelength was at 413
nm． Result:A good linear relationship was achieved over the concentration range of 6. 24-21. 84 μg (r =
0. 999 8) for Rutin． The regression equation of total flavonoids was Y = 38. 183X － 0. 001，with an average
recovery of 97. 4%，RSD 2. 2% ． Conclusion:The method is simple and stable，and it is suitable for the content
determination of total flavonoids from P． perfoliatum．
［Key words］ Polygonum perfoliatum; total flavonoids;colorimetry; the way of coloration;extraction;
UV-Vis spectrophotometer
·77·
第 18 卷第 18 期
2012 年 9 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 18
Sep．，2012
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.18.038
杠板归为蓼科植物杠板归的干燥地上部分，具
有清热解毒、利水消肿、止咳的功能［1］，主要含有黄
酮类、蒽醌类、苯丙素糖酯类和其他类化合物［2］。
杠板归具有抗病毒、抗氧化、抗菌、抗炎、止咳祛痰、
护肝、抗癌等作用［3］。用于肾炎水肿、百日咳、泻
痢、湿疹、疖肿、毒蛇咬伤等［4］。药材所含的黄酮类
化合物较多，赵超等［5］从杠板归中分离出槲皮素、
芦丁等 7 个黄酮类化合物。现代研究证明，黄酮类
化合物具有多种药理活性，本实验通过对杠板归总
黄酮的含量测定方法的建立，为考察杠板归内在质
量提供定量依据。
1 材料
药材经贵州师范大学陈华国副研究员鉴定为杠
板归 Polygonum perfoliatum L．，过 60 目筛;对照品芦
丁(中国药品生物制品检定所，批号 080-9303) ;
Cary Bio 100 型紫外-可见分光光度计(美国 Varian
公司) ;AL204 型电子天平［梅特勒-托利多仪器(上
海)有限公司) ］;电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪
器有限公司) ;实验所用甲醇、乙醇、三氯化铝、乙酸
钠等试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 对照品溶液的制备 精密称取已干燥至恒重
的芦丁对照品，用 80% 的乙醇溶解，配成 0. 156 g·
L － 1的溶液，密封低温保存备用。
2. 2 供试品溶液制备方法的确定 根据中药材固-
液两相浸渍提取过程的理论与知识，影响提取过程
的主要因素有:提取溶剂的浓度、料液比、温度、时
间、次数等。采用单因素实验，对主要的提取影响因
素进行考察，结果见图 1。
2. 2. 1 提取溶剂 精密称取杠板归药材 3 份，分别
采用甲醇、乙醇、水作为提取溶剂，水浴回流提取，固
液比 1∶ 40，提取 1 次，时间 2 h，温度 60 ℃，滤液定
容到 25 mL 量瓶中，显色测定，结果总黄酮提取率分
别为 1. 35%，1. 90%，2. 00%，最终选取乙醇作为提
取溶液。结果见图 1。
图 1 各因素对杠板归中总黄酮提取率的影响
2. 2. 2 溶剂浓度 精密称取杠板归药材 6 份，乙醇
回流提取，提取 1 次，提取时间 2 h，提取温度 60 ℃，
固液比 1 ∶ 40，体积分数分别为 40%，50%，60%，
70%，80%，90%，进行测定，优选提取浓度。最终选
取 80%乙醇作为总黄酮提取溶剂。
2. 2. 3 固液比 精密称取杠板归药材 4 份，80%乙
醇回流提取，提取 1 次，提取时间 2 h，提取温度
60 ℃，固液比分别为 1∶ 10，1∶ 15，1∶ 20，1∶ 25，进行测
定，优选提取的固液比。最终选取固液比为 1∶ 15。
2. 2. 4 提取温度 精密称取杠板归药材 6 份，80%
乙醇回流提取，提取 1 次，提取时间 2 h，固液 1∶ 15，
提取温度分别为 40，50，60，70，80，90 ℃，进行测定，
优选提取温度。最终选取提取温度为 80 ℃。
2. 2. 5 提取时间 精密称取杠板归药材 6 份，80%
乙醇回流提取，提取 1 次，固液比 1 ∶ 15，提取温度
80 ℃，提取时间分别为 20，40，60，80，100，120 min，
进行测定，优选提取时间。最终选取提取时间为
100 min。
2. 2. 6 提取次数 精密称取杠板归药材 4 份，80%
乙醇回流提取，固液比 1 ∶ 15，提取温度 80 ℃，提取
·87·
第 18 卷第 18 期
2012 年 9 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 18
Sep．，2012
时间 100 min，提取次数分别为 1，2，3，4 次，进行测
定，优选提取次数。最终选取提取次数为 2 次。
供试品溶液制备方法为:精密称取杠板归药材
约 0. 4 g，采用 80%的乙醇作为提取溶剂，水浴加热
回流提取，固液比 1∶ 15，提取 2 次，每次 100 min，提
取温度 80 ℃，合并滤液，回收溶剂，用 80% 的乙醇
溶液定容到 25 mL 的量瓶中，待用。
2. 3 显色条件的确定
2. 3. 1 AlCl3 的加入量 精密吸取供试液 5 份，每
份 0. 5 mL，分别加入 0. 1 mol·L － 1 AlCl3 水溶液 1，
1. 5，2，2. 5，3 mL，加入 80%的乙醇溶液至 10 mL，摇
匀，用紫外-可见分光光度计，进行全波长扫描，测定
最大吸收波长以及吸光度(A)。AlCl3 用量为 3 mL
(最大吸收波长 λmax = 403 nm)反应达到饱和，故选
用 0. 1 mol·L － 1 AlCl3溶液 3 mL 作为显色剂(图 2)。
2. 3. 2 NaAc 溶液加入量 精密吸取供试液 6 份，
每份 0. 5 mL，加入 0. 1 mol·L － 1 AlCl3 水溶液 3 mL，
分别加入 NaAc 溶液 1，2，3，4，5，6 mL，加入 80%的
乙醇溶液至 10 mL，摇匀，进行全波长扫描，测定最
大吸收波长以及吸光度(A)。NaAc 用量为 3 mL
(λmax = 413 nm) ，故选用 1 mol·L
－ 1 NaAc 水溶液 4
mL 作为显色剂(图 2)。
2. 3. 3 平衡时间的考察 精密吸取供试品液 5 份，
每份 0. 5 mL，放入 10 mL 量瓶，并放置在 25 ℃的水
浴中，加入 AlCl3 溶液 3 mL，NaAc 溶液 4 mL 之后，
经过 2，4，6，8，10 min 之后取出，放冷到室温，再加
入 80%乙醇至刻度，全波长扫描测定 λmax处吸光度，
结果 RSD 0. 9%，说明反应时间短，2 min 内即可达
到平衡。
2. 3. 4 显色温度的考察 精密吸取供试品液 5 份，
每份 0. 5 mL，按 2. 3. 3 项下方法，显色时间 2 min，
分别在 20，30，40，50，60 ℃水浴中进行操作，进行全
波长扫描，测定结果 50，60 ℃ 下有沉淀产生。在
20，30，40 ℃温度条件下，测得 RSD 2. 0%，在 20 ～
40 ℃，吸光度的变化不大，故采用 20 ℃水浴条件下
进行显色。
故确定本实验的显色方法为:把 10 mL 量瓶中
放入 20 ℃水浴锅中，加样品后，加入 0. 1 mol·L － 1
AlCl3溶液 3 mL，然后加入 1 mol·L
－ 1 NaAc 溶液
4 mL，反应 2 min 后取出，用 80%乙醇定容，溶液温
度到室温即可测定。以样品空白，用 80%乙醇同法
制备参比溶液。采用所得的显色方法显色，对芦丁
溶液和样品溶液进行全波长扫描，结果芦丁溶液的
λmax = 417 nm，样品溶液的 λmax = 413 nm，故采用样
图 2 各显色试剂用量对吸光度的影响
品溶液的 λmax = 413 nm 作为检测波长。
2. 4 标准曲线的制作 精密吸取芦丁对照品溶液
0. 4，0. 6，0. 8，1. 0，1. 2，1. 4 mL，按 2. 3 项下方法取
进行显色，测定吸光度，以吸光度(Y)与质量浓度
(X)绘 制 标 准 曲 线，芦 丁 的 回 归 方 程 为 Y =
38. 183X － 0. 001(r = 0. 999 8) ;表明芦丁含量在
6. 24 ～ 21. 84 μg 其质量浓度与吸光度呈良好线性
关系。
2. 5 方法学考察
2. 5. 1 精密度实验 精密吸取对照品溶液 6 份，每
份 1 mL，按 2. 3 项下方法取进行显色，测定吸光
度，RSD 1. 4%。
2. 5. 2 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液
0. 5 mL，置 10 mL 量瓶中，按 2. 3 项下方法显色后，
分别于 0，15，30，60，90，120 min 之后测定吸光度，
计算 RSD 0. 4%，表明其在显色后的 120 min 内稳定
性较好。
2. 5. 3 重复性试验 精密称取杠板归药材约
0. 4 g，共 6 份，按 2. 2 项下方法制备杠板归供试品
溶液;按上述显色方法显色，测定吸光度，杠板归中
总黄酮的平均含量为 2. 06%，RSD 1. 6%;表明该方
法重复性好。
2. 5. 4 加样回收率试验 精密称取杠板归药材约
0. 2 g，加入 3 个不同质量浓度的芦丁，质量浓度分
别为供试品浓度的 0. 8，1，1. 2 倍，每个浓度制作 3
份进行测定，结果平均加样回收率为 97. 4%，RSD
·97·
张明，等:杠板归中总黄酮的含量测定
2. 2%，见表 1。
2. 6 不同产地药材的含量测定 采用建立的含量
测定方法，分别对不同产地杠板归药材中总黄酮的
含量进行测定，结果见表 2。
表 1 杠板归中芦丁加样回收率试验
No．
称样量
/ g
样品
含量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
珋x
/%
RSD
/%
1 0. 195 6 4. 03 3. 30 7. 19 96. 0
2 0. 193 0 3. 98 3. 30 7. 08 94. 2
3 0. 197 4 4. 07 3. 30 7. 36 99. 8
4 0. 196 4 4. 05 4. 12 8. 15 99. 7
5 0. 200 1 4. 12 4. 12 8. 17 98. 2 97. 4 2. 2
6 0. 198 0 4. 08 4. 12 8. 02 95. 6
7 0. 196 2 4. 04 4. 94 8. 96 99. 5
8 0. 195 3 4. 02 4. 94 8. 74 95. 4
9 0. 197 2 4. 06 4. 94 8. 90 97. 8
表 2 不同产地杠板归总黄酮含量测定(n = 3) %
产地 采集时间 平均含量
湖南辰溪 2008-08-15 1. 15
安徽大别山 2008-08 1. 04
花溪区高坡 2008-06 1. 76
花溪区牛郎关大兴田 2009-08-09 2. 06
3 讨论
总黄酮的含量测定一般采用亚硝酸法(NaNO2-
A1(NO3)3 -NaOH) ，但该方法也存在一些缺点。郭
亚健［6］等以芦丁为对照品，运用该方法测定多种黄
酮及非黄酮化合物在 400 ～ 700 nm 的吸收曲线，结
果总黄酮方法专属性差，有些黄酮类物质在 500 nm
处无最大吸收或吸收很弱，而有些非黄酮类物质在
500 nm 处有最大吸收或有较强吸收，非黄酮类物质
(如咖啡酸)在 500 nm 左右有最大吸收，而赵超［7］
等从杠板归中分离到咖啡酸，刘青［8］等测定杠板归
药材中咖啡酸的含量，若采用该显色方法测定，所测
含量可能偏大。在测定总黄酮含量的文献报道中，
有部分采用三氯化铝法［9-11］进行测定;采用 2. 3 项
下方法对咖啡酸对照品溶液进行显色，测得 λmax =
342 nm，在可见光区基本无吸收，故本实验采用三氯
化铝显色法进行，但文献中该显色方法不固定，故本
实验对显色剂的用量进行了考察。
对显色方法的考察，当加入 AlCl3 溶液时，样品
溶液 λmax = 403 nm，再加入 NaAc 溶液，λmax = 413
nm，吸光度值也增加，芦丁对照品也出现这样的现
象，这是由于醋酸根离子对黄酮类化合物作用，产生
红移，使得 λmax向可见光区偏移;NaAc 溶液的加入
也使得吸光度增加，故加入 NaAc 溶液。本实验样
品溶液制备方法中，用 80%乙醇在 80 ℃水浴中回
流提取;一般提取温度保持在沸点以下或煮至近于
沸点，即所谓的微沸状态，溶剂重复的蒸发、冷凝，起
到搅拌的作用，低温对物质的损坏较少;80%乙醇在
80 ℃温度下处于微沸状态，证明杠板归总黄酮的提
取可能符合这一理论。
［参考文献］
［1］ 中国药典 ．一部［S］． 2010:155.
［2］ 李红芳，赵友兴，钱金栿，等 ． 杠板归化学成分及药理
作用 研 究 进 展［J］． 安 徽 农 业 科 学，2008，86
(27) :11793.
［3］ 刘玉梅，范文昌 ．杠板归药理作用与临床应用研究进
展［J］．亚太传统医药，2011，7(6) :162.
［4］ 江苏新医学院 ． 中药大辞典(上册) ［M］． 上海:上海
科学技术出版社，2000:869．
［5］ 赵超，陈华国，龚小见，等 ． 杠板归的化学成分研究
(Ⅱ) ［J］． 中草药，2010(3) :365.
［6］ 郭亚健，范莉，王晓强，等 ． 关于 NaNO2 -Al(NO3)3 -
NaOH 比色法测定总黄酮方法的探讨［J］． 药物分析
杂志，2002，22(2) :98.
［7］ 赵超，周欣，秦翱，等 ．杠板归的化学成分研究［J］． 中
成药，2009，31(10) :1610.
［8］ 刘青，黄家宇，薛静，等 ． 杠板归药材中咖啡酸的含量
测定［J］．临床医药实践，2009，18(6) :1803.
［9］ 邢攀科，杨洁红，张宇燕，等 ． 大孔吸附树脂分离纯化
补阳还五汤中总黄酮［J］． 中国实验方剂学杂志，
2010，16(15) :2.
［10］ 宋学立，杨维高 ．正交设计法研究月腺大戟注射液最
佳生产工艺［J］． 中国实验方剂学杂志，2000，6
(5) :14.
［11］ 赵法兴，张亚梅，郝岗平 ． 二仙汤有效部位群大孔树
脂纯化工艺［J］． 中国实验方剂学杂志，2011，17
(14) :24.
［责任编辑 顾雪竹］
·08·
第 18 卷第 18 期
2012 年 9 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 18
Sep．，2012