全 文 ：在本试验条件下 ,不适宜采用酸碱沉淀法进行四倍体
刺槐叶蛋白的提取。
(4)采用上述工艺条件提取四倍体刺槐叶蛋白 ,
叶蛋白粗蛋白含量平均达到 33%,可作为良好的食
品添加剂 ,残渣粗蛋白含量也可达到 17%左右 ,可作
为饲料利用 。四倍体刺槐适应性强 ,在我国的栽培范
围广 ,产叶量大 ,资源十分丰富 ,因此四倍体刺槐叶蛋
白的开发利用具有较大的潜力 。采用本文的工艺提
取四倍体刺槐叶蛋白的提取率平均为 7. 6%,高于刺
槐 、紫云英 、烟叶 、桑叶等植物 [ 3, 6 - 8] 。可见四倍体刺
槐的开发利用可成为解决我国蛋白质资源不足问题
的一条新途径。
参考文献:
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开发 , 2006(2):79 -81. (008)
收稿日期:2006-07-30
基金项目:国家自然基金重点项目(30230260)
作者简介:罗胜军(1974-), 男 , 硕士研究生 .
通讯作者:王 哲(1950-), 男 ,教授 , 硕士 ,博士生导师 .
BSA系统 ELISA检测相思子毒素抗原方法的建立
罗胜军 , 王 哲* , 高英杰 , 李小兵 , 刘国文 , 谢光洪 , 徐慧娟 , 马惠海 ,江 涛 , 孙广瑞
(吉林大学 畜牧兽医学院 ,吉林 长春 130062)
中图分类号:S529 文献标识码:B 文章编号:1004-7034(2007)09-0057 03
相思子毒素 (Abrin)是存在于豆科植物相思子
(AbrusP reca - torius L. )种子中的一种毒蛋白 ,与蓖麻
毒素(ricin)同为 Ⅱ型核糖体失活蛋白 (R IP)家族成
员 ,相思子毒素 (Abrin)是从其种子中提取的一种剧
毒性高分子糖蛋白毒素 , 其相对分子质量为 60 ～ 65
ku的糖蛋白 ,分子由 A、B 2条多肽链通过 1个二硫
键连接而成 [ 1] ,其含量约占种子 2. 8% ～ 3. 0%,是迄
今为止所发现的毒性最强的植物毒素之一 ,毒性是普
通化学武器的几百倍[ 2] 。成年人摄入的致死剂量为
5. 0 ～ 7. 0μg /kg,对小鼠的毒性是蓖麻毒素的 75倍 ,
只要毫克量即可致人死命 ,具备毒性高 、中毒后无特
殊的临床表现 ,诊断比较困难等生物毒素武器的典型
特征。此外 ,由于相思子毒素是一种有效的蛋白质合
成抑制剂 ,它在抗肿瘤方面的应用也引起广泛重视 ,
对多种肿瘤细胞及几种人癌移植物有很强的抑制作
用 ,可能成为一种极有前途的抗癌药物 。因此 ,无论
是从核查角度 ,还是为防护 、治疗应用目的 ,开展对相
思子毒素检测技术的研究 ,建立一种灵敏 、快速的检
测方法对于免疫毒素药代动力学研究 、临床用药和相
思子毒素中毒诊断 、法医鉴定及反生物恐怖都具有重
要的意义。试验用生物素 -链霉亲合素酶联免疫吸
附法(BSA - ELISA)测定相思子毒素 ,报道如下。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 试剂 活化长臂生物素标记试剂盒 (Sulfo -
NHS -LC - B io tiny lation K it)、碱性磷酸酶标记的链
霉亲合素 (A lkaline Phospha tase S trep tav idin)、底物 -
磷酸对硝基苯酯 (PNPP)均购自美国 Pierce公司;相
思子毒素标准品 、兔抗相思子毒素多抗 、鼠抗相思子
毒素单克隆抗体由本实验室提供;牛血清白蛋白 、明
胶 、酪蛋白和卵清蛋白购自 Genv iew公司;其他试剂
均为进口分装或国产分析纯化学试剂;试验用水为超
纯水或去离子水。
1. 1. 2 设备 BS210S电子天平为美国赛多利斯
(Sartorius)公司产品;超纯水仪为 M illipore公司产
品;HI98128型酸度计为意大利 HANNA公司产品;
酶联免疫检测仪为美国 B io - Rad550型;微量加样
器 , G ilson公司产品;96孔单条可拆酶标板为美国
CORN ING公司产品 。
1. 2 方法
1. 2. 1 生物素标记单抗 标记抗体按试剂盒说明
书进行。
1. 2. 2 BSA - ELISA法工作流程 本试验采用生物
素 -链亲合素系统放大的 ELISA(BSA - ELISA )方
法 , 以 Abrin多抗为包被抗体 、生物素标记的 Ab rin
单抗为标记抗体 。 (1)包被。将兔抗相思子毒素多
抗用 0. 05 mol /L, pH值 9. 6的碳酸盐缓冲液稀释后
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《黑龙江畜牧兽医》2007年第 9期
包被 96孔酶标板 ,每孔 100 μL,置 4 ℃冰箱过夜 ,用
洗液洗板 4次拍干 。 (2)封闭 。用封闭液 200 μL /孔
封闭酶标板 , 37 ℃恒温箱中置 2 h,之后用洗液洗涤
4次拍干 , 37 ℃置 1. 5 h ,干燥后 ,置 4 ℃冰箱备用 ,
即为反应板。 (3)加待检样品。用稀释液将被检样
品倍比稀释 ,每孔 100μL, 37℃置 1. 5 h,之后用洗液
洗涤 4次拍干。 (4)加生物素标记单抗 。将生物素
标记单抗按工作浓度稀释 ,每孔 100 μL, 37℃置 1 h,
同上洗涤 4次拍干。 (5)加底物显色 。显色前将底
物 PNPP溶解于底物缓冲液中(每 2mL pH值 9. 8的
5. 1mo l /L二乙醇胺加 8 mL超纯水 , 10 mL该缓冲液
溶解 10 mg PNPP)。每孔加 100 μL, 室温下显色
15 m in,每孔 50μL 2 mo l /L氢氧化钠终止反应 ,用自
动酶标仪检测吸光度值。
1. 2. 3 包被条件 按 BSA - ELISA法工作流程 ,采
用棋盘滴定法确定包被条件 、生物素化单克隆抗体及
AP标记链霉亲合素的工作浓度 ,并对封闭剂 、最适反
应时间进行选择 。据优化的最佳条件建立标准工作
曲线 ,考核该方法的灵敏度 、重复性 、特异性及人工污
染香肠及生理盐水样品中相思子毒素的回收率 。
2 结果
2. 1 包被条件
选择 3种缓冲液 ,即 pH值 5. 0, 0. 02mo l /L枸橼
酸盐缓冲液;pH值 7. 4, 0. 01 mol /L磷酸盐缓冲液及
pH值 9. 6, 0. 02 mol /L碳酸盐缓冲液 ,结果以磷酸盐
缓冲液包被后吸附毒素能力最强 ,非特异性吸附最
小 。包被的多抗浓度在 6 ～ 12 μg /mL时检测灵敏度
高 ,本试验选择多抗的包被浓度为 8 μg /mL。
2. 2 封闭剂的选择
板包被后 ,还需封闭。微孔板是以聚苯乙烯为材
料来吸附蛋白质 ,从而将抗体固相化 。因为包被液中
的蛋白不足以覆盖整个微孔底 ,封闭剂主要是一些蛋
白溶液 。经过封闭 ,可以掩盖微孔底部裸露的部位 ,
减少非特异性吸附 。试验了牛血清白蛋白 、明胶 、酪
蛋白和卵清蛋白的封闭效果。 (1)取酶标板 1块 ,不
包被 ,用 200 μL /孔封闭液封闭 ,置 37 ℃恒温箱中
2 h。 (2)洗板 3次 , 200 μL /孔 ,加二抗 50μL /孔 ,
37 ℃温育 1 h。 (3)洗板 6次 ,加底物显色。 (4)加
终止剂 50μL /孔酶标仪上测吸光度值。结果 ,酪蛋
白 、卵清蛋白和明胶作为封闭剂 ,非特异性吸附较严
重 ,而牛血清白蛋白作为封闭剂的本底较低 ,变异系
数小 ,封闭效果较好 ,因此 , 1%牛血清白蛋白为最佳
封闭剂 。
2. 3 生物素化单克隆抗体及 AP标记链霉亲合素浓
度的选择
采用矩阵法 ,即将不同浓度生物素化单抗以及
AP标记链霉亲合素按 BSA - ELISA法检测 Abrin标
准品 ,结果生物素化单抗稀释浓度为 1 μg /mL, AP -
链霉亲合素稀释度为 1∶500时 ,测得 Abrin的 A值
与 Abrin浓度曲线关系良好。
2. 4 最适反应时间
固相多抗在 37℃、1. 5 h内能最大限度捕获待检
品中的 Abrin。生物素化单抗加入后的孵育时间以
1 h为最佳 ,延长孵育时间后 ,非特异吸附增加而敏感
度下降。 AP链霉亲合素加入后的反应时间在 45 ～
60 m in之间为佳 ,反应时间不足降低检测 Abrin的高
限值 ,过长则明显增加本底值。
2. 5 标准工作曲线的建立
利用 Spss 10. 0统计软件进行曲线估计 ,拟合了
三次曲线模型 , 本法测定 Abrin的标准曲线 Y =
0. 201 9 +0. 039 2X – 0. 000 2X 2 +6×10-7X3(R2
= 0. 997, P <0. 001)。当 Abrin 浓度在 5 ～
200 ng /mL范围内 ,线性关系良好。
2. 6 灵敏度
Abrin浓度为 1, 5, 25, 50, 100, 200 ng /L所测得 A
值分别与本底比较 。结果 5 ng /mL所测得 A值大于
本底 2. 5倍 , P <0. 01,以 1 ng /mL为阳性标准 。本
法测定 Abrin标准品灵敏度可达 5 ng /mL。
2. 7 重复性的测定
取 5, 25, 50, 100, 200 ng /mL 5种浓度的 Abrin,
每种浓度重复测定 9次 (每种浓度同时作 12孔 ),
Abrin的批内变异系数为 1. 76% ～ 4. 64%,批间变异
系数 5. 96% ～ 9. 04%。
2. 8 特异性试验
用蓖麻毒素 、蓖麻凝集素 、相思子凝集素三种类
似物代替相思子毒素用本法测定 , A值均低于 0. 01,
本法与蓖麻毒素 、蓖麻凝集素 、相思子凝集素无交叉
反应现象 。
3 人工污染香肠及生理盐水样品中相思子毒素的回
收率
人工污染的香肠中相思子毒素平均回收率约为
92%,变异系数为 2. 95%;人工污染的生理盐水中相
思子毒素平均回收率约为 85%,变异系数为5. 09%。
4 讨论
(1) BSA系统是一个生物反应放大系统 ,其灵敏
度高。分析其原因有:首先 ,生物素与链霉亲合素的
结合力极高 ,其结合是不可逆的。其次 ,生物素标记
抗体后 ,一般不会影响其活性。第三 ,生物素对抗体
的标记率达到 99%以上 ,不存在未标记抗体竞争对
灵敏度的影响 。最后 ,一个链霉亲合素可以结合多个
生物素化的酶分子 ,故当有一个生物素化的抗体与链
霉亲合素相连时 ,就可以结合多个酶分子 ,从而产生
放大效应 。试验采用 BSA - ELISA法建立了检测
Abrin的方法 , 其优点是非特异吸附很低 , 增加浓度
和延长反应时间可增强阳性显色 , 提高灵敏度 [ 3] 。
(2)由于相思子毒素是一种分子质量较大 (约为
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H e ilong jiang Anim a l Science
and Ve te rina ryM edicine № 9 2007
60 ～ 65 ku)的糖蛋白 ,与相同体积 、浓度 、分子质量较
小的其他抗原相比其分子数量较少 ,因此试验应用生
物素 -链霉亲和素放大系统建立测定相思子毒素的
双抗体夹心 BSA - ELISA检测方法。经过筛选 ,包
被液采用 pH 值 7. 5 PBS液时 ,抗体包被后活性最
佳 ,使用前 4 ℃预冷。封闭液采用 1 g /L牛血清白蛋
白 (BSA),封闭时间不宜超过 2 h,时间过长不但不能
增加封闭效果 ,结合在板上的抗原反而会向封闭液内
脱落 ,影响检测的灵敏度。样品稀释液采用 pH值 7.
4的 PBS内添加终浓度 0. 5 g /L BSA和 0. 05%吐温
- 20,以降低非特异性吸附引起的显色。此测定法特
异性 、敏感性 、重复性均在临床检测可接受范围内 ,标
准曲线关系良好 ,可用于相思子毒素的定量研究 ,为
最终组装试剂盒做了技术储备 。但本试验只是对
BSA - ELISA方法初步探索 ,对于延长其保存时间本
试验还未涉及 。如何提高试验的精密度 、灵敏度 、结
果的稳定性等还待继续进行研究 。
参考文献:
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收稿日期:2006-07-11
基金项目:新疆生产建设兵团工业科技攻关项目(05GG30)
作者简介:刘振华(1980-) , 男 , 硕士研究生 .
通讯作者:李炳奇(1951-), 男 ,教授 , 本科 .
“促生长散 ”中挥发油的提取及包合工艺研究
刘振华 1, 2 , 李炳奇1* , 刘 红 1 , 毛雁升1 , 刘晓红 1
(1.石河子大学 化学化工学院 ,新疆 石河子 832000;2.石河子大学 生命科学学院 ,新疆 石河子 832000)
中图分类号:S816.73 文献标识码:B 文章编号:1004-7034(2007)09-0059 02
石河子大学研究开发的促进羔羊育肥的中药添
加剂 “促生长散” ,为农业部 “九五 ”重点项目 “中草药
添加剂提高畜禽生产性能的研究 ”成果之一。它是
一种纯中药制剂 ,含有较多的挥发油成分 ,多年来应
用效果良好 ,但尚存在很多不足:口感差 ,药效发挥时
间慢 ,有效成分利用率低 ,产品易发霉变质 ,不易贮
存 ,质量可控性差等。为了充分发挥挥发油的效用 ,
增加挥发油在制剂中的稳定性 ,并减少其不良气味 ,
本研究将 “促生长散”中的挥发油单独提取 ,并进行
β -环糊精包合 , 研究出提取和包合的最佳工艺条
件 ,为挥发油的高效利用奠定基础。
1 试验材料
1. 1 主要仪器
电子天平 (北京赛多利斯天平有限公司 ), DL -
360A超声仪 (上海之信仪器有限公司), RE52 - 05
旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂), SHZ -CB型循
环水式多用真空泵 (河南巩义市英峪宁华仪器厂 ),
ZK - 82A型电热真空干燥箱 (上海实验仪器厂有限
公司), KDM型电热套 (武汉精华科技有限公司 ),恒
温装置 (XMT -DA数显调节仪 ), JJ - 1型系列电动
搅拌器(江苏金坛荣华仪器制造有限公司 ),挥发油
提取装置 。
1. 2 试剂和材料
“促生长散”(苍术 、干姜 、肉桂 、木香等 )(石河子
医药公司 ), β -环糊精 (天津大学 ), 无水乙醇 (A.
R),无水硫酸钠 ,纯化水 。
2 试验步骤
2. 1 挥发油的提取
称取一定量原料 ,置于圆底烧瓶中 ,按照 “水蒸
气蒸馏法 ”提取挥发油。试验中分别对吸水率 、加水
量和提取时间进行了考察 ,确定最佳条件。
2. 1. 1 加水量考察 分别称取原料 65. 00 g各 5
份 ,分别加水 8倍 、10倍 、12倍 、14倍 、16倍量 ,蒸馏
12 h,考察收油量 。
2. 1. 2 提取时间考察 称取 65. 00 g原料 ,加水 12
倍 ,使其浸泡相同后分别收集 2 , 4 , 6 , 8 , 10 , 12 h
的挥发油量 ,计算累积收油率。
2. 2 挥发油的包合
采用饱和水溶液法制备包合物 ,试验中以 β -环
糊精与油的配比 、包合时间 、包合温度为因素 ,以综合
评分(满分为 100分 )为考察指标 ,进行正交试验 。
2. 2. 1 包合物的制备 称取一定量的 β -环糊精 ,
加入适量的纯化水 ,在规定的温度下配制饱和溶液 ,
在一定温度的控制下 ,搅拌饱和溶液一定的时间 ,不
断搅拌饱和溶液的同时 ,逐渐滴加用无水乙醇稀释的
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