全 文 ：实用医药杂志 2010 年 09 月 第 27 卷 第 09 期 Prac J Med ＆ Pharm． Vol 27, 2010－09 No．09
[摘 要] 目的 制备相思子毒素单克隆抗体并鉴定其特性。方法 以甲醛处理的相思子毒素毒蛋白为抗原免
疫 BALB/c 小鼠；取免疫小鼠的脾细胞与 Sp2/0 骨髓瘤细胞融合，经间接 ELISA 法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、
克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等方法筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株，用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水，应用蛋白
A 亲和层析法进行单抗的纯化，并对单克隆抗体的特异性进行鉴定。结果 获得了 4 株可稳定分泌单克隆抗体的杂
交瘤细胞 2D3、4E6、1C8 和 1E5， 诱生的腹水效价分别为 1∶1×107、1∶1×106、1∶1×105、1∶1×106， 亚类鉴定表明 2D3 为
IgG1，其余 3 株均为 IgG2b；特异性鉴定显示它们与多种毒素均无交叉反应，经过亲和层析，获得了纯化的单抗。 结
论 获得了特异性的相思子毒素单克隆抗体，为建立相思子毒素的检测及纯化方法奠定了基础，其中 4E6 的效价最
高，可作为检测相思子毒素的核心试剂。
[关键词] 相思子毒素；单克隆抗体；制备
[中图分类号] R392.11 [文献标识码] A
Preparation, purification and characterization of monoclonal antibodies against abrin ZHANG Li-ying①,
ZHAO Huai -long, MA Feng -long, et al. ①The Qingdao 2nd Sanatorium of Jinan Military Region, Qingdao,
Shandong 26607, China
[Abstract] Objective To prepare monoclonal antibodies against abrin toxin and to characterize its
properties. Methods BALB/c mice were immunized with the abrin. The splenocytes of the immunized mice were
fused with Sp2/0 myeloma cells by hybridoma technique. The antibodies against abrin were screened by indirect
enzyme-link immnoadsorption assay (ELISA). The hybridoma cells that secrete antibody were cloned by limiting
dilution method. Results Four hybridoma cell lines were obtained. The monoclonal antibodies 2D3 belonged to
IgG1 subclass, 4E6, 1C8 and 1E5 belonged to IgG2b subclass. The titers of hybridoma cell induced ascites were
1 ∶1×107, 1 ∶1×106, 1 ∶1×105 and 1 ∶1×106 respectively. Conclusion Four monoclonal antibodies against abrin were
prepared successfully, which will facilitate establishing detection method of abrin. The mAb 2D3 against abrin
could be used as the key reagent for establishment of abrin detection method.
[Key words] Abrin; Monoclonal antibodies; Preparation
相思子毒素是从豆科藤本植物相思子（Abrus
precatorius） 的种子中提取的一种剧毒性高分子蛋
白毒素，其含量约占种子 2.8%～3.0%。小鼠的 LD50为
0.04 μg/kg，成年人摄入的致死剂量为 5.0～7.0 μg/kg，
其毒性强度是蓖麻毒素（小鼠 LD50 3.0 μg/kg）的 70
多倍，已被列为潜在的重要毒素战剂和生物恐怖病
原物质之一[1-4]。
国外已有报道恐怖分子用相思子毒素作为恐
怖袭击的手段。 美国陆军医学研究发展总部早在
1991年对相思子毒素单克隆抗体进行研究和应用，
而国内未见相关报道[5-8]。 因此，无论是从国际生物
武器核查角度，还是从防护目的，开展对相思子毒
素的检测研究都具有十分重要的现实意义。
本实验应用相思子毒素毒蛋白免疫 BALB/c 小
鼠制备了相思子毒素单克隆抗体，并对其进行了鉴
定。 拟为发展高灵敏度的相思子毒素检测试剂盒奠
定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 相思子毒素、 蓖麻毒素、 蒴莲根毒素、
BALB/c 小鼠、Sp2/0 骨髓瘤细胞系由北京军事医学
科学院微生物所提供。 胎牛血清、1640 培养基为
Gibco 公司产品；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂为
Sigma 公司产品；Protein A-Sepharose CL-4B 为 GE
公司产品。
1.2 方法
1.2.1 BALB/c 小鼠的抗原免疫 利用甲醛处理的
相思子毒素毒蛋白作为抗原， 经腹腔注射免疫 10
只雌性 BALB/c 小鼠。 初次免疫用弗氏完全佐剂乳
化的抗原，3 周后用弗氏不完全佐剂乳化的抗原进
行第 2 次免疫，再过 3 周同样用弗氏不完全佐剂乳
化的抗原进行第 3次免疫，3次免疫剂量均为 100μg/
只。每次免疫 3次后后段尾静脉采血，用间接 ELISA
方法检测血清中的抗体效价，观测免疫效果。
基础研究
·论 著·
相思子毒素单克隆抗体的制备纯化及鉴定
张立营，赵怀龙，马凤龙，傅兴伦，孙英姿，高 波
[基金项目] 青岛市公共领域科技支撑计划项目（09-1-1-28-nsh）
[作者单位] 266071 山东青岛，济南军区青岛第二疗养院检验科（张
立营，孙英姿，高波）；250014 山东济南，济南军区联勤部疾病预防
控制中心（赵怀龙，马凤龙，傅兴伦）
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DOI:10.14172/j.cnki.issn1671-4008.2010.09.006
实用医药杂志 2010 年 09 月 第 27 卷 第 09 期 Prac J Med ＆ Pharm． Vol 27, 2010－09 No．09
1.2.2 杂交瘤细胞的建立 细胞融合前 2d 用抗原
于小鼠尾静脉加强免疫 1 次，取小鼠脾细胞与 Sp2/
0 细胞采用 50% PEG2000 融合按常规方法进行融
合。
1.2.3 杂交瘤细胞的筛选与克隆 以 10 μg/ml 的
相思子毒素为包被抗原，用 ELISA 方法，通过检测
杂交瘤细胞的培养上清筛选阳性融合细胞，再对阳
性孔中的细胞以有限稀释法进行 3 次细胞克隆，用
抗体亚类测定试剂盒对克隆获得的杂交瘤细胞株
进行抗体亚类鉴定。 将经过抗体亚类鉴定的单克隆
杂交瘤细胞株接种到预处理的 BALB/c 小鼠腹腔
中，制备腹水，并测定其分泌单抗的稳定性。 取生长
良好，分泌稳定的杂交瘤细胞建株，扩大培养后入
液氮保存。
1.2.4 单克隆抗体的效价测定 分别将用不同的
单克隆杂交瘤细胞株诱生的小鼠腹水行 1/100 稀
释，然后再以 1/10 稀释率进行梯度稀释；以相思子
毒素为包被抗原，应用间接 ELISA 方法进行抗体的
效价检测。
1.2.5 单克隆抗体的特异性鉴定 利用间接
ELISA 法，分别测定单抗与蓖麻毒素、蒴莲根毒素
的交叉反应性。 各种抗原按 5 μg/ml的浓度包被 96
孔酶标板，同时设阴、阳性对照。
1.2.6 单克隆抗体的纯化 应用 A 蛋白亲和层析
法纯化腹水中的单克隆抗体。 将腹水先通过硫酸铵
沉淀进行预处理， 然后用 ProteinA-Sepharose CL-
4B 亲和层析， 通过 AKTA explorer100 监测纯化色
谱图。
1.2.7 单克隆抗体的定量和 SDS-PAGE 鉴定 将
纯化获得的单抗用 BCA 蛋白定量试剂盒测定抗体
的浓度， 并推算腹水中单抗的含量， 并进行 SDS-
PAGE鉴定
2 结 果
2.1 免疫效果分析 用间接 ELISA 法对免疫后的
小鼠血清抗体效价检测表明，末次免疫小鼠血清抗
体效价均在 1∶8000 以上，免疫效果良好，可以用于
细胞融合。
2.2 杂交瘤细胞株的建立 通过对融合后的杂交
瘤细胞培养上清进行检测和筛选，并对阳性孔中的
细胞经过有限稀释法进行 3 次细胞克隆，结果显示
细胞融合率为 78%，其中阳性细胞孔为 8 个，阳性
率为 7.2%。 对 4 株强阳性细胞株进行 3 次亚克隆
后，得到 4株单抗细胞株 2D3、4E6、1C8和 1E5。
2.3 单抗的亚类鉴定 根据抗体亚类测定试剂盒
的方法， 分别用抗鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM
和 IgA 试剂包被 96 孔酶标板， 测得 2D3 细胞株的
亚类是 IgG1，4E6、1C8 和 1E5 细胞株的亚类均为
Ig2b。
2.4 单抗的效价测定 用间接 ELISA 法分别对
2D3、4E6、1C8 和 1E5 杂交瘤细胞诱生的腹水进行
效价测定，分别为 1∶1×107、1∶1×106、1∶1×105、1∶1×106。
2.5 单抗的特异性鉴定 利用间接 ELISA 法，分
别测定单抗与蓖麻毒素、 蒴莲根毒素的交叉反应
性。 结果表明，4株单抗与几种毒素均无交叉反应，
说明所筛选出的单克隆抗体是特异的。
2.6 单克隆抗体的纯化 AKTA explorer100 监测
的纯化色谱图显示，2D3 细胞诱生的腹水经蛋白 A
亲和层析纯化，获得了单一的蛋白洗脱峰（图 1）。
通过 BCA 蛋白定量试剂盒对纯化抗体进行定量测
定， 推算出腹水中单抗含量约为 4.6 mg/ml。
2.7 单克隆抗体的 SDS-PAGE 鉴定 纯化的单抗
进行还原性 SDS-PAGE 电泳， 结果显示：5 倍稀释
腹水的 SDS-PAGE 结果为多条带，纯化后的 IgG 只
有 2 条带， 上下 2 条带分别为 IgG 的重链及轻链
（图 2），分子量分别是 50、26 kDa，与理论值相符合。
3 讨 论
相思子毒素 （abrin） 是存在于豆科植物相思
（Abrus precatorius）种子中的一种毒蛋白，与蓖麻毒
素 （ricin）同为Ⅱ型核糖体失活蛋白 （RIP）家族成
员， 是迄今为止所发现的毒性最强的植物毒素之
一，毒性是普通化学武器的几百倍。 从第一次世界
大战起，
横坐标：时间（min）； 纵坐标：280nm波长 OD值（mAU）；
峰 1：上样时监测到的腹水中的杂蛋白；峰 2：洗脱峰
图 1 Protein A-Sepharose CL-4B层析图
a：标准蛋白 marker；b：纯化的单抗 IgG；c：5 倍稀释的腹水
图 2 纯化单抗的 SDS-PAGE 鉴定结果
（下转第 832页）
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实用医药杂志 2010 年 09 月 第 27 卷 第 09 期 Prac J Med ＆ Pharm． Vol 27, 2010－09 No．09
经美、英、加、法等国的研究，相思
子毒素已经成为一个成功的天然毒素战剂[9，10]。
相思子毒素天然资源比较丰富， 制备比较容
易， 并且借助当今高度发达的生物工程技术手段，
还能够实现大批量生产。 相思子毒素中毒后无特异
症状， 出现症状时已经造成机体严重的器质性损
害，给中毒的治疗及预防带来极大的难度，具备生
物毒素武器典型特征， 因此历来为外军所高度重
视[3]。 在 2001年世界生物及毒素武器大会（BTWC）
上，相思子毒素再次被列入重点核查清单，因此开
展对相思子毒素的研究具有十分重要的意义[11，12]。
本研究利用相思子毒素免疫 BALB/C小鼠制备
了相思子毒素单克隆抗体，其与相思子毒素、蒴莲
根毒素无交叉反应， 表明此株单抗特异性较强，具
备建立检测试剂盒的可能，可作为检测相思子毒素
的核心试剂。
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[2010-04-15 收稿，2010-05-20 修回] [本文编辑：韩仲琪 王庆法]
FFA、TC、LDL-C、FBG、FINS 均高于普通饮食组 ，
而 HDL-C 则低于普通饮食组， 提示营养性肥胖大
鼠发生了以胰岛素抵抗为基础的代谢综合征。 MS
是多种代谢成分异常的病理状态，表现为一个患者
身上同时存在的以正常生理代谢改变为特征的系
列症候群。 包括：糖耐量受损和糖尿病；高血压；高
血脂；全身或腹部肥胖；高胰岛素血症伴有胰岛素
抵抗等。 概括来说，代谢综合征表现出“四高一低”，
即高血压、高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯、低
高密度脂蛋白。 由此可引起机体神经和体液调节失
常，内环境的物理、化学条件改变，加速细胞的损害
和凋亡。 由于人体免疫系统受到损害，机体防御能
力下降，从而产生各种疾病。 大量研究证明，肥胖引
起的高胰岛素血症、胰岛素抵抗与多种癌症如乳腺
癌、结肠癌的发生正相关 [5-7]。 大肠上皮细胞由于并
非经典胰岛素作用的靶组织，对胰岛素过度刺激缺
乏相应调节机制，容易出现过度增生，最终导致上
皮细胞癌变，这一理论已在细胞学及动物模型中得
到证实[8]。 儿茶素处理后，营养性肥胖大鼠血清 TG、
FFA、TC、LDL-C、FBG、FINS 均有所下降，而正常饮
食大鼠血清各生化指标没有明显影响。 说明儿茶素
可有效缓解由饮食造成的肥胖引起的体内代谢失
衡，改善胰岛素抵抗，抑制代谢综合征的发生发展。
开发茶提取物作为减肥、抗代谢综合征、抗肿瘤的
新兴医药食品，应用前景广泛。
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[2010-03-18 收稿，2010-04-20 修回] [本文编辑：韩仲琪 王庆法]
（上接第 829页）
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