全 文 ：125 I-相思子毒素 P2 在小鼠体内的血药浓度及其生物利用度
鹿晓晶1 ,李丽琴 1 ,张瑞华 1 ,石　童1 ,徐建富 1 ,高南南 2 ,王惠芳1
(1.中国人民解放军防化研究院 , 北京　102205;2.中国医学科学院药用植物研究所 ,北京　100193)
收稿日期:2010 -08-18,修回日期:2010-09-25
基金项目:重大新药创制资助项目(No2009ZX09103-384)
作者简介:鹿晓晶(1973 -),女 , 博士生 , 研究方向:药理和毒理学 ,
Tel:010-66758256, E-mail:deertime@sina.com;
王惠芳(1953 -), 男, 硕士 ,研究员 , 博士生导师 , 研究方
向:生物化学与分子药理学 ,通讯作者 , Tel:010-66758323,
E-mail:wojia66@hotmail.com
中国图书分类号:R-332;R282.71;R446.11;R979.1
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2010)12-1665-05
摘要:目的　研究相思子毒素 P
2
(abrinP
2
)在小鼠体内的血
药浓度和生物利用度 , 为发展相思子毒素新型抗癌药打下基
础。方法　ICR小鼠静脉(2.1 μg· kg-1)和灌胃(87.5、
43.8和 21.9 μg· kg-1)给予 125I-相思子毒素 P2(125I-abrin
P
2
)。给药后不同时间内取血 , 分离血浆 ,用同位素示踪法检
测血浆中的放射性;然后采用三氯乙酸(TCA)沉淀法检测沉
淀中的放射性 , PKS软件分析房室模型和计算各种参数 , 并
根据灌胃和静脉给药的药 -时曲线下面积(AUC0 ～ ∞)之比
计算绝对生物利用度 。结果　相思子毒素 P2在 0.01 ～ 50
μg· L-1浓度范围内线性关系良好 , 样品在血浆中的回收率
大于 85%, 日内变异系数(RSD)小于 5%。 小鼠单次静脉注
射 2.1 μg· kg-1相思子毒素 P2的药代动力学参数分别为吸
收半衰期(T1
2
Ka)0.46 h、消除半衰期(T1
2
Ke)8.63 h、药 -时
曲线下面积(AUC
0 ～ ∞)为 16.84 μg· h· L-1;小鼠单次灌胃
给予剂量分别为 21.9、 43.8、 87.5 μg· kg-1的 125I-abrinP2
后 , 吸收半衰期分别为 1.26、 1.15、0.55 h;消除半衰期分别
为 46.21、 46.21、 46.19 h, AUC0 ～ ∞分别为 41.42、 67.17、
119.27 μg· h· L-1。结论　相思子毒素 P2的血药浓度数
据拟合为二室模型 , 在低 、中给药剂量范围内符合线性动力
学规律。低 、中 、高剂量灌胃给药的绝对生物利用度分别为
24.6 %、19.5 %、16.7 %。
关键词:相思子毒素;药代动力学;生物利用度;血药浓度;同
位素示踪法;小鼠;PKS软件
　　相思子毒素 P2是本课题组从云南昆明相思子
中分离 、纯化得到的一种毒蛋白 ,它与 Sepharose4B
柱有很强的结合活性 ,相思子毒素 P2可能是我国昆
明相思子中特有的一种蛋白成分 [ 1-2] ,相对分子量
约 60 ku,由 A、B两条链组成 ,中间由一个二硫键相
连 。A、B两条链分别由 250和 267个氨基酸残基组
成 。两条链分别含有 9和 14个酪氨酸残基 ,在同位
素标记过程中 ,通过控制碘化钠和相思子毒素的摩
尔比例 ,在每个相思子毒素 P2分子上随机标记 1 ～
2个125I。
　　相思子毒素为 Ⅱ型核糖体失活蛋白 ,对肿瘤细
胞的毒性高于正常细胞的毒性[ 3] 。早在 1969年 ,
Reddy和 Sirse发现 ,相思子提取物可抑制吉田肉瘤
的生长[ 4] , 并对艾氏腹水癌也具有明显的抑制效
应[ 5] ,同时发现相思子毒素的抗癌机制不同于其它
化疗药物 ,因此它的抗肿瘤作用引起人们的广泛重
视[ 6] 。近期研究发现 ,相思子毒素 P2 对小鼠的
EAC腹水瘤和 S180实体瘤有明显的抑制作用 ,为了
进一步研究相思子毒素的抗癌作用 ,本文拟对其代
谢动力学进行研究 。
　　目前 ,关于相思子毒素体内代谢动力学的报道
较少 。仅见 1976年 Fodstad等[ 7]发表的论文 ,该文
研究了小鼠单次静脉和腹腔给药后 , 125I-相思子毒
素在小鼠体内的分布和排泄 ,但没有涉及到小鼠的
血药浓度和生物利用度 。为了深入研究相思子毒素
的药代动力学 ,本文采用小鼠单次灌胃(ig)和静脉
(iv)给予 125I-abrinP2后 ,分别测定血浆和 TCA沉淀
法处理的沉淀中的放射性含量 [ 8] ,为相思子毒素新
型抗癌药的研发及临床治疗提供参考依据。
1　材料与方法
1.1　药品与试剂　相思子毒素 P2:本课题组提取 ,
经生物质谱法测定分子量为 60591D,经 HPLC面积
归一化法鉴定纯度为 99%以上(另文[ 9]发表);125 I
-相思子毒素 P2:放射比活度为 2.21 MBq/μg,放
化纯度为 98%以上 ,由原子能研究院协助完成;三
氯乙酸(购自如皋市化学试剂厂),其余试剂为国产
分析纯;实验用水为超纯水。
1.2　仪器 　FJ-2008ps型 γ-计数仪(西安核仪器
厂);RW20D2M.n型电动匀浆机(Ikalabortechnik);
LG10-2.4A型离心机(北京医用离心机厂)。
1.3　动物及给药方法 　ICR小鼠 , 240只 , ♂144
只 , ♀96只 ,体质量 18 ～ 20 g;由北京维通利华实验
动物技术有限公司提供 [合格证号:SCXK(京)2006-
0009] 。试验前 12 h禁食不禁水。小鼠尾静脉给药
剂量为 2.1 μg· kg-1;于给药后 3 min、7.5 min、15
min、30 min、1 h、2 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h和 24 h
·1665·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBulletin　2010Dec;26(12):1665 ～ 9
眼眶采血 。小鼠灌胃给药 ,实验设高 、中 、低 3个给
药剂量 ,分别为 87.5、43.8、21.9 μg· kg-1;于给药
后 3 min、7.5 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、9 h、
18 h、24 h、48 h和 72 h眼眶采血。每个采样点包含
5只动物 ,其中♂3只 , ♀2只。
1.4　血样样品处理方法　静脉给药组和 3个灌胃
给药组单次给药后 ,分别在不同的血样采集点 ,于动
物眼眶取血 0.2 ml, EDTA·K2抗凝 ,全血 6 000 ×g
离心 5 min,取 70 μl血浆样品 ,测量其放射性后 ,加
入等量 20% TCA溶液沉淀蛋白 , 6 000 ×g离心 5
min后弃上清 ,测定酸沉淀部分的 γ放射性。
1.5　标准曲线制备　在小鼠空白血浆中 ,精密加
入 125I-abrinP2 , 使其浓度为 215.9 μg· L-1 ,做为母
液 。然后 ,依次用空白血浆稀释成 50、12.5、3.13、
0.78、0.20、0.05、0.01 μg· L-1 7个浓度 ,每个浓度
做 3个平行。以血浆中 125I-abrinP2的浓度为横坐
标 ,放射性为纵坐标做标准曲线 。
1.6　样品在血浆中回收率 、精密度和稳定性测定　
按照标准曲线中溶液的配制方法 ,把母液稀释成
30.0、3.0、0.3、0.03 μg· L-1 4个浓度 ,分别进行回
收率 、精密度和稳定性测定。回收率的测定:取 70
μl稀释液测定其总放射性 ,用同体积 20%的三氯乙
酸沉淀后 ,测定其沉淀放射性 ,换算成 μg· L-1。求
沉淀放射性占总放射性的百分比。精密度的测定:
每个浓度设 5管 ,同批测定 ,评价批内精密度。稳定
性的测定:分别进行 25℃稳定性实验和 4℃稳定性
实验(分别放置 30 min、1 h、2 h、3 h、6 h),每管加入
70 μl检测样品 ,再用同等体积的 20%的三氯乙酸
沉淀样品 ,离心后 ,检测沉淀的放射性 ,换算成 μg·
L-1。每个时间点设 3个平行管 。
1.7　绝对生物利用度计算　根据下式计算相思子
毒素在小鼠体内的绝对生物利用度:绝对生物利用
度 F=(AUC灌胃 × D静脉 )/(AUC静脉 × D灌胃 )×
100%, D为给药剂量 。
1.8　药代动力学参数计算　使用 PKS软件(上海
宏能软件有限公司生产)对静脉和灌胃给药途径所
得到的血药浓度 -时间数据进行处理 。用 Akaike
信息标准(AIC)法和 F检验最小原则判断房室模
型 。
1.9　动物实验的伦理声明　本实验中涉及动物饲
养及实验内容通过防化研究院实验动物福利伦理审
查 ,符合相关规定的要求。
2　结果
2.1　血浆中 125I-abrinP2的标准曲线 、回收率 、精密
度及稳定性　125I-abrinP2的血药浓度在 0.01 μg·
L-1 ～ 50 μg· L-1之间呈良好的线性关系 ,标准曲
线为 Y =16.93 +288.18X(r=0.999)。浓度为
30.0、3.0、0.3、0.03 μg·L-1时 ,各浓度回收率均大
于 85%;各浓度的日内 RSD值均小于 5%。在空白
血浆中 , 125I-abrinP2在 25℃和 4℃,在 6 h内是稳定
的。
2.2　静脉注射给药和灌胃给药的药代动力学　小
鼠静脉注射 2.1 μg· kg-1、灌胃给予 21.9、43.8和
87.5 μg·kg-1的 125I-abrinP2后 ,不同时间点血浆经
TCA沉淀后测定放射性 , 分别以血浆的放射性浓
度 、血浆沉淀的放射性浓度为纵坐标 ,以取血时间点
为横坐标绘制药时曲线(Fig1、2、3)。根据 F检验
(P<0.01)和 AIC值最小原则 ,静脉注射和灌胃给
药选择房室数都为 2, 权重 1 /C2 为最适动力学模
型。根据最适动力学模型进行计算 ,得出药代动力
学参数(Tab1, 2)。
　　小鼠静脉注射 2.1μg· kg-1的 125I-abrinP2后 ,
血浆中相思子毒素的 T1
2
Ka与沉淀中相近 ,而 T1
2
Ke、
AUC0 ～∞ 、Cmax值都大于沉淀的值 , CL小于沉淀的值。
　　小鼠灌胃分别给予 21.9、43.8和 87.5 μg·
kg-1的 125I-abrinP2时 ,血浆和血浆沉淀的药物浓度
Tab1　Pharmacokineticparametersof125I-abrinP2 after
ivadministrationof125I-abrinP2 toICRmice
Parameter Plasma Precipitation
T1
2
Ka/h 0.42 0.46
T1
2
Ke/h 11.79 8.63
AUC0 ～ ∞ /μg· h· L-1 28.15 16.84
CL/L· h-1 7.46 ×10-4 1.25×10-3
Vd 0.013 0.016
Tmax/h 0.05 0.05
Cmax/μg· L-1 7.07 6.32
Fig1　Plasmaandprecipitationconcentrationof125I-abrinP2 after
ivadministrationof125I-abrinP2 2.1 μg· kg-1 tomice(n=5)
·1666· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2010 Dec;26(12)
Tab2　Pharmacokineticparametersof125I-abrinP2 afterigadministrationof125I-abrinP2 toICRmice
Parameter 21.9 μg· kg-1plasma precipitation
43.8 μg· kg-1
plasma precipitation
87.5 μg· kg-1
plasma precipitation
T1
2
Ka/h 1.71 1.26 1.67 1.15 1.25 0.55
T1
2
Ke/h 45.06 46.21 46.21 46.21 45.72 46.19
AUC0 ～ ∞ /μg· h· L-1 69.33 41.42 142.02 67.17 233.72 119.27
CL/F(L·h-1· kg-1) 3.03×10-4 5.07×10-4 3.03 ×10-4 6.40×10-4 3.72×10-4 7.29 ×10-4
V/F(L· kg-1) 0.020 0.034 0.020 0.043 0.025 0.049
Tmax/h 0.68 0.66 0.59 0.61 0.57 0.67
Cmax/μg· L-1 6.66 2.57 11.74 5.40 25.14 10.07
Fig2　Plasmaconcentrationof125I-abrinP2 after
igadministrationof125I-abrinP2 tomice(n=5)
Fig3　Precipitationconcentrationof125I-abrinP
2
after
igadministrationof125I-abrinP2 tomice(n=5)
-时间曲线下面积(AUC0 ～ ∞)分别与剂量呈正相关
(P<0.01)。血浆的相思子毒素峰浓度(Cmax)分别
为 6.66、11.74和 25.14 μg· L-1 ,与剂量具有线性
关系(r=0.998, P<0.01);血浆沉淀的相思子毒素
峰浓度(Cmax)分别为 2.57、5.40和 10.07 μg· L-1 ,
与剂量具有线性关系(r=0.994, P<0.01)。
2.3　灌胃给药的绝对生物利用度　灌胃给药剂量
分别为 21.9、43.8、87.5 μg· kg-1的相思子毒素在
小鼠体内的绝对生物利用度分别为 24.6%、19.5%
和 16.7%。
3　讨论
　　相思子毒素静脉注射毒性大 ,给药量少 ,因此 ,
在体内进行痕量检测非常困难。近几年相继发展了
放射免疫检测法 、相思子毒素双抗体夹心 ELISA
法[ 10-11] 、高效液相色谱检测法等 [ 12] 。但这些方法
的灵敏度很难满足相思子毒素在生物样品中痕量检
测要求;另一方面 ,药代动力学试验中的生物样品数
量非常多 ,而上述方法的检测周期长 ,不足以在生物
样品的稳定期内完成检测。 1976年 , Fodstad等[ 7]
进行相思子毒素静脉给药和腹腔给药时 ,曾用聚丙
烯酰胺凝胶电泳法检测被三氯乙酸沉淀的相思子毒
素分子 ,发现大部分都是分子结构完整的毒素。另
外 ,在文献报道多种蛋白质的药代动力学研究中 ,都
采用三氯乙酸沉淀目标蛋白 。因此 ,本文选用同位
素示踪法结合三氯乙酸沉淀目标蛋白 ,并经方法学
验证表明 ,该方法能够满足药代动力学研究要求 。
　　另外 ,由于相思子毒素静脉注射的毒性非常高 ,
其半数致死量大约为 1 μg· kg-1左右 ,按照该给药
剂量很难在动物体内检测出相思子毒素 。又因为致
死剂量的相思子毒素 ,不会引起动物快速死亡 ,至少
在给药后 24 h后才会出现死亡 。因此在本实验中 ,
小鼠的给药剂量提高了约一倍 ,以保证在 24 h内可
在动物血浆中检测到相思子毒素 。
　　在灌胃给药中 ,低 、中剂量组与高剂量组相思子
毒素的吸收半衰期存在差异 。推测 ,本实验中高剂
量可能达到或接近动物吸收该药的最高剂量 ,现有
的研究结果表明 ,相思子毒素进入细胞的先决条件
是完整的相思子毒素通过它的 B链与细胞表面含
糖结构分子结合 [ 13-15] 。因此细胞表面相思子毒素
受体的多少决定了相思子毒素进入细胞量的多少。
87.5 μg· kg-1相思子毒素的吸收半衰期低于 43.8
μg· kg-1和 21.9 μg· kg-1的原因 ,很可能是使胃 、
·1667·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2010 Dec;26(12)
肠道中受体饱和的缘故 ,由于受消化道管壁上受体
数量的限制 ,高剂量的药物吸收率降低 ,随着给药剂
量升高 ,绝对生物利用度降低 ,相思子毒素在小鼠体
内呈现出非线性动力学特征。
　　在各剂量组中 ,沉淀中相思子毒素的吸收半衰
期小于血浆中相思子毒素的吸收半衰期 ,很可能是
部分毒素被血浆中的酶分解而造成的 ,血浆中包含
相思子毒素原形物及降解产物 ,而沉淀中主要包含
相思子毒素原形物。
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Plasmaconcentrationandbioavailabilityof125 I-abrinP2 inmice
LUXiao-jing1 , LILi-qin1 , ZHANGRui-hua1 , SHITong1 ,
XUJian-fu1 , GAONan-nan2 , WANGHui-fang1
(1.ResearchInstituteofChemicalDefenceofPLA, Beijing　102205, China;2.Instituteof
MedicinalPlantDevelopment, ChineseAcademyofMedicalSciences, Beijing　100193, China)
Abstract:Aim　Tostudytheplasmaconcentration
andbioavailabilityoftheabrinP2 inmice, asthebasis
fordevelopingnewanti-cancerdrug.Methods　125 I-
abrinP2 wasinjectedintravenously2.1 μg· kg-1 or
administeredoraly21.9, 43.8 and87.5 μg· kg-1 ,
respectively.Bloodsampleswerecolectedatdiferent
timepointsfolowingdrugadministration, andtheplas-
mawasseparatedfrombloodsamples.Radioisotopic
tracingmethodcombinedwith trichloroaceticacid
(TCA)precipitationwasusedtodetermineplasma
concentrationof125I-abrinP2 inmice.Thepharmacoki-
neticparameterswerecalculatedusingPKSsoftware,
andbioavailabilitywasassessedaccordingtotheratio
of the area under concentration-time curve
(AUC0 ～∞).Results　Themethodshowedgoodlinear
relationshipwithintheconcentrationrangeof0.01 ～ 50
·1668· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2010 Dec;26(12)
μg· L-1 , therecoveryofabrinP2 fromthemouse
plasmawasover85%, andtheintra-dayprecisionex-
pressedastherelativestandarddeviationwaslessthan
5%.TheT1
2
Ka, T1
2
KeandAUC0 ～∞ forintravenouslyad-
ministeredabrinP2 (2.1 μg· kg-1 )were0.46 h,
8.63 h, 16.84 μg· h· L-1 , respectively;TheT1
2
Ka,
T1
2
Ke andAUC0 ～ ∞ fororalyadministeredabrinP2
(87.5, 43.8, 21.9 μg·kg-1)were1.26, 1.15, 0.55
h;46.21, 46.21, 46.19 h;41.42, 67.17, 119.27 μg
· h· L-1 , respectively.Conclusion　Theplasma
concentration-timecurvesofabrinP2 inmicecon-
formedtotwo-compartmentopenmodel, andinthe
rangeoflowandmiddledosesgoodlinearrelationship
wasdetected, thebioavailabilitiesofabrinP2 inmice
were24.6%、19.5%、16.7%, respectively.
Keyword:abrinP2;pharmacokinetics;bioavailability;
plasmaconcentration;radioisotopictracingmethod;
mouse;PKSsoftware
◎中药复方药物药理◎
通心络和人参总皂苷对过度疲劳致血管内皮功能障碍
大鼠主动脉 CPT-I和 AMPKα表达的干预作用
魏　聪 1, 2 ,韩建科 1, 2 ,贾振华 3, 4 ,袁国强 3, 4 ,吴相春 2, 4 ,吴以岭 1, 2
(河北医科大学 1.中西医结合教研室 、2.附属以岭医院 ,河北 石家庄　050091;3.河北以岭医药研究院 ,
4.国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病), 河北 石家庄　050035)
中国图书分类号:R-332;R 284.1;R 322.121;R 329.24;
R341;R543.023
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2010)12-1669-05
摘要:目的　观察通心络和人参总皂苷对过度疲劳致血管内
皮功能障碍大鼠主动脉 CPT-I和 AMPKα表达的干预作用。
方法　采用 “基础饮食 +负重游泳法”建立疲劳应激动物模
型 , 给予通心络和人参总皂苷进行干预 , 观察大鼠一般状况 、
主动脉内皮细胞形态和结构 , 血中 ET-1和 NO水平 , 采用
Real-TimePCR检测主动脉 CPT-I、 AMPKα mRNA表达 ,
Westernblot检测主动脉 CPT-I、AMPKα、p-AMPKα蛋白表
达。结果　过度疲劳应激可导致血管内皮结构和分泌功能
损伤 , 同时 CPT-I、AMPKαmRNA和蛋白表达降低;通心络和
人参总皂苷可保护血管内皮结构和功能完整性 ,升高 CPT-I、
AMPKαmRNA和 CPT-I、AMPKα、p-AMPKα蛋白表达。结论
　通心络和人参总皂苷可通过增强血管 AMPKmRNA基因
和蛋白表达及 p-AMPKα蛋白表达 , 进而调控血管局部与脂
收稿日期:2010 -07-21,修回日期:2010-09-25
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(No
2005CB523301);国家十一五 “重大新药创制项目 ”络病理
论指导药物开发集成创新技术平台建设项目 (No
2009ZX09313-003)
作者简介:魏　聪(1979 -),女 , 博士生 , 主治医师 ,研究方向:血管
病变 基 础 与 临 床 , Tel: 0311-85901252, Fax:0311-
85901088, E-mail:wei alice 0@163.com;
吴以岭(1949-),男 ,硕士 ,教授 、主任医师 ,研究方向:中
医络病及心脑血管疾病基础与临床 ,通讯作者 , Tel:0311-
85901252, Fax:0311-85901088
质 β 氧化相关的 CPT-ImRNA和蛋白表达 ,从而对过度疲劳
大鼠血管内皮发挥保护作用。
关键词:通心络;人参总皂苷;过度疲劳;内皮功能障碍;CPT-
I;AMPKα
　　随着社会工作生活环境的变化以及医学模式由
单纯的生物医学模式向 “生物—心理—社会 ”全新
医学模式的转变 ,社会竞争日趋激烈导致过度疲劳
等社会心理因素在心脑血管病发生中的作用日益受
到关注。既往研究采用 “基础饮食 +负重游泳法 ”
建立疲劳应激大鼠模型 ,应用基于超高效液相色谱
联合离子阱 —飞行时间质谱分析 (UFLC/MS-IT-
TOF)方法进行的代谢组学研究结果显示 ,疲劳应激
大鼠血浆肉碱类物质明显降低 [ 1] ,提示过劳应激状
态下存在以肉碱代谢异常为主要特征的能量代谢障
碍。肉碱作为转运长链脂肪酸通过线粒体内膜进入
线粒体基质进行脂肪酸 β氧化的重要成分 ,在能量
代谢中发挥至关重要的作用 。肉碱棕榈酰转移酶-I
(CPT-I)是细胞线粒体脂肪酸 β氧化的限速酶 ,目
前关于 CPT-I在心血管疾病能量代谢研究多侧重于
心肌组织 ,而对于血管局部的研究鲜有报道。通心
络作为络病理论指导心脑血管疾病治疗的代表性方
药 ,既往研究显示 [ 2-3]其对过度疲劳致血管内皮功
能障碍大鼠内皮功能具有良好的保护作用。本研究
·1669·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2010 Dec;26(12):1669 ～ 73