全 文 ：第４３卷第４期 东 北 师 大 学 报 （自 然 科 学 版 ） Ｖｏｌ．４３Ｎｏ．４
２０１１年１２月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１１
［文章编号］１０００－１８３２（２０１１）０４－０１３２－０５
［收稿日期］ ２０１１－０５－２３
［基金项目］ 国家自然科学基金资助项目（３０８７０２５１，３１０７０３０９）；教育部９８５平台项目；吉林省中医药管理局计划项目（２０１０－０７８）．
［作者简介］ 王志宏（１９６５—），男，副教授，主要从事中医药及生化药物研究；通讯作者：张桂荣（１９６４—），女，博士，教授，主要从事
分子生物学及生物化学研究．
蝙蝠葛碱提多糖对Ｈｅｌａ细胞增殖的影响
王志宏１，薛建斌２，姜文艳２，张桂荣２
（１．长春中医药大学基础医学院，吉林 长春１３０１１７；
２．吉林大学生命科学学院，吉林 长春１３００１２）
［摘 要］ 利用蝙蝠葛根提取多糖成分，并应用噻唑蓝还原法（ＭＴＴ）检测了蝙蝠葛多糖对
Ｈｅｌａ细胞增殖的抑制作用及细胞毒性作用．结果表明：蝙蝠葛碱提多糖在质量浓度较低时，对
Ｈｅｌａ细胞的增殖有促进作用，此作用在质量浓度为０．２５ｍｇ／ｍＬ时达到最大，此时 Ｈｅｌａ细胞
增殖率为１４９％．随着浓度的进一步加大，Ｈｅｌａ细胞的生长逐渐受到抑制，增殖率逐渐下降．在
多糖质量浓度为０．６０～０．６５ｍｇ／ｍＬ时，Ｈｅｌａ细胞的生长能力迅速下降，增殖率下降达约
２５６％，且随着蝙蝠葛多糖质量浓度的增长，其对 Ｈｅｌａ细胞有进一步的抑制作用，但影响水平
较为缓和，表明蝙蝠葛多糖具有明显的抗肿瘤作用．
［关键词］ 蝙蝠葛；多糖；癌症
［中图分类号］ Ｒ ９６３ ［学科代码］ ３１０·４７３０ ［文献标志码］ Ａ
防己科植物蝙蝠葛（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍｕｍ ｄａｕｒｉｃｕｍ ＤＣ），又名北豆根，始载于《中国药植志》，具有清热解
毒、祛风止痛、理气化湿之功效．以往的研究多述及蝙蝠葛根的抑菌作用、降压作用及抗心率失常作用
等，其有效成分为生物碱［１－３］．另有研究发现，蝙蝠葛具有较强的抗肿瘤活性，根提取物对肿瘤细胞具有
广谱的抑制作用，能诱导肿瘤细胞凋亡，并有免疫调节作用［４－６］．中药多糖具有提高免疫力、抗肿瘤作
用［７］，蝙蝠葛多糖的直接和间接致突变实验结果均为阴性，直接和间接抗突变结果为阳性，并且具有浓
度依赖性［８］，显示了其良好的抗肿瘤前景．
１ 材料和方法
１．１ 主要试剂及设备
Ｈｅｌａ细胞（人宫颈癌细胞）由吉林大学生命科学学院提供；蝙蝠葛根为市售；ＲＰＭＩ １６４０培养基、胰蛋
白酶、ＭＴＴ为ＧＩＢＣＯ公司产品，ＤＭＳＯ（美国），ＮａＯＨ、无水乙醇、盐酸、聚乙二醇均为国产分析纯试剂．
主要设备：超低温电冰箱（日本三洋 ＭＤＦ－４９２），高速冷冻离心机（德国Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８１０Ｒ），电子分
析天平（德国赛多利斯ＢＰ２２１Ｓ），电磁炉，红外炉，冻干机（ＡＬＰＨＡ１ＲＺ６），酸度计等．
１．２ 蝙蝠葛碱提多糖的制备
取８００ｇ蝙蝠葛根，加入４Ｌ去离子水，中火煮沸２．５ｈ，过滤．滤渣重复上述操作３次，最后将水提
后的滤渣用４Ｌ０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ浸泡过夜，中火煮沸２．５ｈ，过滤，留滤液．向滤渣中加入去离子水，
用ＮａＯＨ溶液调ｐＨ＝１３，中火煮沸２．５ｈ，过滤，重复上述操作３次，合并滤液；用 ＨＣｌ调滤液ｐＨ＝７，
用中火继续煮沸滤液进行浓缩，得到蝙蝠葛碱提多糖的粗提液（ＢＪＴ）．
１．３ 蝙蝠葛碱提多糖的分级纯化及含量的测定
在ＢＪＴ中加入７５％无水乙醇，醇沉过夜．将醇沉所得混合物５ ０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，－８０℃预冻，
冻干；用研钵研碎，过筛，获得０．１５ｍｍ颗粒，干燥即为蝙蝠葛碱提多糖（ＢＪＴ１）．
DOI:10.16163/j.cnki.22-1123/n.2011.04.016
第４期 王志宏，等：蝙蝠葛碱提多糖对 Ｈｅｌａ细胞增殖的影响
取ＢＪＴ１溶解于去离子水中达到饱和，５ ０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ．取适量上清装入透析袋中，流水透
析；当透析袋快装满时，将其取出，置于聚乙二醇中干燥．重复上述操作多次，直至没有明显的透析现象．
将透析袋中溶液取出干燥，密封保存．
１．４ 蝙蝠葛碱提多糖含量的测定
利用蒽酮硫酸法进行多糖含量的测定．
２ｇ／Ｌ蒽酮试剂的配制：取２ｇ蒽酮溶解到８０％ Ｈ２ＳＯ４ 中，并以８０％ Ｈ２ＳＯ４ 定容到１ ０００ｍＬ，当
日配制使用．
图１ 蒽酮浓硫酸法绘制的标准曲线
０．１ｇ／Ｌ葡萄糖溶液的配制：准确称取标准葡萄
糖０．０１ｇ，用少量蒸馏水溶解后定容至１００ｍＬ容量瓶
中．
精密称取０．１ｇ／Ｌ葡萄糖溶液０．１０，０．２０，０．
３０，０．４０，０．６０，０．８０ｍＬ至６支试管中，然后将每支
试管中溶液用蒸馏水补足至１ｍＬ，混匀；加入４．００
ｍＬ蒽酮试剂，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后
一起用玻璃球将管口盖住，浸于沸水浴中，自水浴重
新煮沸起，准确煮沸１０ｍｉｎ，取出，流水冷却，室温放
置１０ｍｉｎ左右，测６２０ｎｍ处吸光度值．以蒸馏水作
为空白样品对照，以６２０ｎｍ处吸光度值为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制标准曲线（见图１）．
１．５ Ｈｅｌａ细胞的培养
取出冻存细胞，迅速置于３７℃水浴中，轻轻摇动冻存管，待其内容物融化后，将冻存管从水浴中取
出，酒精消毒后开启．用吸管将细胞悬液吸入离心管，并滴加１０倍的 ＲＰＭＩ １６４０培养液，混合后
１ ５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，除去上清液，加入新鲜的ＲＰＭＩ １６４０培养液，转入到培养瓶中，３７℃，５％ ＣＯ２
培养箱中培养，次日更换培养液．待培养瓶中的细胞生长至约９０％饱和时，进行细胞传代．
１．６ ＢＪＴ１体外抑制Ｈｅｌａ细胞增殖实验
１．６．１ ＢＪＴ１溶液的配制
取上述纯化后的ＢＪＴ１ ２０ｍｇ，溶于２０ｍＬ ＲＰＭＩ １６４０培养液中．溶液用０．２２μｍ的针头滤器过滤
除菌后，按表１建立浓度梯度，４℃贮存备用．
表１ 蝙蝠葛碱提多糖浓度梯度的建立
最终浓度／（ｍｇ／ｍＬ） 加入１ｍｇ／ｍＬ多糖的体积／ｍＬ 加入ＲＰＭＩ１６４０培养液体积／ｍＬ 总体积／ｍＬ
０．０１ ０．０３ ２．９７ ３
０．１０ ０．３０ ２．７０ ３
０．１５ ０．４５ ２．５５ ３
０．２０ ０．６０ ２．４０ ３
０．２５ ０．７５ ２．２５ ３
０．３０ ０．９０ ２．１０ ３
０．３５ １．０５ １．９５ ３
０．４０ １．２０ １．８０ ３
０．４５ １．３５ １．６５ ３
０．５０ １．５０ １．５０ ３
０．５５ １．６５ １．３５ ３
０．６０ １．８０ １．２０ ３
０．６５ １．９５ １．０５ ３
０．７０ ２．１０ ０．９０ ３
０．７５ ２．２５ ０．７５ ３
０．８０ ２．４０ ０．６０ ３
０．８５ ２．５５ ０．４５ ３
０．９０ ２．７０ ０．３０ ３
０．９５ ２．８５ ０．１５ ３
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东 北 师 大 学 报 （自 然 科 学 版 ） 第４３卷
１．６．２ 原位培养细胞的形态学改变
设空白对照组和实验组（建立梯度０．５０，０．２５，０．０５，０．０２５，０．０１ｍｇ／ｍＬ），每组设３个复孔．培养
２４ｈ后加药，培养４８ｈ后，在倒置光学相差显微镜下观察并拍摄记录．
１．６．３ 噻唑蓝还原法（ＭＴＴ）检测细胞毒性作用
将备用的细胞悬液接种于９６孔培养板中，１００μＬ／孔，每组设８个复孔．将细胞置于３７℃，５％ ＣＯ２
培养箱中孵育．２４ｈ后按实验要求加入不同稀释浓度的ＢＪＴ１，２００μＬ／孔，同时设溶剂培养液为阴性对
照组、无细胞组为空白对照组．将细胞置于培养箱中培养４８ｈ．实验终止前每孔加入５ｍｇ／ｍＬ的 ＭＴＴ
溶液２０μＬ，置于３７℃，５％ＣＯ２ 培养箱中，避光继续孵育４ｈ；去除培养液，加入１５０μＬ的ＤＭＳＯ，振荡
６ｍｉｎ，用酶标仪在５７０ｎｍ波长下测定每孔的Ｄ（５７０）值．求平均值，计算细胞增殖抑制率［９－１８］．
细胞增殖抑制率（％）＝（对照－实验）／（对照－空白）×１００％；
细胞增值率（％）＝（实验－空白）／（对照－空白）×１００％．
２ 实验结果与分析
２．１ ＢＪＴ１含量的测定
本实验最终得到蝙蝠葛碱提多糖５６．１ｇ，多糖含量分别为６８％和８７％，两种多糖在煮沸浓缩后都
呈棕黑色微黏稠状液体．醇沉过夜后，多糖呈糖样黏稠状固体．冻干后为黑褐色粉末．
２．２ 细胞的形态学变化
利用倒置光学相差显微镜观察了蝙蝠葛多糖ＢＪＴ１对 Ｈｅｌａ细胞的生长抑制作用，结果见图２．对照
组 Ｈｅｌａ细胞贴壁生长，呈不规则多角形，中有圆形核；生长特点是易相连成片，相靠—紧密相连—铺石
状．实验组细胞与对照组相差不大，没有观察到经ＢＪＴ１处理后的 Ｈｅｌａ细胞生长明显受到抑制的现象，
但有少许细胞皱缩变小，形态学上呈现典型的凋亡特征性改变，即核染色质凝集、碎裂，沿核周边分布，
包膜内陷将内陷细胞的内容物包裹成凋亡小体等，与对照组典型的恶性细胞形态相差不十分明显．
图２ 倒置显微镜下观察到的Ｈｅｌａ细胞
２．３ 不同浓度蝙蝠葛碱提多糖对Ｈｅｌａ细胞的生长作用
蝙蝠葛碱提多糖在低质量浓度（０．０１～０．６０ｍｇ／ｍＬ）时对Ｈｅｌａ细胞的生长有促进作用（见表２、表３和
图３、图４）．在蝙蝠葛碱提多糖质量浓度为０．０１～０．２５ｍｇ／ｍＬ时，细胞增殖率随着浓度的增加而缓缓增
加；在多糖质量浓度为０．２５ｍｇ／ｍＬ时达到最大值，细胞增殖率为１４９％．随后，在多糖质量浓度为０．２５～
０．６０ｍｇ／ｍＬ时，细胞增殖率随着浓度的增大而减小，但仍大于对照组．这些数据表明，在多糖质量浓度为
０．０１～０．６０ｍｇ／ｍＬ时，蝙蝠葛碱提多糖能部分被Ｈｅｌａ细胞吸收、利用，促进其快速分裂生长．
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第４期 王志宏，等：蝙蝠葛碱提多糖对 Ｈｅｌａ细胞增殖的影响
表２ 低质量浓度蝙蝠葛碱提多糖对Ｈｅｌａ细胞的作用
测定项目 空白 对照
ρ（蝙蝠葛碱提多糖）／（ｍｇ／ｍＬ）
０．０１ ０．１０ ０．１５ ０．２０ ０．２５ ０．３０ ０．３５ ０．４０ ０．４５
吸光度平均值 ０．３１ ０．７４ ０．８１ ０．８８ ０．９２ ０．９４ ０．９６ ０．８９ ０．８４ ０．７４ ０．７６
吸光度标准差 － － ０．０６ ０．０８ ０．０３ ０．１２ ０．１２ ０．１８ ０．０８ ０．０７ ０．０６
增殖抑制率／％ － － ５ －３０ －４０ －４６ －４９ －３３ －２２ ０ －４
增殖率／％ － － １１５ １３０ １４０ １４６ １４９ １３３ １２２ １００ １０４
在多糖质量浓度为０．６０～０．６５ｍｇ／ｍＬ时，Ｈｅｌａ细胞分裂、生长速度迅速减慢，细胞增殖率骤然减
少达２５６％，显示了较强的抑制肿瘤细胞生长的能力．蝙蝠葛多糖质量浓度从０．６５ｍｇ／ｍＬ进一步增加
时，随着浓度的增大，细胞增值率缓慢下降，细胞生长受到严重抑制（见表３和图４）．
表３ 高质量浓度蝙蝠葛碱提多糖对Ｈｅｌａ细胞的作用
测定项目 空白 对照
ρ（蝙蝠葛碱提多糖）／（ｍｇ／ｍＬ）
０．５０ ０．５５ ０．６０ ０．６５ ０．７０ ０．７５ ０．８０ ０．８５ ０．９０
吸光度平均值 ０．２７ ０．７６ ０．９１ ０．９７ ０．９８ ０．７１ ０．６８ ０．４７ ０．４２ ０．３４ ０．３３
吸光度标准差 － － ０．２１ ０．０５ ０．１０ ０．０７ ０．１３ ０．０７ ０．０７ ０．０５ ０．０６
增殖抑制率／％ － － －３１ －４２ －４６ １０ １７ ５９ ６９ ８６ ８８
增殖率／％ － － １３１ １４２ １４６ －１１０ －１１７ －１５９ －１６９ －１８６ －１８８
图３ Ｈｅｌａ细胞在低质量浓度
蝙蝠葛碱提多糖作用下的增殖率
图４ Ｈｅｌａ细胞在高质量浓度
蝙蝠葛碱提多糖作用下的增殖率
蝙蝠葛碱提多糖粗体产物在低质量浓度（０．０１～０．６０ｍｇ／ｍＬ）时，对Ｈｅｌａ细胞的生长、分裂有促进
作用，此效应在质量浓度为０．２５ｍｇ／ｍＬ时达到最大值，细胞增殖率为１４９％．增加蝙蝠葛碱提多糖浓
度，细胞的生长逐渐受到抑制，在质量浓度为０．６０～０．６５ｍｇ／ｍＬ时，Ｈｅｌａ细胞分裂、生长速度迅速减
慢，细胞增殖率骤然减少达２５６％，显示了较强的抑制肿瘤细胞生长的作用．蝙蝠葛碱提多糖对 Ｈｅｌａ细
胞的生长抑制作用的机制是否与蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱相同以及ＢＪＴ１的组成和结构尚有待进一步
的研究．［１９］
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Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍｕｍｄａｕｒｉｃｕｍ
ａｌｋａｌｉ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｏｎ Ｈｅｌａ ｃｅｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
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（１．Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｅｇｅ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３０１１７，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｅｇｅ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００１２，Ｃｈｉｎａ）
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ｔｏ ｃｅｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｙｅｔ，ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｉｔｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｉｍｅ．Ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｍｅａｎｓ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍｕｍ ｄａｕｒｉｃｕｍｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ
ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｔｓ ａｌｋａｌｉ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｏｎ Ｈｅｌａ ｃｅｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ ＭＴＴ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍｕｍ ｄａｕｒｉｃｕｍ ａｌｋａｌｉ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｍａｙ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅ
Ｈｅｌａ ｃｅｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｓ ｌｏｗ．Ｔｈｅ ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ ｉｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｗｈｅｎ ｔｈｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｓ ａｔ ｉｔｓ ０．２５ｍｇ／ｍＬ，ｗｉｔｈ １４９％ Ｈｅｌａ ｃｅｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ．Ａｓ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｉｎｃｒｅａｓｅｓ，ｔｈｅ Ｈｅｌａ ｃｅｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ａｎｄ ｄｅｓｃｅｎｄｓ ｇｒａｄｕａｌｙ．Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｓ
ｂｅｔｗｅｅｎ ０．６ｍｇ／ｍＬ ａｎｄ ０．６５ｍｇ／ｍＬ，ｔｈｅ Ｈｅｌａ ｃｅｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｄｒｏｐｓ ｒａｐｉｄｌｙ ｂｙ ａｂｏｕｔ
２５６％，ａｎｄ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｆｕｒｔｈｅｒ，ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｗｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｙｅｔ
ｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍｕｍ ｄａｕｒｉｃｕｍａｌｋａｌｉ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｈａｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｔｕｍｏｕｒ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍｕｍ ｄａｕｒｉｃｕｍ；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｔｕｍｏｕｒ
（责任编辑：方 林）
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