全 文 ：收稿日期：2013-02-04
*基金项目：南通市社会发展项目（No：S2009035）
[通信作者] 高志伟，E-mail：gzw1956@163.com
脑外伤后的多种病理生理机制或者组织结构的
改变，引起大脑部分神经元异常放电导致癫痫发作，
称为外伤性癫痫（posttraumatic epilepsy，PTE）[1]。脑
外伤后为什么有的会发生PTE，有的不发生；有的发
文章编号： 1005-8982（2013）35-0022-06
·论著·
甘珀酸模前干预对外伤性癫痫大鼠脑组织中
Cx43、Cx32表达的影响*
陈伟观 1，倪耀辉 2，于 昕 2，高志伟 2
（1 .南通大学附属医院 康复医学科，江苏 南通 226001；2.南通大学附属医院 神经内科，
江苏 南通 226001）
摘要：目的 检测甘珀酸对外伤性癫痫大鼠脑组织中缝隙连接蛋白43（connexin 43，Cx43）及缝隙连接蛋
白32（Cx32）表达的影响，探究缝隙连接在外伤性癫痫（posttraumatic epilepsy，PTE）发病中的作用。方法 大鼠
随机分为正常、假手术、模型以及甘珀酸治疗和预防组。观察各组大鼠癫痫发作的强度，并通过检测各组Cx43
及Cx32的表达。结果 模型组大鼠出现癫痫发作。与模型组相比，应用甘珀酸干预后，治疗和预防组大鼠癫痫
发作强度明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。模型组Cx43阳性细胞数目较正常组、假手术组增多，Cx
32蛋白表达增强（P<0.01）。甘珀酸治疗和预防组Cx43阳性细胞数目均较模型组明显减少，Cx32蛋白表达减
弱（P<0.05）。结论 癫痫形成中Cx43及Cx32表达增强，推测大量胶质细胞增生以及异常缝隙连接生成导致
了PTE的发生与发展。
关键词： 外伤性癫痫；铁离子；缝隙连接；甘珀酸；缝隙连接蛋白
中图分类号：R742.1 文献标识码：A
Effect of Carbenoxolone on expressions of Cx43 and
Cx32 in brain of rats with posttraumatic epilepsy*
CHEN Wei-guan1, NI Yao-hui2, YU Xin2, GAO Zhi-wei2
(1.Department of Rehabilitation Medicine, the Affiliated Hospital of Nantong University,
Nantong, Jiangsu 226001, P.R.China; 2.Department of Neurology, the Affiliated
Hospital of Nantong University, Nantong, Jiangsu 226001, P.R.China)
Abstract: 【Objectives】 To detect the expression of connexin 43 and connexin 32 in brain of rats with
posttraumatic epilepsy by the intervention of Carbenoxolone and to explore the role of gap junction in the
posttraumatic epilepsy. 【Methods】 Rats were divided into five groups: normal, sham operated, model, Car－
benoxolone therapy and Carbenoxolone prevention. Behavior of epilepsy was observed and the expression of
connexin 43 and connexin 32 was detected. 【Results】 Rats displayed typical epileptic behaviors, and Car－
benoxolone reduced seizure degree (P <0.05). And the expression of connexin 43 and connexin 32 was signifi－
cantly enhanced in the model group (P <0.01), but reduced by Carbenoxolone (P <0.05).【Conclusion】 These
results indicate that astrocyte and gap junction might play a role in posttraumatic epilepsy.
Key words: posttraumatic epilepsy; Fe3+; gap junction; Carbenoxolone; connexin
第23卷第35期 中国现代医学杂志 Vol. 23 No.35
2013年12月 China Journal of Modern Medicine Dec. 2013
22· ·
图中左侧颅骨上的空心圆点标示的是注射FeCl3的部位
图1 大鼠颅骨上FeCl3注射部位简图
BregmaLambda
Interaural Line
第35期 陈伟观，等：甘珀酸模前干预对外伤性癫痫大鼠脑组织中Cx43、Cx32表达的影响
生较早，有的较迟，且都在损伤的大脑得到一定程度
修复后发生；神经元过度放电的始动机制尚未清楚[2]。
近年来，许多学者已意识到PTE的危害性，注重对
PTE的研究[3]。鉴于此，本文采用WILLMORE[4]提出
的微量注射法复制铁诱导的大鼠PTE模型，用缝隙
连接（gap junction，GJ）阻断剂甘珀酸进行干预，探
讨了GJ在PTE发生发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物清洁级健康成年雄性SD大鼠40
只，鼠龄6～8周，体质量220～250g，由南通大学实
验动物中心提供。所有动物自然昼夜节律光照，室温
（25±2）℃，湿度40%～60%，在鼠笼内可自由获得
食物与水。
1.1.2 主要试剂及仪器甘珀酸（纯度≥98%）购自
美国Sigma-Aldrich公司；氯化铁（FeCl3）购自上海市
金山化工厂；兔抗Cx43、Cx32多克隆抗体购自北京
博奥森生物技术有限公司；即用型快速免疫组织化
学试剂盒、DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术
开发有限公司；β-actin、一抗稀释液、HRP标记山羊
抗兔IgG（H+L）及BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江
苏碧云天生物技术有限公司；脑立体定位仪购自美
国Stoelting公司；微量注射泵购自美国WPI公司；
冷冻切片机、正置显微镜均为德国Leica公司产品；
电泳仪由美国Bio-Rad公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物分组大鼠随机分为5组，每组8只。
①正常组和②模型组：将10μL 0.1mol/L的FeCl3
溶液注射于大鼠左侧额叶皮质感觉运动区域；③假
手术组：将等量生理盐水注射于大鼠左侧额叶皮质
感觉运动区域；④甘珀酸预防组：造模前30min予
甘珀酸20 mg/kg腹腔注射；⑤甘珀酸治疗组：造模
后每日腹腔注射1次甘珀酸，剂量仍为20mg/kg。
1.2.2 PTE 大鼠模型的复制及行为学观察铁离
子注射复制PTE大鼠模型，参照WILLMORE提出的
方法[4]，并稍作改良。大鼠以10%水合氯醛溶液（350
mg/kg）腹腔麻醉后，固定于立体定向仪上，常规消毒
皮肤后，沿头顶正中线切开头皮，切口长约3.0cm。
根据大鼠脑立体定位图谱[5]，在左侧颅骨冠状缝后
2.0mm、矢状缝旁2.0mm处钻一个直径2.0mm的
孔（见图1），微量注射泵缓慢进针至靶点，进针深度
为2.5mm，缓慢注射0.1mmol的FeCl3溶液，速率1
μL/min，注射剂量为10μL，注射后留针10min，以
防注射入脑组织内的FeCl3溢出。最后缝合头顶皮
肤，常规消毒后，将大鼠从定位仪上取下。注射过程
中及随后120min内观察大鼠行为学表现，此后于每
日上午9～11点定时观察，并记录发作等级。根据经
典的大鼠癫痫发作Racine分级[6]。判断大鼠癫痫发
作行为，0级：无任何癫痫发作行为；1级：面部阵挛，
咀嚼，哈欠；2级：1级加点头，面部抽搐，颈部肌肉抽
动；3级：2级加前肢或后肢抽搐；4级：3级加后肢站
立，身体突然立起；5级：4级加四肢节律性抽动，下
肢强直伴全身背曲或抽动，跌倒。根据Racine分级，
4级以上发作为模型成功。
1.2.3 免疫组织化学染色检测大鼠大脑皮质中
Cx43的表达造模后14d，将大鼠麻醉，开胸暴露
心脏，经左心室依次灌注生理盐水、4%多聚甲醛磷
酸盐缓冲液。断头取脑，4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液
中固定24h后，依次移入含20%和30%蔗糖的磷酸
缓冲液中进行梯度脱水。取大鼠大脑前囟后3.20～
3.80mm的断面于冷冻下连续切片，片厚6μm。采
用SP法行免疫组织化学染色：将脑片置入0.01mol
PBS中漂洗后放入过氧化酶阻断溶液中，室温下孵
育 10 min，洗涤后加入兔抗 Cx43 多克隆抗体（1︰
100）4℃孵育1d，除去抗体，洗涤后加入即用型快速
免疫组织化学试剂羊抗小鼠/兔IgG（1︰50），室温
下孵育15min，除去二抗，洗涤后加入DAB显色，苏
木精快速衬染30s，自来水冲洗返蓝，脱水后盖玻片
封闭，光学显微镜下观察。用抗体稀释液替代一抗
处理脑片作阴性对照。阳性细胞标准：细胞浆着棕
黄色。
1.2.4 Western blotting法检测大鼠大脑中Cx32的
表达 将大鼠断头，在冰上取出脑组织，称取0.1g
海马组织在1mL蛋白裂解液加10μL蛋白酶抑制
剂中匀浆，充分混匀后高速离心沉淀，取上清液，通
23· ·
中国现代医学杂志 第23卷
表1 癫痫大鼠每日发作Racine评分的平均最高等级
组别 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天
模型组 3.50± .76 3.88±0.64 4.50±0.53 4.63±0.52 4.75±0.46 4.75±0.46 4.75±0.46
治疗组 2.75±0.46 3.38±0.52 3.63±0.741） 4.00± .761） 4.13±0.641） 4.13±0.351） 4.13±0.351）
预防组 1.38±0.921）2） 2.50± .531）2） 2.75±0.711）2） 3.125±0.351）2） 3.50± .531）2） 3.88±0.641） 4.25±0.711）
第8天 第9天 第10天 第11天 第12天 第13天 第14天
模型组 4.75±0.46 4.63±0.52 4.38±0.74 4.38±0.52 4.13±0.64 3.75±0.89 3.38±0.52
治疗组 3.88±0.641） 4.00± .531） 3.63±0.521） 3.38±0.741） 3.25±0.711） 3.00± .531） 2.63±0.741）
预防组 4.00± .761） 3.75±0.461） 3.88±0.641） 3.63±0.741） 3.38±0.741） 3.25±0.46 3.13±0.64
注：1）与模型组比较，P<0.05；2）与治疗组比较，P<0.05
A：注射FeCl3大鼠注射部位额叶感觉运动皮质区明显萎缩，且
皮质出现棕黄色变色；B：注射生理盐水的大鼠仅见注射针孔
图2 大鼠脑注射铁离子的大体形态
A B
1）与正常组比较，P<0.01；2）与模型组比较，P<0.05
图3 大鼠皮质中Cx43阳性细胞数量（×400）
正常组 模型组 治疗组 预防组假手术组
80
60
40
20
0
C
x
4
3
p
o
s
i
t
i
v
e
c
e
l
l
s
1）
2） 2）
过BCA法测出蛋白浓度。按每上样孔60μg蛋白上
样量计算出上样容积，上样至已制备好的10%分离
胶板上的样孔里，以恒压110V 1.5h及恒流350mA
2h分别进行电泳及转膜，牛奶封闭2h、一抗（Cx32
1︰200；β-actin 1︰1 000）4℃孵育过夜、二抗
（HRP标记山羊抗兔IgG 1︰500）室温2h孵育、E-
CL发光、暗房显影定影，应用数字凝胶成像系统拍
照，计算目的条带与内参条带的光密度值，以两者比
值表示Cx32的相对含量。
1.3 统计学方法
采用Stata 10.0统计软件进行数据分析，所有数
据用均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因
素方差分析，两两比较采用q检验，绘图工具采用
Sigma Plot2001，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 注射铁离子对大鼠脑大体形态的影响
模型组大体外观可见左侧注射部位额叶感觉运
动皮质区明显萎缩，同时肉眼可见皮质区有约1～3
mm的棕黄色皮层表面变色，为含铁血黄素沉着（见
图2A），而假手术组相应部分仅见注射针孔痕迹，余
未见明显病理改变（见图2B）。
2.2 甘珀酸对大鼠癫痫发作程度的影响
正常组及假手术组大鼠无癫痫发作行为学表
现，造模成功后大鼠可见多种类型的癫痫发作。与
模型组相比，甘珀酸预防和治疗均可以明显降低大
鼠癫痫发作评分（P<0.05），且相比于甘珀酸治疗组，
提前应用甘珀酸预防方法在早期（5d内）效果更佳
（P<0.05，见表1）。
2.3 大鼠大脑皮质中Cx43表达的变化
每例动物取6张连续切片，在10×40光镜下计
数皮质Cx43阳性细胞数，取平均值为每只大鼠的阳
性细胞数。阳性细胞胞核经苏木精衬染为淡紫色，胞
浆由DAB着色成棕褐色。正常及假手术组Cx43阳
性细胞零星出现，染色浅；模型组Cx43阳性细胞数
较正常组明显增多（P<0.01），且染色深，斑点样的着
色物增多；而应用甘珀酸后，无论是甘珀酸预防组还
是治疗组，Cx43阳性细胞数较模型组明显减少（P<
0.05），尤其治疗组Cx43阳性细胞呈散在分布，且染
色较浅，与假手术组相似（见图3、4）。
2.4 大鼠大脑中Cx32蛋白表达的变化
采用BIO-RAD电泳仪随机携带的Scion Image
软件，测量各组Cx32条带光密度值及其对应的β-
actin条带光密度值后，求出两者的比值，再将不同组
24· ·
表2 大鼠大脑中Cx32蛋白的表达（x±s）
组别 光密度值比
正常组 0.3913±0.04518
假手术组 0.4063±0.04173
模型组 0.8538±0.038521）
治疗组 0.4675±0.038082）
预防组 0.4375±0.036152）
注：1）与正常组比较，P<0.01；2）与模型组比较，P<0.01
A：正常组；B：假手术组；C：模型组；D：治疗组；E：预防组
图5 大鼠大脑中Cx32蛋白的表达
A B C D E
β-actin
Cx32
42kD
32kD
别间的比值进行对比。正常及假手术组Cx32蛋白表
达量很少；与正常组相比，模型组Cx32蛋白表达量
明显增加（P<0.01）；Cx32蛋白表达在甘珀酸治疗与
预防组中差异不大，与模型组相比差异有统计学意
义（P<0.01，见表2和图5）。
3 讨论
单个神经元的电活动引起成千上万个神经元同
时高度同步化异常放电，首先需要将信息传递至成
千上万的神经元，而神经元之间的信号传递主要依
靠突触来进行，但突触传递信号的能力十分有限，大
多数突触都不能达到100Hz递频率，而脑电图检测
发现，癫痫患者病灶内的神经元的放电频率可超过
1000Hz，这些高频信号是如何形成的，目前人类并
不清楚[7]。
在自然界中，一个电路，具有一定的电负荷，存
在一定强度的电流，其中有一个连接点，这个连接点
如果由于电解或氧化出现接触不良，就会出现放电
现象，这时电路中的用电器也会受损或不能正常使
用。放电后不外乎使连接点中断或者使连接点更好
地连接，其结果都导致这个连接点放电现象暂时或
永久消失。人们为了避免再出现这种放电，首先是把
这个连接点焊接得更牢固，没有条件时就把这个连
接点彻底断开，前一种选择恢复了原电路的功能，后
一种选择避免了电路的进一步损害。在中枢神经系
统中，生物电在神经元中的传播构成了一条条电路，
在这些电路中，GJ为结构基础的电突触，是神经元之
间的连接点，近几年来，人们已把癫痫研究的目光投
向GJ，但大多数局限于GJ与中枢神经系统异常放电
的同步化上[8-10]，并试图通过寻找GJ阻断剂为癫痫
治疗开辟新的途径。受宏观世界放电现象的启发，
本研究组认为GJ作为神经系统生物电路中的连接
点，在各种异常理化及生物因子作用下，结构和功能
也会发生改变，使之在生物电传导中因“接触不良”
受阻，自身或外界的原因，使GJ两侧的电负荷和电
流强度达到一定量时，将爆发异常放电，随着后者的
同步化扩布，相应区域的大脑功能出现障碍[11]。
鉴于此，本研究成功复制了铁离子诱导的PTE
大鼠模型，记录了大鼠癫痫发作的行为学表现，并检
测了大鼠脑组织中Cx43及Cx32的表达，通过造模
前后给予甘珀酸，比较了各组动物上述指标的差异。
实验选择铁离子诱导的大鼠 PTE 模型以及 Cx43、
Cx32作为观察指标，是因为外伤后脑组织受损，胶质
细胞瘢痕修复，新的神经元网络形成，GJ乃胶质细胞
之间以及胶质细胞与神经元之间的主要连接方式，
其在结构和功能上的差异可能在PTE的发生上起
了关键性的作用[12-13]；大脑皮层的GJ比较丰富，而
且是PTE受损以及随后痫性发作形成和传播的重
要部位；Cx43是成年哺乳动物中枢神经组织中分布
及表达最多的一种，且更多地在星形胶质细胞中表
第35期 陈伟观，等：甘珀酸模前干预对外伤性癫痫大鼠脑组织中Cx43、Cx32表达的影响
A：正常组；B：假手术组；C：模型组；D：治疗组；E：预防组
图4 大鼠皮质中Cx43的表达（×200）
A B C D E
25· ·
达，Cx32是在脑组织中居第2位的连接蛋白，主要表
达于少突神经胶质细胞[14]，因此，能更好地说明问题。
本实验发现，将FeCl3注入大鼠感觉运动皮层能
触发神经元爆发性放电，引起癫痫发作的行为学改
变，且病程明显地分为急性期、静止期和慢性期，接
近于人类的PTE病程。分子生物学检测结果显示，
造模14d后，大鼠Cx43及Cx32表达水平较正常组
及假手术组明显增强（P<0.05）。由此印证了脑组织
损伤后随着胶质细胞的增生，Cx43及Cx32表达增
强，PTE也趋于形成，与前期的一些研究一样[15]，再
次证实了GJ参与了PTE的发生和发展[16]。
本实验给予GJ阻断剂甘珀酸干预，试图进一步
探究GJ在癫痫发生发展中的相关机制。甘珀酸具有
良好的血脑屏障通透性，是一种广谱的GJ阻断剂。
由于其在临床上已经用于治疗胃溃疡，而且具有强大
的GJ阻断作用，因此备受关注[17]。本研究于造模前
后用甘珀酸进行干预，结果显示，于造模前应用甘珀
酸，可以显著减轻造模后5d内大鼠癫痫发作程度，
与造模后干预组相比有统计学意义（P<0.05），造模
后干预组的起效时间明显晚于造模前干预组。甘珀
酸于造模后的干预作用与MEDINA-CEJA等[18]研究
一样，再一次证实了GJ阻断剂在抗癫痫治疗上的良
好前景，更有意义的是造模前的干预作用，提示甘珀
酸可能还具有干预或抑制异常GJ形成的作用，为
脑组织损伤后预防PTE提供了新途径，本结果在一
定程度上进一步支持本文讨论之初提出的关于GJ
结构和功能的改变导致脑电在神经元间传导时“接
触不良”是神经元异常放电的起源的假说。这一假说
的提出，使临床上的一些疑虑得以解释，如症状性癫
痫的病灶总是在具有GJ的大脑灰质[19]；不同年龄段
癫痫发作的形式不同与GJ及Cx在不同年龄段的表
达不同存在一定的关联[20]；PTE之所以在外伤后数月
或数年后发病，与损伤的脑组织修复过程中形成了
异常的GJ[21]以及高频放电的存在等有关。如果上述
假说成立，人们不仅可以通过寻找能够修复在生物
电传导中“接触不良”的GJ物质，以开辟治疗癫痫
的新途径，还可以通过对癫痫高危人群，如脑外伤者，
使用一些干预异常GJ形成的药物，以达到预防癫痫
发生的目的。
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