全 文 ：1 4 8 9年 广 西 农 学 院 学 报 第 2期
灵香草细菌性软腐病的病原鉴定 ’
陈育新 戴肇英 薛振南 曹先知
(广西农学院植保系 )
凌 勇
( 金秀县农业局 )
提 要
灵香草细菌性软腐病是危害灵香草的一种毁 灭性病害 。 本病在广西金秀县
灵香草种植 区普遍发生 。 融水县也有分布 。 1 8 2 9年 5月一 工 8 9 3年 6月我们在
金秀县 采样 。 进行 了病原细菌的分离培养和致病性测 定 , 从 中选取 10 个代表性
菌林做 了形态 、 培养性状 、 生理生化等方 面的研 完 , 并和 白菜软腐病菌进行 了
比较和 交互接种试验 。 结果衣明 灵香草软腐病菌和 白菜软肩病菌都是同一个 变
种的细菌 , 即为 E r。 :` ` a e a : o t o 。 o : a o a r . e a r o 才o v o : a 。 血清学研 究 表明 灵
香草软腐病菌也存在不同的血清型 。
灵香草 (属报春花科 , 学名是 L y : i。 。 hc 2’a f 。 。 : 。 m 一 , · ae 。 “ 二 H“ cl e ) 又叫香草 ,
全草含芳香油 , 是一种药用香料植物资源 。 它喜生于高 山林下沟谷旁的阴湿处 。 在广西
主要在大瑶山和大苗山栽培 。 灵香草经济价值很高 , 畅销国内外 。 由于发生一种极其严
重 的细菌性软腐病 , 使香草产量损失 30 一 40 肠 , 甚至全部失收 。
灵香草软腐病主要为害植株地上部分如叶 、 茎和花 。 发病部位均呈明显的半透明浸
润状 , 然后迅速粘滑腐烂 。 叶片腐烂呈穿孔或残缺不全 , 甚至湿腐软烂 。 叶片基部的腐
烂常迅速延及叶柄 , 叶柄软腐而落叶或粘贴茎上 , 引起茎部腐烂 。 植株常因顶部叶片腐
烂导致烂顶 , 在潮湿多雨季节 ( 4 一 5 月 ) 迅速往茎基部发展 , 形如点蜡烛状 。 群众根
据这些特点 , 把它叫做 “ 蜡烛瘟 ” 、 “ 点蜡烛 ” 或 “ 香草瘟 ” 。 当天气较为干燥 , 植株
较老时 , 茎秆表皮烂掉后 , 尚存木质部组织 , 若经雨水淋洗 , 木质部白色如剥去麻皮的
* 本鉴定经 过华南 农学 院赖文姜副教授 审阅。 植保系 81 级研究生陈保善制 备和提供 香一 15 抗血清 。 娜
本 院植保系微生物教研室李政祥副 教投 、 刘兴荔老师 , 收 医系兽 医微生物教研室韦家槐副教投 、 一粗蟹咨师对 我们的工作给予热情支持和帮助 。 连云鹏老师 、 罗国安 同志拍摄 照片 。 鲁英荣 、 冯茹珍、 张超 冲 等 老 师
参加过病害标本采契 、 调查 、 镜检。 均此一并致谢 ! .
麻秆 , 我们称之为 “ 白秆 ” 病状 。 白秆与健茎表皮的交界处常有明显凸起 , 褐色的 “ 伤
愈 , 组织 。 (见图版 工 , l 、 2 、 3 )
在叶片上 , 本病常与 S e tP oT l’a 、 A了co hc yt a 真菌性叶斑病 的发生有关 , 但不应误认
为 S e P t o ir a 就是 “ 墙烛瘟 ” 的病原 。 关于本病 国内外均未曾研究和报导过 。
一 、 材 朴 和 方 法
(一 ) 菌株的分离和培养
供试菌株是 1 9 8 2一 1 9 8 3年在金秀县采样 。 采用平板划线分离法 〔 ` 〕 进行病 原 细菌
的分离 , 经过纯培养 , 致病性测定后 , 从中选择不同分离部位的菌株 10 个参加试验 。 并
以我们在南宁分离的白菜软腐病菌菌株作比较 。 菌株来源和编号见表 1 。 菌株培养和保
存均采用马铃薯蔗糖琼脂 ( 以下简称 P S A ) 培养基 。 培养温度 27 一28 ℃ 。
参 加 试 验 的 菌 株
分 部 分 分离 日期
香一 1
香一 2
香一 3
香一 5
香一 7
香一 8
香一 9
香一 n
香一15
香一 17
日一 1
叶片 (壳 针袍菌叶斑 )
叶片 (病部浸润状 、 穿孔 )
叶片 (壳针泡菌叶斑 )
烂 茎
叶片 (病 部浸润状 、 穿孔 )
烂 顶
烂 顶
叶片 (病部浸润状 、 穿孔 )
叶片 (病 部浸润状 、 穿孔 )
叶片 (病部浸润状 、 穿孔 )
小 白菜状腐病叶俩 (腐烂 )
1 9 8 2
。
5
。
2 8
19 8 3
。
5
。
7
1 9 8 3
。
5
。
7
1 9 8 3
。
5
。
7
1 9 8 3
。
6
。
7
1 9 8 3
。
6
。
8
1 9 8 3
。
6
。
8
1 9 8 3
。
6
。
15
1 9 8 3
。
6
。
1 5
1 9 8 3
。
6
。
1 5
1 9 8 2
。
1 1
分离地点
广西农学院
广西农学院
广西农学院
广西农学院
广西金秀
广西金秀
广西金秀
广西金秀
广西金秀
广西农学院
广 西农学院
(二 ) 致病性测定和交互接种试验方法
( l ) 先在普通烟草叶片上进行过敏性反应测定 〔 ` 〕 。
( 2 ) 灵香草软腐病菌和 白菜软腐病菌的纯培养物 (2 7一28 ℃ , 培养 24 小时 ) 用无
菌水洗脱配成 9 一 12 x 1 0 “ 个 / 毫升浓度菌悬液 , 梅花针束针刺接种在盆栽和离 体 的香
草茎 、 叶上 。 交互接种试验 , 是把灵香草软腐病菌与白菜软腐病菌在灵香草和 白菜 、 芥
菜 、 芥兰 、 萝 卜的叶片 、 叶柄以及马铃薯块茎上分别进行针刺接种 。 接种后 27 一 28 ℃保
持饱和相对湿度 2 4小时后 , 观察有无软腐症状 。 以无菌水接种作对照 。
(三 ) 病菌的形态和培养性状观察
病原菌的形态和培养性状的观察研究多参照 “ 植病研究方法 ” 〔 ` 〕 和 “ 一般细菌常
用鉴定方法 ” 〔 2〕 。
细菌的形状和大小是在 P S A平皿上 , 27 一 28 ℃培养24 小时后 , 采用印片法 制片 ,
美蓝染色后观察和测计的 。 鞭毛采用 “ 改进刘荣标氏法 ” 〔 “ 〕 染液染色 。
培养性状方面 : 除在 P S A 和肉汁陈酵母膏蔗糖琼脂上观察菌落的形状 、 色 泽和质
地外 , 还进行适宜生长的 p H值测定 。
(四 ) 病菌生理生化反应测定
基本上按照 “ 伯杰氏细菌学鉴定手册 (八版 ) ,. 〔“ 〕 上要求的项 目并参照 “ 植物研 -
究方法 ” 〔` 〕 “ 一般细菌常用鉴定方法 ” 〔 “ 〕 介绍的有关方法进行测定 。
(五 ) 血清反应试验
以香一 1 , 香一 8 , 香一 15 和白一 1菌株作抗原 , 免疫家兔制备抗血清 〔 ’ 〕 。进行
了 H 一 凝集反应和 0 一凝集反应 , 琼脂双扩散和免疫电泳等血清学测定 〔 ` ’ 7 ’ 吕〕 。
二 、 试 验 结 果
(一 ) 灵香草软腐病菌的致病性和交互接种
灵香草软腐病菌在烟叶上产生明显的过敏性枯斑 。 交互接种表明 : 白 菜 软 腐 病菌
(白一 1 ) 可使灵香草发病 , 灵香草软腐病菌可使白菜发病外 , 还能引起芥菜 、 芥兰 、
萝 卜和马铃薯发病 , 而且症状都相同 。 白一 1 菌株对灵香草的致病力稍弱 。
(二 ) 形态和染色反应
灵香草软腐病菌和白菜软腐病菌 ( 白一 l ) 都是杆状菌 , 大小相似 。 白一 l 菌株为
2
.
2一 7 . O X 0 . 5~ 0 . 7微米 , 单生 、 双生或线状 (1 0 . 5一 23 又 0 . 6微米 ) , 灵香草 软 腐病
菌 -0] 个菌株 , 每个菌株测量 50 个菌体的总群体大小范围 2 . 0一 8 . 6 X 0 . 5~ 0 . 7微米 , 菌体
单生 、 双生 , 少数 3 一 4 个链生或呈线状 ( 1 1 . 0一 5 . 0 x o . 5一 0 . 6微米 ) 。 均周生鞭毛
2 ~ 12 根 , 以 3 一 6 根居多 , 老龄菌体 (适温培养 4 8小时后 ) 对一般碱性 染 料 着 色甚
差 , 而菌体内异染粒 ( 1一数粒 ) 明显 。 格兰氏染色反应阴性 , 不产生芽抱和荚膜 。 (见
图版 I , 4 、 5 )
(三 ) 培养特性
灵香草软腐病菌菌株在 P S A 上生长 良好 , 菌苔丰厚 , 乳白色 , 灰白色至 污 白 色 ,
质地为乳酪状 。 在平皿上单菌落园形至变形 虫状 , 初期半透明 , 稍萤光 , 边 缘 为 非全
缘 。 适温培养 3 一 5 天后 , 菌落丰厚 , 中央微隆起 。 p H S . 5一 8 . 1均 良好生长 。 在牛肉
膏蛋 白陈酵母膏琼脂上最适宜生长的 p H值为 7 . 8左右 , 但不如 F S A 上生长好 。 (见图版
I
, 6
、
7 )
白一 1 菌株的培养性状基本上如 上述 , 但菌落 (菌苔 ) 后期略呈污黄色 。 菌落表面
较湿润 。
灵香草软腐病菌和白一 l 不仅最适宜在 P S A 上生长 , 而且适宜在该培养 基 上 保存
菌种 , 它们在 P S A 上产碱力强 , 可使培养基的 p H值升高到 8 左右 。 在牛肉膏蛋白 陈酵
母膏培养液 (P H 7 。 2一 8 。 2) 中能良好生长 ,适温培养 24 小时混浊 , 表面无膜 , 有少量细
密的粉粒状物沉淀 。 在灭菌马铃薯柱斜面上 , 菌苔污黄色 , 不丰盛 , 薯块稍变灰黄褐色 。
(四 ) 生理生化特性
灵香草软腐病菌和白一 1菌株的生理生化特性基本一致 。 生长的最适宜温度范围是
2 0~ 30℃ , 最高生长温度 36 ℃ , 37 ℃不能生长 , 致死温度 50 ℃ 10 分钟 , 8 一 10 ℃生长缓
慢 。 兼性厌氧性细菌 。
其他测定 , 除碳素产酸 、 明胶液化和石蕊牛乳试验培养观察两周外 , 其余是在接菌
后 的 2 4 、 4 3和 22小付观察和测定的 。 观测表明仅 V . P .反应表现不稳定和不一致 ; 明胶
液化快慢也稍 育差异 ; 灵香草菌株不产生叫噪 。 见表 2 和表 3 。
明胶液化多在接种后的第三夭开始 , 而香一 1 和香一 9 在接种后两周才开始 , 白一
1在接种后一周少量液化 , 两周后才明显液化 。
( 五 ) 血清学测定结果
初步表明灵香草坎腐病菌存在不同 的血清型 ; 香一 1 , 香一 3 , 香一 5 , 香一 8 ,
香一 9 为 I 血清型 ; 香一 15 , 香一 17 与 白一 l 表现为 1血清型 ; 香一 1 1和白一 4 (华南
农学院提供的白菜软腐病菌株 ) 不属 I 型 , 也不属 亚型 。 见表 4 、 表 5 。
测定结果表明 , 鞭毛凝集效价高 , 有特异性 , 香一 1和香一 8的 H一凝集 R 值 二 1 0 外 ;
O 一 凝集 R书 值 = 70 肠 , 可视为同一血清型 , 称 I 型 。 香一 15 和自一 1 的 H 一 凝集 R值 “
7。帕 , O 一 凝 集R值 二 2 5肠 , 其鞭毛抗原亲缘关系较近 , 称 互型 。 凝集素吸附测定 和凉
脂双扩 , 免疫电泳亦表明 I 型和 I 型血清型间的抗原明显不同 。
` R值 `肠 ) 二了r , 二 : ` 1。”肠
r , 二 异型血清效价 , * 同型血清效价 : r Z = 异型血清效价 : * 同型血清效价 2
试验菌株从有机化合物产酸情况
一,争,.叮Jù一辛ù1止一二ój|`匕óùō伟`1工一ó几jl上一ōú一子r!
J.上一茉曰
!
Oéù甲否一!
00ù玉曰!月`一ù邓比1ta一ù一主目!9口ù ì一水曰!O自ì白|1
一十一+一十
十+十+十 } 十
{
+ } +
+
+十一+十一
D 一阿拉伯糖
D 一甘露醇
水杨贰
D 一木糖
D 一 ( + ) 棉子 糖
醇糖甜肌乳
D一 ( + ) 松三 糖
葡萄搪氧化发酵 }
发酵量产酸!靛!同左}同左 }同左同左同左同左网左一同左 } 同左
注 : + 表示阳性反应 , 产酸 。
一表示阴性反应 , 不能利用 , 不产酸 。
表 3 试验菌株的生理生化特征
夏…戛…真
十 十 +
香!9一十1111一!
断!lll we汁…、l!l!, l
一Cù
香18一十+一à牙
一no
l潘日冲JJ厅111卜阵!什l比!l 一lll…1卜ù1雪!5一+二十ùǐ爵!3一十二+士香12一+二十ō白 香一 1
十+十+
++
十 缓慢
+ +
+ 缓慢
十
一+ú千
+一十+一十慢缓一ú+十
℃托十
菌株
项 目
~
~ ~ ~
、
从胧氨酸产H : S
生长于 36 ℃
葡萄糖酸盐氧化
蔗糖还原化合物
硝酸盐还原
明胶液化
苯丙氨酸脱氨酶
p引 噪
从葡萄糖产气
生长最高温
生长于 5 肠食盐
卵磷醋酶
对红霉素敏感性 ( 5 0协幼
过氧化氢酶
淀粉水解
M
。
R
V
。
P
石蕊牛乳
3 6℃
十
Pù比夕化还
十+一陈、
} l
… +
} _
酸 、 _ 陈化 、 {酸 、凝结 、 还原{凝结
注 : + 表示阳性反应
表 4
一 表示阴性反应 士表示不明显的阳性反应或不稳定
四个抗血清的交叉凝集反应测定结果
二带二二{一’ ~赢奢万一二、一下’ “ 一丁一 ” ’ 一 ’厂一~一”一 {一 ` - - -一: 竺人瓜玉…一一t 二…几8 _ _ _ _ _…_ _ _ “ 月 5 … 白一 `香一 l 〔H 〕 } 2 5 6 0 一} 5 1 2 0 } 一 - 一 一厂一一 一二一一 ~ -- - -一一 皿山 . 一 {一兰丝一 {一一旦丝 _ }_ 一 } 一香一 8 〔H 〕 } 2 5 6 0 { 5 1 2 0 }一一 二 一 一一厂一一一 -二 一 一 -
-一二 - -一一 工坦一一!一一卫丝一一 {一卫 ;丝一一 }_ _ 一 } 一香一15 〔早〕 { 一带 { 一 }- 一弓1豆正— {一一一61乏万 . — --一一一荟畏于一 一…一于一…一一三 一 一 `一号黔一 `一釜箭一一一一 ~ 一一~ 一一一夔主一~二 ~一- 一志_ 一丝一 , , _止_一丝生一二一一主兰丝~ _带 一 表示试管定量测定凝集试验 , 抗血清稀释 1 : 切滴度中无沉淀 。
5
表 5 1 、 l型血清与试验菌株的 H一凝集和O 一凝集反应测定结果
抗 测定抗原 抗 血 清 稀 释 倍 数
血
清 4 08 01 62 0 3 0 64 01 2 8 02 5 61 5 02 0C K
香一 1 香一 l〔 H〕 姗 粉 姗 姗 册 珊 十料 料 1一
〔 0〕 册 册 粉 十+十 什 十十
香一 3〔 H〕 州千 栅 姗 册 册 撇 十料 +
〔O 〕 册 册 姗 +
}香一 5〔 H〕 栅 姗 姗 册 姗 姗 舟什 十
〔O 〕 {!册 册 撇 +}
香一 9〔 H〕 册 姗 姗 料 …撇 }珊 州干 +
〔 0〕 并汁 撇 粉卜 料于 十十+ 十什
十 十 + 十 十香一 1 1 〔 H〕 手 一于十 十十 +
〔O 〕
香一 17 〔 H〕 十 + + 十 月 -一 一 一 一 {〔O 〕 一卜干于 烤一资 -十 · 一 }一
一 }一
白一 1 〔 H〕
〔O 〕 ·
白一 4 〔 H〕
〔O 〕
香一 1 〔 H〕 十白一 1 〔O 〕
香一 3〔 H〕 +
〔O 〕
香一 5〔 H〕 十
〔O 〕 十
香一 9〔 H〕 + 十+
〔O 〕 + +
6
续表 5
门 . . . 侧 . . . . . . . . 口 . 侧、 } { * 。 偿 揍 移 位 新狱 … “纽定抗原 !— 一不一一一一羊一一兰 ~厂里一一半一二一十二旦,粤丫一下 -一士丁刃~一道一 !一…兰…竺 {竺巴哗一卜竺详竺严竺毋竺 {止生十 ` …一育二.…~举…三…三…几…三…二…一三…二…创二}一尸二…一布…一…三…三…三…二…三…二…三…二
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注 : 姗表示完全凝集 , 上部液体完全澄清 。
姗表示凝集很明显 ,但上部液体稍有混浊 。 千+表示部分凝集 ,上部液体仍混浊。
+ 表示凝集很少 , 上部液体混浊 。 一 表示没有凝集 , 液体混浊 。
三 、 结 论 和 讨 论
灵香草软腐病菌菌株是在不同 日期 、 不同部位上分离得的 , 经过敏性测定 、 交互接
种 、 细菌形态 、 培养特性和生理生化特性研究表明它们与白菜软腐病菌 ( 白一 1 ) 是同
一个变种 , 即万 . aC : 。 t 。 。 。 ar 。 “ ; . ca 二艺。 。 。。 〔 “ 〕 ; 血清学研究又初步表明它们都有不
同的血清型 , 并且存在亲缘关系接近的血清型 。 但由于参试菌株数量少 , 抗血清代表性
不足 , 初步只看出两个明显不同的血清型 。 还有一些菌株与 I 、 亚型抗血清无凝集反应
或效价低 。 在琼脂双扩散中 , 无论经加热或未经加热的浓菌液 , 均无沉淀带出现 , 表现
与 I 、 亚型血清无亲缘关系或亲缘关系较远 。
对照菌株白一 1 , 是自己分离的 。 它和灵香草软腐病菌在形态培养性状和生理生化
性状上基本一致 , 存在的微小差异并不 致影响其种 、 变种 的划分 。 在交互接种试验中 ,
白一 l 菌株对灵香草的致病力稍 弱 。 总之我们因没有得到中国科学院微生物所 的白菜软
腐病菌标准菌株 ; 自己分离的参加试验的白菜软腐病菌株过少 , 对不同寄主植物的致病
性测定不 够 , 而感到欠缺 。
灵香草软腐病和叶斑病 ( eS tP 二 2’a 如 : i o ac 盯 a) 是两个性质完全不 同的病害 。 前者
造成灵香草叶 、 茎腐烂 , 是一种典型的细菌性软腐病 ; 后者是一种真菌 性 叶 斑 病 。 但
在叶斑病组织中常分离到软腐病细菌 。 故在适宜软腐病发生时 , 香草真菌性叶斑病呈浸
润半透 明 , 继而软腐 、 穿孔 、 甚至全叶腐烂 。 由于确定 了病原细菌 , 在防治灵香草的所
谓 “ 蜡烛瘟 ” 上将更有针对性 。
参 考 文 献
〔 1 〕 方中达 , 1 9 7 9 , 植病研究方法 , 农业出版社 。
〔 2 〕 中国科学院微生物研究所细菌分类组编著 , 1 9 78 , 一般细菌常用鉴定方法 , 科学
出版社 。
〔 3 〕 裘维蕃 , 1 9 8 0 , 植物病原细菌的分类鉴定一 《 伯杰氏细菌学鉴定手册 》 (八版 ) ,
植物病理译丛 , (三 ) : 14 一24 。
〔 4 〕 夏锦洪 、 方中达 , 1 9 6 2 , 玉米细菌性茎腐病病原的研究 。 植物保护学报 , 1 ( 1 ) :
1 一 14 。
〔 5 〕 罗 宽 , 1 9 84 , 国外十字花科蔬菜软腐病研究概况 。 湖南农学院学报 , ( 1 ) :
9 7一 1 0 1 0
〔 6 〕 刘兴荔 、 连云鹏 , 19 82 , 介绍两种细菌鞭毛染色法 。广西农学院学报 , ( 1 ) : 1 05
一 1 0 7 0
〔 7 〕 华南农学院植保系植病教研组细菌研究室编 , 19 8 2 , 植物病理学病原细菌实验指
导 。
〔 8 〕 徐为宜编 , 1 9 7 9 , 实验免疫学技术 , 科学出版社 。
〔 9 〕 J 。 G . H o l t , 1 9 7 7 . T h e s h o r t e r B e r g e y , 5 m a n u a l o f d e t e r m i n a t i v e
B a e t e r i o l o g y ( 8 t h )
。
〔1 0〕 M . P . 5 t a r r , 1 9 5 2 . P h y t o p a t h o g e n i c b a c t e r i a .