全 文 ：响应面法分析优化毛脉酸模多糖提取工艺
周玉，孙晓佳，孙莹，张维君，王振月*
(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要:目的:采用响应面法优选毛脉酸模多糖提取工艺。方法:采用 Box － Behnken的中心组合实验设
计原理优化毛脉酸模多糖提取方法。结果: 得到最佳工艺条件是:提取时间 2． 9h，粉碎粒度为 120 目，
醇沉浓度为 70%，重复 3 次，得到多糖的得率最高为 7． 12%。结论:采用响应面法优化得到的提取毛脉
酸模多糖参数准确可靠，具有实用价值。
关键词:响应面;毛脉酸模;多糖;提取工艺
中图分类号:R284． 2 文献标识码:A 文章编号:1002 － 2392(2013)03 － 0048 － 05
收稿日期:2013 － 03 － 06 修回日期:2013 － 04 － 05
基金项目:国家自然科学基金(No． 30970300) ;哈尔滨市科技创新人才
研究专项资金(No． 2010RFXXS031)
作者简介:周玉(1984 －) ，男，硕士研究生，主要从事医药产品的策划和
开发。
* 通讯作者:王振月(1956 －) ，男，教授，博士研究生导师，主要从事中
药资源开发与生物技术研究工作。
毛脉酸模(Rumex gmelini Turcz．)为蓼科酸模属多
年生宿根草本植物，广泛分布于黑龙江省大、小兴安岭
及张广才岭等地区，是黑龙江省、吉林长白山地区的重
要药用植物资源，在民间常以根入药，对癌症、淋病、上
呼吸道感染、癣病和疮毒有确切疗效［1 － 4］。本课题组
已在毛脉酸模的生药学及化学成分方面做了大量研
究，发现其中含有白藜芦醇、白藜芦醇苷、酸模素、大黄
酚、大黄素等多种活性成分［5 － 7］。植物多糖是普遍存
在于植物细胞壁及细胞内的一种成份［8］。到目前为
止，已有 300 多种多糖类化合物从天然产物中分离出
来，人们逐渐发现不同来源的多糖具有广泛而又复杂
的生物学活性，已引起了医药界的高度重视，并成为当
今生命科学研究的重点［9］。目前，国内外对于毛脉酸
模多糖提取工艺的研究至今未见报道，本实验主要采
用回流法提取毛脉酸模中的多糖工艺研究，考察提取
时间、粉碎粒度、醇沉浓度三因素对毛脉酸模多糖得率
的影响。在单因素试验的基础上进行响应面法优化试
验，以提取率为指标研究毛脉酸模多糖的最佳提取工
艺，为开发利用毛脉酸模资源提供基础。
1 仪器与材料
UV2600 紫外 －可见分光光度计(上海天美科学
仪器有限公司) ;FW80 微型高速万能式样粉碎机(河
北黄弊齐家务科学仪器厂) ;R － 205 型旋转蒸发仪
(上海申生科技有限公司) ;TDL － 5 离心机(上海安亭
科学仪器厂) ;HH － S恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪
器厂) ;烘干箱(重庆四达实验仪器公司) ;Mettler 电子
天平 AE 240(瑞士制造) ;筛子(振兴分样筛)。
毛脉酸模根采于黑龙江中医药大学药用植物园。
葡萄糖(天津凯通化学试剂有限公司) ;重蒸酚
(北京索莱宝科技有限公司) ;浓硫酸(青岛桓达贸易
有限公司) ;乙醇(天津永大化学试剂有限公司)。
2 实验方法
2． 1 多糖含量测定标准曲线
2． 1． 1 溶液的配制
重蒸苯酚:用蒸馏水配制成 50mg /mL的测试液。
葡萄糖溶液母液制备:取 105℃干燥至恒重的 D
(+)－葡萄糖，精密称重 1000mg，加蒸馏水定溶至 1L
容量瓶中，配成 0． 1mg /mL葡萄糖标准母液。
供试液的配制:精密称取干燥至恒重的毛脉酸模
总多糖 10mg，蒸馏水溶解，定容于 100mL 容量瓶中，
摇匀，即得供试品溶液。
2． 1． 2 最大吸收波长的选择
吸取葡萄糖溶液，经苯酚 －硫酸法显色后，以双蒸
水作空白，于分光光度计上在 200 ～ 800nm 范围内扫
描，确定最大吸收波长为 490nm。
2． 1． 3 标准曲线的制备
精确吸取葡萄糖溶液母液 0． 0mL，0． 3mL，0． 6mL，
0． 9mL，1． 2mL，1． 5mL，1． 8mL 分别至 10mL 具塞试管
中，加双馏水补充至 2． 0mL，再分别加入 50mg /mL 苯
酚测试液 1． 0mL 摇匀，快速加入浓硫酸 5． 0mL，混悬
振荡后，至沸水浴中加热 15min，于 490nm的最大吸收
波长处测定吸光度值。根据所测数据，以标准单糖浓
度 C(μg /mL)为自变量，吸光度 A 为因变量作线性回
归，绘制标准曲线，计算标准曲线回归方程为 Y =
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0. 011 5X + 0． 016 4，R2 = 0． 999 1，结果表明，在 15 ～
90μg /mL范围内呈良好的线性关系。
2． 2 毛脉酸模多糖提取方法
毛脉酸模根 －粉碎 － 95%乙醇回流 －离心得残
渣 －进行单因素考察 －响应面分析法优化工艺。
2． 3 单因素实验对多糖得率的影响
提取温度对多糖得率的影响:固定粉碎粒度在
100 目，料液比 1:20(g /mL) ，分别在 70、75、80、85、90、
95、100℃下加热回流 2． 5h 提取 1 次，离心浓缩后用
80%浓度乙醇进行醇沉，透析后冻干，称量，计算多糖
得率。每个水平做 3 次实验，取平均值。
提取时间对多糖得率的影响:固定粉碎粒度在
100 目，提取温度 90℃，料液比 1:20(g /mL) ，分别提取
1h、1． 5h、2h、2． 5h、3h、3． 5h、4h，提取 1 次，离心浓缩后
用 80%浓度乙醇进行醇沉，透析后冻干，称量，计算多
糖得率。每个水平做 3 次实验，取平均值。
药材粉碎粒度对多糖得率的影响:固定提取时间
2． 5h，提取温度 90℃，料液比 1 ∶ 20(g /mL) ，分别取粉
碎度为过 40 目筛、60 目筛、80 目筛、100 目筛、120 目
筛、200 目筛的毛脉酸模根颗粒，提取 1 次，离心浓缩
后用 80%浓度乙醇进行醇沉，透析后冻干，称量，计算
多糖得率。每个水平做 3 次实验，取平均值。
醇沉浓度对多糖得率的影响:固定粉碎度在 100
目，提取时间 2． 5h，提取温度 90℃，料液比 1:20(g /
mL) ，提取 1 次后，分别用 10% 醇、30% 醇、40% 醇、
50%醇、60%醇、70%醇、80%醇醇沉，透析后冻干，称
量，计算多糖得率。每个水平做 3 次实验，取平均值。
料液比对多糖得率的影响:固定粉碎度在 100 目，
提取时间 2． 5，提取温度 90℃，使料液比为 1:5、1:10、
1:20、1:25、1:30、1:40(g /mL) ，各提取 1 次后，离心浓
缩后用 80%浓度乙醇进行醇沉，透析后冻干，称量，计
算多糖得率。每个水平做 3 次实验，取平均值。
2． 4 响应面分析法分析因素的选取及分析方案
筛选单因素中对 RGP － B得率的影响较大的 3 个
因素，应用 Box － Behnken 的中心组合实验设计原理，
选取这 3 个因素，分别以 X1、X2、X3 代表，每一个自变
量的低、中、高实验水平分别以 － 1、0、1 进行编码，编
码值与真实值之间的关系可以用公式 Xi =(Xi － X0)/
△Xi(其中 i为自变量的编码值，Xi为自变量的的实际
实验水平值，X0 为实验水平中心点的实际值，△Xi 为
单变量增量)表示，以 RGP － B 得率为响应值设计实
验方案。
3 结果与分析
3． 1 单因素实验结果
3． 1． 1 提取温度对毛脉酸模多糖得率的影响
温度对毛脉酸模多糖得率的影响如图 1，由图可
见，当提取时间为 2． 5h，粉碎粒度在 100 目，醇沉浓度
为 80%时，随着温度的升高，多糖提取率不断升高，在
100℃前一直处于缓慢升高趋势，100℃达到最高。温
度在 70℃ ～ 95℃之间的得率无显著差异。从得到的
多糖溶液中发现，随着温度的升高，多糖色泽加深。而
且温度较低时的多糖溶液较温度较高时的多糖粘度较
高。故提取温度选择 100℃，不将其作为响应面考察
因素。
图 1 温度对毛脉酸模多糖得率的影响
3． 1． 2 时间对毛脉酸模多糖得率的影响
提取时间对毛脉酸模多糖得率的影响如图 2。
图 2 提取时间对毛脉酸模多糖得率的影响
由图可见，在提取温度为 90℃，粉碎粒度为 100
目，醇沉浓度为 80%时，随着时间的延长，多糖提取率
不断升高，在 3 h后随着时间的延长，多糖提取率基本
平缓，说明毛脉酸模多糖已基本提取完毕，为使多糖尽
可能多的提取出来，同时考虑能源节省的问题，所以选
择提取时间范围为 2 ～ 3h，将其做为响应面考察因素。
3． 1． 3 粉碎粒度对毛脉酸模多糖得率的影响
粉碎粒度对毛脉酸模多糖得率的影响如图 3，由
图 3 可见，在提取温度为 90℃，提取时间为 2． 5h，醇沉
浓度为 80%时，在 100 目之前随着粉碎度的增加，提
取率不断增加，但当提取目数大于 100 目后，提取率开
始下降，可能原因是粉碎度过大，使比表面积增大，使
其自身吸附作用加强，多糖扩散速度受到影响，而且其
表面更容易吸附气泡和电荷，影响多糖的溶出，另多糖
黏度较大，易于粘附在细微颗粒上，不能过滤完全，也
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是其提取率下降的可能原因之一。为使多糖尽可能多
的提取出来，因此选取粉碎粒度在 80 ～ 100 目最为
适宜。
图 3 粉碎粒度对毛脉酸模多糖得率的影响
3． 1． 4 醇沉浓度对毛脉酸模多糖提取率的影响
图 4 醇沉浓度对毛脉酸模多糖得率的影响
醇沉浓度对毛脉酸模多糖提取率的影响如图 4，
由图可知，在提取温度为 90℃，提取时间 2． 5h，粉碎粒
度为 100 目下，随着乙醇终浓度的增加，多糖析出的量
随之增加，当乙醇终浓度为 70%时多糖析出量达到最
高，因此本实验选用乙醇终浓度为 60%、70%、80%时
为因素水平。
3． 1． 5 料液比对多糖得率的影响
料液比对毛脉酸模多糖提取率的影响如图 5。
图 5 料液比对毛脉酸模多糖得率的影响
由图 5 所知，随着料液比的增加，多糖的得率也不
断增加，当料液比为 1:30 时，提取率达到最大，因此选
取料液比为 1:30 为宜，在此不将其做为响应面考察
因素。
3． 2 响应面分析优化工艺
3． 2． 1 响应面分析实验设计
表 1 响应面分析与因素水平表
因素
水平
－ 1 0 1
时间(h)X1 2 2． 5 3
粉碎粒度(目)X2 80 100 120
醇沉浓度(%)X3 60 70 80
根据 Box － Behnken的中心组合实验设计原理，综
合单因素实验影响结果，确定提取相关因素中的不变
量为提取温度 100℃、料液比为 1:30(g /mL)、提取次
数为 1 次。选取提取时间、粉碎粒度和醇沉终浓度为
毛脉酸模多糖得率影响显著的 3 个因素，在单因素实
验的基础上采用 3 因素 3 水平响应面分析方法，分析
因素与水平设计见表 2，响应面分析方案及实验结果
见表 2。
表 2 响应面实验设计及实验结果
实验号
X1
时间(h)
X2
粒度(目)
X3
醇沉浓度(%)
多糖提取
率(%)
1 － 1 － 1 0 5． 98
2 1 － 1 0 5． 93
3 － 1 1 0 6． 64
4 1 1 0 7． 01
5 － 1 0 － 1 6． 72
6 1 0 － 1 6． 51
7 － 1 0 1 6． 72
8 1 0 1 6． 98
9 0 － 1 － 1 5． 95
10 0 1 － 1 6． 91
11 0 － 1 1 6． 01
12 0 1 1 6． 95
13 0 0 0 7． 03
14 0 0 0 7． 04
15 0 0 0 7． 06
16 0 0 0 7． 03
17 0 0 0 7． 05
对提取时间、粉碎粒度和醇沉浓度做如下变换
X1 =(h － 2． 5)/0． 5，X2 = (m － 100)/10，X3 = (a －
70)/10，(其中 h =时间，m =目数，a =醇沉浓度) ，以 3
次实验所得多糖提取率的平均值为响应值(Y) ，在响
应面实验设计及实验结果中，其中 1 － 12 是析因实验，
13 － 17 是中心实验，用来估算实际误差。
3． 2． 2 模型的确定
使用 Design － Expert8． 0 系统处理表 2 中试验结
果，以寻找合适的回归方程。表 3 为三种回归模型的
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方差分析，由表得出，一次次模型拟合不显著，三次模
型拟合较为显著，二次模型拟合极显著，在此系统建议
采用拟合显著的二次型。对模型进行失拟检验(表 4)
发现，3 种拟合模型失拟程度由大到小的顺序为:线性
模型、二次模型、三次模型，其中线性模型失拟达到显
著水平，而二次、三次模型拟均不显著。对上述 3 种模
型的决定系数 R2、R2 校正值分析(表 5)可以看出，二
次模型和三模型的值相近，并显著优于一次模型。从
R2 预测值来看，一次模型最差，而三次模型优于二次
模型。而预测残差平方的结果显示，二次模型值最小。
对三个模型从以上三方面评估，认定本实验应选用二
次多项式模型。
表 3 多种模型方差分析比较
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
平均值 758． 05 1 758． 05
线性 0． 099 3 0． 033 0． 27 0． 846 8
二次 1． 21 3 0． 40 93． 40 ＜ 0． 000 1
三次 0． 029 3 0． 009 8 57． 70 0． 000 9
残差 0． 000 68 4 0． 000 174
总计 761． 09 17 44． 77
表 4 模型的失拟实验
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
线性 1． 33 9 0． 15 871． 63 ＜ 0． 000 1
二次 0． 029 3 0． 009 8 57． 70 0． 000 9
三次 0． 000 0
误差 0． 000 68 4 0． 000 17
表 5 R2 综合分析
类型 误差均方根 R2 R2 校正值 R2 预测值 预测残差平方和
线性 0． 32 0． 562 2 0． 461 2 0． 293 8 2． 15
二次 0． 066 0． 990 1 0． 977 4 0． 845 2 0． 47
三次 0． 013 0． 999 8 0． 999 1
表 6 毛脉酸模多糖提取回归方程分析
方差来源 自由度 平方和 均方 F值 P(F ＞ Fα) 显著性
X1 1 0． 017 1 0． 335 4 77． 981 9 ＜ 0． 000 1 ＊＊
X2 1 1． 656 2 0． 017 1 3． 978 9 0． 086 3
X3 1 0． 040 6 1． 656 2 385． 098 8 ＜0． 000 1 ＊＊
X1 X2 1 0． 044 1 0． 040 6 9． 443 2 0． 018 0 *
X1 X3 1 0． 055 2 0． 044 1 10． 254 1 0． 015 0 *
X2 X3 1 0． 000 1 0． 055 2 12． 840 9 0． 008 9 ＊＊
X1 X1 1 0． 147 6 0． 000 1 0． 023 3 0． 883 1
X2 X2 1 0． 909 4 0． 147 6 34． 327 2 0． 000 6 ＊＊
X3 X3 1 0． 062 9 0． 909 4 211． 463 1 ＜ 0． 000 1 ＊＊
残差 7 0． 030 0． 004 3
误差 4 0． 000 68 0． 000 17
总和 16 3． 05
注:* 为显著(P ＜ 0． 05) ，＊＊为高度显著(P ＜ 0． 01)。
3． 2． 3 回归方程的建立与检验
采用 Design － Expert． V． 8． 0． 5b 对响应值与各因
素进行二次多项式回归拟合，得到因子编码值回归方
程和实际值回归方程。
编码值回归方程:Y =7． 04 + 0． 046X1 + 0． 46X2 +
0． 071X3 + 0． 10X1X2 + 0． 12X1X3 － 0． 005X2X3 －
0. 19X1X1 － 0． 46X2X2 － 0． 12X3X3
实际值回归方程:Y = 11． 515 75 + 1． 142 50A +
0. 228 87B + 0． 119 53C + 0． 010 5AB + 0． 023 500AC －
0． 749 00A2 － 0． 001 16187 B2 － 0． 001 222 5C2
式中 Y表示多糖提取率的预测值，X1、X2、X3 分
别是时间、粉碎粒度、醇沉浓度的编码值，A、B、C 分别
是时间、粉碎粒度、醇沉浓度的实际值。
3． 2． 4 回归方程与因子效应分析
由表 6 可得，一项式 X1 和 X3 对多糖得率的线性
效应达到极显著水平(P ＜ 0． 01)。二项式 X2X3 和
X2X2 也极为显著。决定系数 R2 和 R2 校正值可以验
证回归方程的拟合程度，R2 校正值为 0． 977 4，表明在
毛脉酸模多糖的提取工艺中，大约有 97． 7%的变异分
布在所考察的 3 个因素当中，另外有 2． 3%的变异不
能用该模型解释。相关系数 R = 0． 990 1，表明毛脉酸
模多糖得率的实际值与预测值之间具有良好的拟合相
关性。
3． 2． 5 响应面分析优化提取条件
图 6 时间和粉碎粒度对多糖得率影响
的响应面与等值线
图 7 时间和醇沉浓度对多糖得率影响
的响应面与等值线
响应曲面和对应的等高线的形状能够直观的反应
交互效应的大小，圆形反应两因素的交互作用弱，而椭
圆形则较强。
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图 8 粉碎粒度和醇沉浓度对多糖得率影响
的响应面与等值线
当醇沉浓度取零水平即 70%时，提取时间和粉碎
粒度的变化对多糖得率的影响关系图 6。可以看出，
在提取时间在试验范围内的任何值时，粉碎粒度对多
糖率的影响均很明显，均表现出随粉碎度的增加，多糖
得率先升高后降低的趋势。这是于粒度不断变小，增
大了溶液与物料的接触面积，有助于多糖的溶出，而粒
度过小时，使比表面积增大，使其自身吸附作用加强，
多糖扩散速度受到影响，而且其表面更容易吸附气泡
和电荷，影响多糖的溶出，另多糖黏度较大，易于粘附
在细微颗粒上，不能过滤完全，使提取率下降。当提取
时间为 2． 61h，粉碎粒度在 110． 75 目时，模型预测提
取率达到最大值 7． 17%。当粉碎粒度固定时，醇沉浓
度和提取时间对多糖得率的影响关系如图 7。醇沉浓
度的增大使多糖得率表现为先增大后减小的趋势，这
说明醇沉浓度过高可能会导致多糖得率的下降。但变
化趋势较小。在提取时间为 2． 63h，醇沉浓度为
74. 58%的时候，模型预测得率达到最大值 7． 06%。
当提取时间固定时，粉碎粒度和醇沉浓度对多糖得率
的影响关系如图 8。可以看出，二者具有的交互作用
较强，当粉碎粒度在 109． 39 目，醇沉浓度为 72. 19%
的时候，模型预测的最大提取率可以达到 7. 16%。
通过系统爬坡模拟寻优法，得到最优方案为:提取
时间为 2． 93h、粉碎粒度为 117． 33 目、醇沉浓度为
71. 33%，在此条件下，模型预测可达到多糖提取率的
最大值为 7． 086%。根据实际情况，优化提取方案为:
提取时间 2． 9h、粉碎粒度为 120 目、醇沉浓度为 70%。
采用优化后的提取方案，进行外部验证，重复 3 次，得
到多糖的得率为 7． 12%，高于预测值。因此，采用响
应面优化得到的提取毛脉酸模多糖的参数准确可靠，
具有实用价值。
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ZHOU Yu，SUN Xiao － jia，SUN Ying，ZHANG Wei － jun，WANG Zhen － yue
(Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)
Abstract:Objective:The experient used response surface methoddogy(RSM)to optimize the best Rumex gmelini poly-
saccharide extraction conditions． Methods:Box － Behnke statistical design technology was used to optimize the method of
Rumex gmelini polysaccharide extraction． With the response surface optimization，the optimum conditions were:extraction
time 2． 9h;the grinding particle size was 120 mesh;the alcohol precipitation concentration was 70% and the decoction
was carried out for three times，and its gotten rate was about 7． 12% ． Conclusion:By using the response surface method
the parameters of optimized extraction of Rumex gmelini polysaccharide are accurate and reliable，and have a practical
value．
Key words:Response surface method;Rumex gmelini;Polysaccharide;Extraction technology
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中 医 药 学 报
Acta Chinese Medicine and Pharmacology
2013 年第 41 卷第 3 期
Vol. 41，No. 3，2013