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响应面法分析优化毛脉酸模多糖提取工艺



全 文 :响应面法分析优化毛脉酸模多糖提取工艺
周玉,孙晓佳,孙莹,张维君,王振月*
(黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要:目的:采用响应面法优选毛脉酸模多糖提取工艺。方法:采用 Box - Behnken的中心组合实验设
计原理优化毛脉酸模多糖提取方法。结果: 得到最佳工艺条件是:提取时间 2. 9h,粉碎粒度为 120 目,
醇沉浓度为 70%,重复 3 次,得到多糖的得率最高为 7. 12%。结论:采用响应面法优化得到的提取毛脉
酸模多糖参数准确可靠,具有实用价值。
关键词:响应面;毛脉酸模;多糖;提取工艺
中图分类号:R284. 2 文献标识码:A 文章编号:1002 - 2392(2013)03 - 0048 - 05
收稿日期:2013 - 03 - 06 修回日期:2013 - 04 - 05
基金项目:国家自然科学基金(No. 30970300) ;哈尔滨市科技创新人才
研究专项资金(No. 2010RFXXS031)
作者简介:周玉(1984 -) ,男,硕士研究生,主要从事医药产品的策划和
开发。
* 通讯作者:王振月(1956 -) ,男,教授,博士研究生导师,主要从事中
药资源开发与生物技术研究工作。
毛脉酸模(Rumex gmelini Turcz.)为蓼科酸模属多
年生宿根草本植物,广泛分布于黑龙江省大、小兴安岭
及张广才岭等地区,是黑龙江省、吉林长白山地区的重
要药用植物资源,在民间常以根入药,对癌症、淋病、上
呼吸道感染、癣病和疮毒有确切疗效[1 - 4]。本课题组
已在毛脉酸模的生药学及化学成分方面做了大量研
究,发现其中含有白藜芦醇、白藜芦醇苷、酸模素、大黄
酚、大黄素等多种活性成分[5 - 7]。植物多糖是普遍存
在于植物细胞壁及细胞内的一种成份[8]。到目前为
止,已有 300 多种多糖类化合物从天然产物中分离出
来,人们逐渐发现不同来源的多糖具有广泛而又复杂
的生物学活性,已引起了医药界的高度重视,并成为当
今生命科学研究的重点[9]。目前,国内外对于毛脉酸
模多糖提取工艺的研究至今未见报道,本实验主要采
用回流法提取毛脉酸模中的多糖工艺研究,考察提取
时间、粉碎粒度、醇沉浓度三因素对毛脉酸模多糖得率
的影响。在单因素试验的基础上进行响应面法优化试
验,以提取率为指标研究毛脉酸模多糖的最佳提取工
艺,为开发利用毛脉酸模资源提供基础。
1 仪器与材料
UV2600 紫外 -可见分光光度计(上海天美科学
仪器有限公司) ;FW80 微型高速万能式样粉碎机(河
北黄弊齐家务科学仪器厂) ;R - 205 型旋转蒸发仪
(上海申生科技有限公司) ;TDL - 5 离心机(上海安亭
科学仪器厂) ;HH - S恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪
器厂) ;烘干箱(重庆四达实验仪器公司) ;Mettler 电子
天平 AE 240(瑞士制造) ;筛子(振兴分样筛)。
毛脉酸模根采于黑龙江中医药大学药用植物园。
葡萄糖(天津凯通化学试剂有限公司) ;重蒸酚
(北京索莱宝科技有限公司) ;浓硫酸(青岛桓达贸易
有限公司) ;乙醇(天津永大化学试剂有限公司)。
2 实验方法
2. 1 多糖含量测定标准曲线
2. 1. 1 溶液的配制
重蒸苯酚:用蒸馏水配制成 50mg /mL的测试液。
葡萄糖溶液母液制备:取 105℃干燥至恒重的 D
(+)-葡萄糖,精密称重 1000mg,加蒸馏水定溶至 1L
容量瓶中,配成 0. 1mg /mL葡萄糖标准母液。
供试液的配制:精密称取干燥至恒重的毛脉酸模
总多糖 10mg,蒸馏水溶解,定容于 100mL 容量瓶中,
摇匀,即得供试品溶液。
2. 1. 2 最大吸收波长的选择
吸取葡萄糖溶液,经苯酚 -硫酸法显色后,以双蒸
水作空白,于分光光度计上在 200 ~ 800nm 范围内扫
描,确定最大吸收波长为 490nm。
2. 1. 3 标准曲线的制备
精确吸取葡萄糖溶液母液 0. 0mL,0. 3mL,0. 6mL,
0. 9mL,1. 2mL,1. 5mL,1. 8mL 分别至 10mL 具塞试管
中,加双馏水补充至 2. 0mL,再分别加入 50mg /mL 苯
酚测试液 1. 0mL 摇匀,快速加入浓硫酸 5. 0mL,混悬
振荡后,至沸水浴中加热 15min,于 490nm的最大吸收
波长处测定吸光度值。根据所测数据,以标准单糖浓
度 C(μg /mL)为自变量,吸光度 A 为因变量作线性回
归,绘制标准曲线,计算标准曲线回归方程为 Y =
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0. 011 5X + 0. 016 4,R2 = 0. 999 1,结果表明,在 15 ~
90μg /mL范围内呈良好的线性关系。
2. 2 毛脉酸模多糖提取方法
毛脉酸模根 -粉碎 - 95%乙醇回流 -离心得残
渣 -进行单因素考察 -响应面分析法优化工艺。
2. 3 单因素实验对多糖得率的影响
提取温度对多糖得率的影响:固定粉碎粒度在
100 目,料液比 1:20(g /mL) ,分别在 70、75、80、85、90、
95、100℃下加热回流 2. 5h 提取 1 次,离心浓缩后用
80%浓度乙醇进行醇沉,透析后冻干,称量,计算多糖
得率。每个水平做 3 次实验,取平均值。
提取时间对多糖得率的影响:固定粉碎粒度在
100 目,提取温度 90℃,料液比 1:20(g /mL) ,分别提取
1h、1. 5h、2h、2. 5h、3h、3. 5h、4h,提取 1 次,离心浓缩后
用 80%浓度乙醇进行醇沉,透析后冻干,称量,计算多
糖得率。每个水平做 3 次实验,取平均值。
药材粉碎粒度对多糖得率的影响:固定提取时间
2. 5h,提取温度 90℃,料液比 1 ∶ 20(g /mL) ,分别取粉
碎度为过 40 目筛、60 目筛、80 目筛、100 目筛、120 目
筛、200 目筛的毛脉酸模根颗粒,提取 1 次,离心浓缩
后用 80%浓度乙醇进行醇沉,透析后冻干,称量,计算
多糖得率。每个水平做 3 次实验,取平均值。
醇沉浓度对多糖得率的影响:固定粉碎度在 100
目,提取时间 2. 5h,提取温度 90℃,料液比 1:20(g /
mL) ,提取 1 次后,分别用 10% 醇、30% 醇、40% 醇、
50%醇、60%醇、70%醇、80%醇醇沉,透析后冻干,称
量,计算多糖得率。每个水平做 3 次实验,取平均值。
料液比对多糖得率的影响:固定粉碎度在 100 目,
提取时间 2. 5,提取温度 90℃,使料液比为 1:5、1:10、
1:20、1:25、1:30、1:40(g /mL) ,各提取 1 次后,离心浓
缩后用 80%浓度乙醇进行醇沉,透析后冻干,称量,计
算多糖得率。每个水平做 3 次实验,取平均值。
2. 4 响应面分析法分析因素的选取及分析方案
筛选单因素中对 RGP - B得率的影响较大的 3 个
因素,应用 Box - Behnken 的中心组合实验设计原理,
选取这 3 个因素,分别以 X1、X2、X3 代表,每一个自变
量的低、中、高实验水平分别以 - 1、0、1 进行编码,编
码值与真实值之间的关系可以用公式 Xi =(Xi - X0)/
△Xi(其中 i为自变量的编码值,Xi为自变量的的实际
实验水平值,X0 为实验水平中心点的实际值,△Xi 为
单变量增量)表示,以 RGP - B 得率为响应值设计实
验方案。
3 结果与分析
3. 1 单因素实验结果
3. 1. 1 提取温度对毛脉酸模多糖得率的影响
温度对毛脉酸模多糖得率的影响如图 1,由图可
见,当提取时间为 2. 5h,粉碎粒度在 100 目,醇沉浓度
为 80%时,随着温度的升高,多糖提取率不断升高,在
100℃前一直处于缓慢升高趋势,100℃达到最高。温
度在 70℃ ~ 95℃之间的得率无显著差异。从得到的
多糖溶液中发现,随着温度的升高,多糖色泽加深。而
且温度较低时的多糖溶液较温度较高时的多糖粘度较
高。故提取温度选择 100℃,不将其作为响应面考察
因素。
图 1 温度对毛脉酸模多糖得率的影响
3. 1. 2 时间对毛脉酸模多糖得率的影响
提取时间对毛脉酸模多糖得率的影响如图 2。
图 2 提取时间对毛脉酸模多糖得率的影响
由图可见,在提取温度为 90℃,粉碎粒度为 100
目,醇沉浓度为 80%时,随着时间的延长,多糖提取率
不断升高,在 3 h后随着时间的延长,多糖提取率基本
平缓,说明毛脉酸模多糖已基本提取完毕,为使多糖尽
可能多的提取出来,同时考虑能源节省的问题,所以选
择提取时间范围为 2 ~ 3h,将其做为响应面考察因素。
3. 1. 3 粉碎粒度对毛脉酸模多糖得率的影响
粉碎粒度对毛脉酸模多糖得率的影响如图 3,由
图 3 可见,在提取温度为 90℃,提取时间为 2. 5h,醇沉
浓度为 80%时,在 100 目之前随着粉碎度的增加,提
取率不断增加,但当提取目数大于 100 目后,提取率开
始下降,可能原因是粉碎度过大,使比表面积增大,使
其自身吸附作用加强,多糖扩散速度受到影响,而且其
表面更容易吸附气泡和电荷,影响多糖的溶出,另多糖
黏度较大,易于粘附在细微颗粒上,不能过滤完全,也
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是其提取率下降的可能原因之一。为使多糖尽可能多
的提取出来,因此选取粉碎粒度在 80 ~ 100 目最为
适宜。
图 3 粉碎粒度对毛脉酸模多糖得率的影响
3. 1. 4 醇沉浓度对毛脉酸模多糖提取率的影响
图 4 醇沉浓度对毛脉酸模多糖得率的影响
醇沉浓度对毛脉酸模多糖提取率的影响如图 4,
由图可知,在提取温度为 90℃,提取时间 2. 5h,粉碎粒
度为 100 目下,随着乙醇终浓度的增加,多糖析出的量
随之增加,当乙醇终浓度为 70%时多糖析出量达到最
高,因此本实验选用乙醇终浓度为 60%、70%、80%时
为因素水平。
3. 1. 5 料液比对多糖得率的影响
料液比对毛脉酸模多糖提取率的影响如图 5。
图 5 料液比对毛脉酸模多糖得率的影响
由图 5 所知,随着料液比的增加,多糖的得率也不
断增加,当料液比为 1:30 时,提取率达到最大,因此选
取料液比为 1:30 为宜,在此不将其做为响应面考察
因素。
3. 2 响应面分析优化工艺
3. 2. 1 响应面分析实验设计
表 1 响应面分析与因素水平表
因素
水平
- 1 0 1
时间(h)X1 2 2. 5 3
粉碎粒度(目)X2 80 100 120
醇沉浓度(%)X3 60 70 80
根据 Box - Behnken的中心组合实验设计原理,综
合单因素实验影响结果,确定提取相关因素中的不变
量为提取温度 100℃、料液比为 1:30(g /mL)、提取次
数为 1 次。选取提取时间、粉碎粒度和醇沉终浓度为
毛脉酸模多糖得率影响显著的 3 个因素,在单因素实
验的基础上采用 3 因素 3 水平响应面分析方法,分析
因素与水平设计见表 2,响应面分析方案及实验结果
见表 2。
表 2 响应面实验设计及实验结果
实验号
X1
时间(h)
X2
粒度(目)
X3
醇沉浓度(%)
多糖提取
率(%)
1 - 1 - 1 0 5. 98
2 1 - 1 0 5. 93
3 - 1 1 0 6. 64
4 1 1 0 7. 01
5 - 1 0 - 1 6. 72
6 1 0 - 1 6. 51
7 - 1 0 1 6. 72
8 1 0 1 6. 98
9 0 - 1 - 1 5. 95
10 0 1 - 1 6. 91
11 0 - 1 1 6. 01
12 0 1 1 6. 95
13 0 0 0 7. 03
14 0 0 0 7. 04
15 0 0 0 7. 06
16 0 0 0 7. 03
17 0 0 0 7. 05
对提取时间、粉碎粒度和醇沉浓度做如下变换
X1 =(h - 2. 5)/0. 5,X2 = (m - 100)/10,X3 = (a -
70)/10,(其中 h =时间,m =目数,a =醇沉浓度) ,以 3
次实验所得多糖提取率的平均值为响应值(Y) ,在响
应面实验设计及实验结果中,其中 1 - 12 是析因实验,
13 - 17 是中心实验,用来估算实际误差。
3. 2. 2 模型的确定
使用 Design - Expert8. 0 系统处理表 2 中试验结
果,以寻找合适的回归方程。表 3 为三种回归模型的
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方差分析,由表得出,一次次模型拟合不显著,三次模
型拟合较为显著,二次模型拟合极显著,在此系统建议
采用拟合显著的二次型。对模型进行失拟检验(表 4)
发现,3 种拟合模型失拟程度由大到小的顺序为:线性
模型、二次模型、三次模型,其中线性模型失拟达到显
著水平,而二次、三次模型拟均不显著。对上述 3 种模
型的决定系数 R2、R2 校正值分析(表 5)可以看出,二
次模型和三模型的值相近,并显著优于一次模型。从
R2 预测值来看,一次模型最差,而三次模型优于二次
模型。而预测残差平方的结果显示,二次模型值最小。
对三个模型从以上三方面评估,认定本实验应选用二
次多项式模型。
表 3 多种模型方差分析比较
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
平均值 758. 05 1 758. 05
线性 0. 099 3 0. 033 0. 27 0. 846 8
二次 1. 21 3 0. 40 93. 40 < 0. 000 1
三次 0. 029 3 0. 009 8 57. 70 0. 000 9
残差 0. 000 68 4 0. 000 174
总计 761. 09 17 44. 77
表 4 模型的失拟实验
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
线性 1. 33 9 0. 15 871. 63 < 0. 000 1
二次 0. 029 3 0. 009 8 57. 70 0. 000 9
三次 0. 000 0
误差 0. 000 68 4 0. 000 17
表 5 R2 综合分析
类型 误差均方根 R2 R2 校正值 R2 预测值 预测残差平方和
线性 0. 32 0. 562 2 0. 461 2 0. 293 8 2. 15
二次 0. 066 0. 990 1 0. 977 4 0. 845 2 0. 47
三次 0. 013 0. 999 8 0. 999 1
表 6 毛脉酸模多糖提取回归方程分析
方差来源 自由度 平方和 均方 F值 P(F > Fα) 显著性
X1 1 0. 017 1 0. 335 4 77. 981 9 < 0. 000 1 **
X2 1 1. 656 2 0. 017 1 3. 978 9 0. 086 3
X3 1 0. 040 6 1. 656 2 385. 098 8 <0. 000 1 **
X1 X2 1 0. 044 1 0. 040 6 9. 443 2 0. 018 0 *
X1 X3 1 0. 055 2 0. 044 1 10. 254 1 0. 015 0 *
X2 X3 1 0. 000 1 0. 055 2 12. 840 9 0. 008 9 **
X1 X1 1 0. 147 6 0. 000 1 0. 023 3 0. 883 1
X2 X2 1 0. 909 4 0. 147 6 34. 327 2 0. 000 6 **
X3 X3 1 0. 062 9 0. 909 4 211. 463 1 < 0. 000 1 **
残差 7 0. 030 0. 004 3
误差 4 0. 000 68 0. 000 17
总和 16 3. 05
注:* 为显著(P < 0. 05) ,**为高度显著(P < 0. 01)。
3. 2. 3 回归方程的建立与检验
采用 Design - Expert. V. 8. 0. 5b 对响应值与各因
素进行二次多项式回归拟合,得到因子编码值回归方
程和实际值回归方程。
编码值回归方程:Y =7. 04 + 0. 046X1 + 0. 46X2 +
0. 071X3 + 0. 10X1X2 + 0. 12X1X3 - 0. 005X2X3 -
0. 19X1X1 - 0. 46X2X2 - 0. 12X3X3
实际值回归方程:Y = 11. 515 75 + 1. 142 50A +
0. 228 87B + 0. 119 53C + 0. 010 5AB + 0. 023 500AC -
0. 749 00A2 - 0. 001 16187 B2 - 0. 001 222 5C2
式中 Y表示多糖提取率的预测值,X1、X2、X3 分
别是时间、粉碎粒度、醇沉浓度的编码值,A、B、C 分别
是时间、粉碎粒度、醇沉浓度的实际值。
3. 2. 4 回归方程与因子效应分析
由表 6 可得,一项式 X1 和 X3 对多糖得率的线性
效应达到极显著水平(P < 0. 01)。二项式 X2X3 和
X2X2 也极为显著。决定系数 R2 和 R2 校正值可以验
证回归方程的拟合程度,R2 校正值为 0. 977 4,表明在
毛脉酸模多糖的提取工艺中,大约有 97. 7%的变异分
布在所考察的 3 个因素当中,另外有 2. 3%的变异不
能用该模型解释。相关系数 R = 0. 990 1,表明毛脉酸
模多糖得率的实际值与预测值之间具有良好的拟合相
关性。
3. 2. 5 响应面分析优化提取条件
图 6 时间和粉碎粒度对多糖得率影响
的响应面与等值线
图 7 时间和醇沉浓度对多糖得率影响
的响应面与等值线
响应曲面和对应的等高线的形状能够直观的反应
交互效应的大小,圆形反应两因素的交互作用弱,而椭
圆形则较强。
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图 8 粉碎粒度和醇沉浓度对多糖得率影响
的响应面与等值线
当醇沉浓度取零水平即 70%时,提取时间和粉碎
粒度的变化对多糖得率的影响关系图 6。可以看出,
在提取时间在试验范围内的任何值时,粉碎粒度对多
糖率的影响均很明显,均表现出随粉碎度的增加,多糖
得率先升高后降低的趋势。这是于粒度不断变小,增
大了溶液与物料的接触面积,有助于多糖的溶出,而粒
度过小时,使比表面积增大,使其自身吸附作用加强,
多糖扩散速度受到影响,而且其表面更容易吸附气泡
和电荷,影响多糖的溶出,另多糖黏度较大,易于粘附
在细微颗粒上,不能过滤完全,使提取率下降。当提取
时间为 2. 61h,粉碎粒度在 110. 75 目时,模型预测提
取率达到最大值 7. 17%。当粉碎粒度固定时,醇沉浓
度和提取时间对多糖得率的影响关系如图 7。醇沉浓
度的增大使多糖得率表现为先增大后减小的趋势,这
说明醇沉浓度过高可能会导致多糖得率的下降。但变
化趋势较小。在提取时间为 2. 63h,醇沉浓度为
74. 58%的时候,模型预测得率达到最大值 7. 06%。
当提取时间固定时,粉碎粒度和醇沉浓度对多糖得率
的影响关系如图 8。可以看出,二者具有的交互作用
较强,当粉碎粒度在 109. 39 目,醇沉浓度为 72. 19%
的时候,模型预测的最大提取率可以达到 7. 16%。
通过系统爬坡模拟寻优法,得到最优方案为:提取
时间为 2. 93h、粉碎粒度为 117. 33 目、醇沉浓度为
71. 33%,在此条件下,模型预测可达到多糖提取率的
最大值为 7. 086%。根据实际情况,优化提取方案为:
提取时间 2. 9h、粉碎粒度为 120 目、醇沉浓度为 70%。
采用优化后的提取方案,进行外部验证,重复 3 次,得
到多糖的得率为 7. 12%,高于预测值。因此,采用响
应面优化得到的提取毛脉酸模多糖的参数准确可靠,
具有实用价值。
参考文献:
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Optimization of Polysaccharide Extraction from Rumex Gmelini
Turcz. Using Response Surface Methodology
ZHOU Yu,SUN Xiao - jia,SUN Ying,ZHANG Wei - jun,WANG Zhen - yue
(Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)
Abstract:Objective:The experient used response surface methoddogy(RSM)to optimize the best Rumex gmelini poly-
saccharide extraction conditions. Methods:Box - Behnke statistical design technology was used to optimize the method of
Rumex gmelini polysaccharide extraction. With the response surface optimization,the optimum conditions were:extraction
time 2. 9h;the grinding particle size was 120 mesh;the alcohol precipitation concentration was 70% and the decoction
was carried out for three times,and its gotten rate was about 7. 12% . Conclusion:By using the response surface method
the parameters of optimized extraction of Rumex gmelini polysaccharide are accurate and reliable,and have a practical
value.
Key words:Response surface method;Rumex gmelini;Polysaccharide;Extraction technology
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中 医 药 学 报
Acta Chinese Medicine and Pharmacology
2013 年第 41 卷第 3 期
Vol. 41,No. 3,2013
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