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·中药制剂·
响应面法优化蒙药肋柱花总黄酮超声提取工艺*
刘婷 高优恒 葛春娟 鄢长华 梁耀求 李骁#
刘婷，女，在读硕士生
# 通信作者:李骁，男，博士，副教授，硕士生导师，E-mail:lx_leexiao@ 163． com
* 内蒙古自然科学基金面上项目(No． 2013MS1208)，内蒙古医科大学 2015 年度实验室开放基金项目(No． 2015ZN03)
(内蒙古医科大学药学院 内蒙古 010110)
摘要:目的 采用单因素试验和响应面法优化肋柱花总黄酮的超声波辅助提取工艺，为肋柱花中黄
酮类化合物的开发利用提供理论依据。方法 以乙醇溶液为提取溶剂，在单因素试验的基础上，以
乙醇体积分数(X1)、液料比(X2)、超声时间(X3)为自变量，以总黄酮含量(Y)为响应值进行 Box-
Behnken中心组合试验设计，建立肋柱花总黄酮含量的二次回归方程，得到优化组合条件。结果
响应面法分析结果表明，肋柱花总黄酮最佳提取工艺条件为 65%乙醇，液料比 20 mL /g，提取时间
为 20 min，在此条件下总黄酮含量为 21． 26 mg /g，试验结果与模型预测值相符。二项式拟合复相
关系数 r = 0． 956 8。结论 应用响应面方法优选的肋柱花总黄酮提取工艺稳定、合理、可行。
关键词:肋柱花;总黄酮;超声提取;响应面法
中图分类号:Ｒ283 doi:10． 3969 / j． issn． 1006-2157． 2016． 06． 013
Optimization of ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids from
Lomatogonium rotatum by response surface analysis*
LIU Ting，GAO Youheng，GE Chunjuan，YAN Changhua，LIANG Yaoqiu，LI Xiao#
(College of Pharmacy，Inner Mongolia Medical University，Inner Mongolia 010110 )
Abstract:Objective To optimize ultrasonic-assisted extraction process of total flavonoids from
Lomatogonium rotatum by using single factor experiment and response surface methodology，so as to
provide the theoretical evidence for the exploitable and utilization of flavonoids in Lomatogonium rotatum．
Methods Ethanol solution was selected as the extraction solvent． Based on the single factor experiment，
three independent variables of ethanol volume fraction(X1)，material to liquid ratio(X2)and sonication
time(X3)with the response value of the content of total flavonoids(Y)were designed for Box-Behnken
central composite experiment，then a quadric regression equation was established to predict the yield of
total flavonoids． Ｒesults The optimum extraction process was 65% ethanol solution(V /V)with liquid to
material ratio of 20 mL /g for 20 minutes． The actual yield of total flavonoids were 21． 26 mg /g，very close
to the predictive values． The binomial fitting multiple correlation coefficient (r)is 0． 956 8． Conclusion
Optimizing the extraction process of total flavonoids of Lomatogonium rotatum by response surface
methodology was proved to be stable，reasonable and feasible．
Keywords:Lomatogonium rotatum;total flavonoids;ultrasonic-assisted extraction;response surface
methodology
肋柱花，系龙胆科植物肋柱花 Lomatogonium ro-
tatum (L．)Fries ex Nym的干燥全草，为蒙医、藏医
临床常用药。全草入蒙药，蒙药名哈毕日干 －地格
达，味苦，性寒、钝、糙、轻、燥，具有清热，疗伤的功
效。主治胆痞，黄疸，消化不良，巴达干协日合并症，
协日热，肝胆热病［1］。常作为主药与波棱瓜子、山
205
北京中医药大学学报
Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine
第 39 卷第 6 期 2016 年 6 月
Vol． 39 No． 6 Jun． 2016
苦荬等配伍为地格达-8 或单用于清“协日”热;又因
其具有清肝胆热的功效，故在地格达-25、地格达-
20、地格达-15 中作为主药用于清肝热，双目及肢体
发黄、胆痞及“协日”滞瘀脏器所引起的各种疾
病［2］;在肋柱花四味汤散(地格达-4)中作为主药与
黄连、栀子、瞿麦配伍用于治疗血热相搏，肝胆热，咽
喉肿痛，口渴烦躁［3］。
现代研究表明，肋柱花中含有苯并色原酮类、黄
酮类及其苷类、三萜类及其苷类、环烯醚萜类、内酯
类及有机酸类［4 － 5］。其中黄酮类化合物和三萜类化
合物在抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗心血管疾病、
解热、保肝、镇痛、调节机体免疫力等方面具有重要
的作用［6 － 10］。目前，有关肋柱花总黄酮提取方法的
报道较少，只见陈玉兰等［11］初步比较了超声法、回
流法和连续回流法对肋柱花总黄酮得率的影响，未
对超声条件进行筛选。因此，为考虑各因素对肋柱
花总黄酮含量影响的变化规律及交互作用，本试验
采用超声提取法，选取乙醇体积分数、液料比、提取
时间 3 个因素，通过单因素试验和响应面法优化试
验，以期获得肋柱花总黄酮超声提取的最佳工艺条
件，为该蒙药的进一步研究奠定基础。
1 材料
1． 1 仪器
TU-1901 型双光束紫外可见分光光度计(北京
普析通用仪器有限责任公司);AL204 型电子天平
(梅特勒 －托利多仪器有限公司);OSB-2100-CE 型
旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社，埃朗科技国
际贸易有限公司);HH-S2 型数显恒温水浴锅(金坛
市医疗仪器厂);KH5200DE 型数控超声波清洗器
(昆山禾创超声仪器有限公司) ;粉碎机。
1． 2 试药
芦丁(批号:141211，供含量测定用，上海如吉
生物科技公司);氯化铝，亚硝酸钠，氢氧化钠和乙
醇等均为分析纯。
1． 3 药材
肋柱花购于内蒙古锡林郭勒盟西乌旗，经内蒙
古医科大学药学院李骁副教授鉴定为龙胆科植物肋
柱花 Lomatogonium rotatum (L．)Fries ex Nym 的干
燥全草，粉碎过 80 目筛［12］备用。
2 方法与结果
2． 1 总黄酮的测定方法
2． 1． 1 对照品溶液的制备
精密称取在 120 ℃下干燥至恒重的芦丁对照品
14 mg，置 10 mL 容量瓶中，加 60%乙醇适量，置水
浴上微热使溶解，放冷，加 60%乙醇至刻度，摇匀。
即得(含芦丁 1． 40 g /L)。
2． 1． 2 供试品溶液的制备
取肋柱花粉末约 0． 5 g，精密称定，用一定浓度
体积的乙醇作溶剂，超声波提取一定的时间，取出，
过滤，滤液旋蒸浓缩，并吹干，用相应浓度体积的乙
醇溶解，并定容于 10 mL 的容量瓶中，摇匀，作为供
试品溶液。
2． 1． 3 测定波长的选择
分别取供试品溶液和对照品溶液各 0． 3 mL，分
别按“2． 1． 4”、“2． 1． 5”项下依法操作，在紫外可见
分光光度计上于 200 ～ 700 nm 扫描，结果对照品溶
液与供试品溶液在 507 nm处均有最大吸收，且试剂
空白和不加显色剂的样品溶液在 507 nm 处均无吸
收，故确定 507 nm为检测波长。
2． 1． 4 标准曲线的绘制
参照文献［13］，精密量取对照品溶液 0． 0、0． 1、
0． 2、0． 3、0． 4、0． 5、0． 6 mL，置 10 mL容量瓶中，各加
蒸馏水至 4． 0 mL，分别精密加 5% NaNO2溶液 0． 3
mL，摇匀，放置 5 min ;加 10% AlCl3 溶液 0． 3 mL，
摇匀，放置 6 min ;加 4% NaOH溶液 2． 0 mL，再加
蒸馏水至刻度，摇匀，放置 15 min 。以对照品溶液
中 0． 0 mL的溶液做空白，照紫外可见分光光度法，
在 507 nm 波长处测定吸光度，以吸光度(A)为纵坐
标，对照品溶液质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲
线，得回归方程为 A = 10． 383X + 0． 010 5，r 2 = 0．
999 3，表明芦丁在 14． 0 ～ 84． 0 mg /L范围内与吸光
度呈良好的线性关系。
2． 1． 5 供试品溶液中总黄酮的含量测定
参照文献［14］，精密量取供试品溶液 0． 3 mL，
置 10 mL容量瓶中，加蒸馏水至 4． 0 mL，照“2． 1． 4”
项下的方法，自“加 NaNO2 溶液 0． 3 mL”起，依法测
定吸光度，同时取供试品溶液 0． 3 mL，除不加 NaOH
溶液外，其余同上操作，作为空白，从标准曲线上读
出供试品溶液中含无水芦丁的重量(mg)，计算，
即得。
本法测定总黄酮含量时，按下式计算含量:Y =
10X × N /m ，其中 X 为供试品溶液总黄酮含量(g /
L)，Y为总黄酮含量(mg /g)，N为稀释倍数，N = 10 /
0． 3，m = 0． 5 g。
2． 1． 6 精密度试验
取一定质量浓度的供试品溶液，按“2． 1． 5”项
305第 6 期 刘婷等 响应面法优化蒙药肋柱花总黄酮超声提取工艺
显色，连续测定 6 次，其吸光度的 ＲSD为 0． 25%，表
明仪器精密度良好。
2． 1． 7 稳定性试验
取供试品溶液，按“2． 1． 5”项显色，于室温分别
放置 0、5、10、15、20 、25、30、35、40、45、50 min，测定
供试品溶液吸光度，前 20 min 内其 ＲSD为 1． 71%。
表明供试品溶液在 20 min内稳定。
2． 1． 8 重现性试验
精密称取同批样品 6 份。按“2． 1． 2”项制备供
试品溶液，按“2． 1． 5”项方法测定。供试品中总黄
酮含量的平均值为 20． 31 mg /g，ＲSD =1． 35% 。
2． 2 单因素试验
采用单因素试验考察乙醇体积分数(X1)、液料
比(X2)、超声时间(X3)对肋柱花总黄酮提取效果的
影响。
2． 2． 1 乙醇体积分数对提取液总黄酮含量的影响
精密称取 0． 5 g肋柱花粉末 5 份，固定液料比 30
mL /g，提取时间 30 min，超声波功率 100 W，提取 1
次，考察乙醇体积分数在 50% ～ 90% 范围内对总黄
酮含量的影响。每个平行因素做 3组，结果见图 1。
图 1 乙醇体积分数对总黄酮含量的影响
Fig． 1 Effects of ethanol volume fraction on the
content of total flavonoids
从图 1 可知，乙醇体积分数对总黄酮含量影响
较大，体积分数为 70%时总黄酮含量最高。故选择
乙醇体积分数在 60%、70%、80%时进行优化。
2． 2． 2 液料比对提取液总黄酮含量的影响
精密称取 0． 5 g 肋柱花粉末 6 份，固定乙醇体
积分数为 70%，提取时间 30 min，超声波功率 100
W，提取 1 次 ，考察液料比在 10 ～ 60 mL /g 范围内
对总黄酮含量的影响。每个平行因素做 3 组，结果
见图 2。
从图 2 可知，液料比为 30 mL /g 时总黄酮含量
最高。故选择液料比在 20、30、40 mL /g 时进行
图 2 液料比对总黄酮含量的影响
Fig． 2 Effect of liquid to material ratio on the
content of total flavonoids
优化。
2． 2． 3 超声时间对提取液总黄酮含量的影响
精密称取 0． 5 g 肋柱花粉末 5 份，固定液料比
为 30 mL /g，乙醇体积分数为 70%，超声波功率 100
W，提取 1 次，考察超声时间在 10 ～ 50 min范围内对
总黄酮含量的影响。每个平行因素做 3 组，结果见
图 3。
图 3 超声时间对总黄酮含量的影响
Fig． 3 Effect of sonication time on the
content of total flavonoids
从图 3 可知，超声时间为 30 min 时总黄酮含量
最高。故选择超声时间在 20、30、40 min 时进行
优化。
2． 3 响应面法优化试验
在单因素试验的基础上，根据 Box-Behnken 的
中心组合试验设计原理，选取乙醇体积分数(X1)、
液料比(X2)、超声时间(X3)3 个因素为自变量，以
平行 3 次试验所得总黄酮含量的平均值为响应值
(Y)，设计 3 因素 3 水平，共 17 个试验点的响应面
分析试验，其中 12 个析因试验、5 个中心试验，并根
据单因素试验结果确定零水平和波动区。试验设计
及结果见表 1，表 2。
405 北京中医药大学学报 第 39 卷
表 1 响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels in response surface
experimental design
水平
Levels
乙醇体积分数(X1)
Ethanol volume
fraction(%)
液料比(X2)
Liquid to material
ratio(mL/g)
超声时间(X3)
Sonication
time(min)
－ 1 60 20 20
0 70 30 30
1 80 40 40
2． 4 响应面法优化结果与数据分析
2． 4． 1 模型建立及显著性分析
将试验数据用响应面分析软件 Design-Expert
8． 0． 6． 1 进行多元回归分析，得回归方程为:
Y = 20． 22 － 1． 21X1 + 0． 073X2 － 0． 16X3 +
0. 22X1X2 + 0． 34X1X3 + 0． 24X2X3 － 1． 76X1
2 －
0. 028X2
2 + 0． 18X3
2。结果见表 3。
由表 3 的方差分析结果可知，回归方程模型 F
值为 17． 25，P = 0． 000 6 ＜ 0． 01，差异显著，有统计学
意义，失拟项 P = 0． 358 9 ＞ 0． 1，差异不显著，无统
计学意义，且模型的相关系数 r = 0． 956 8，说明该模
型能够解释 95． 68%的响应值变化。因此，该模型
拟合效果较好，可用此模型来分析和预测超声波提
取肋柱花中总黄酮的工艺条件。在总的作用因素
中，一次项乙醇体积分数(X1)差异高度显著，液料
表 2 Box-Behnken的中心组合方案及响应值
Table 2 Center combination scheme of Box-Behnken
and response values
编号
No．
X1 X2 X3
总黄酮含量
Content of total flavonoids
Y(mg /g)
1 0 0 0 20． 39
2 0 0 0 20． 26
3 － 1 1 0 19． 62
4 0 0 0 19． 62
5 － 1 0 － 1 20． 58
6 1 － 1 0 16． 79
7 0 1 1 20． 45
8 0 0 0 20． 64
9 0 0 0 20． 19
10 0 － 1 1 20． 26
11 1 0 1 17． 37
12 － 1 － 1 0 19． 49
13 0 1 － 1 20． 00
14 － 1 0 1 19． 29
15 1 1 0 17． 82
16 0 － 1 － 1 20． 77
17 1 0 － 1 17． 30
比(X2)、超声时间(X3)不显著。交互项无显著影
响。二次项 X1
2 差异高度显著，其余均不显著。由
F值大小可以判断，在所选试验范围内，3 个因素的
总黄酮含量影响排序为 X1 ＞ X3 ＞ X2。
表 3 响应面拟合回归模型的方差分析结果
Table 3 The response surface fitting regression model of variance analysis results
方差来源
Variance source
平方和
Sum of squares
自由度
Df
均方
Mean square F P
模型 Model 26． 07 9 2． 90 17． 25 0． 000 6＊＊
X1 11． 76 1 11． 76 70． 03 ＜ 0． 000 1＊＊＊
X2 0． 042 1 0． 042 0． 25 0． 632 2
X3 0． 20 1 0． 20 1． 22 0． 306 0
X1X2 0． 20 1 0． 20 1． 21 0． 308 5
X1X3 0． 46 1 0． 46 2． 75 0． 141 0
X2X3 0． 23 1 0． 23 1． 37 0． 279 8
X1
2 13． 08 113． 08 77． 87 ＜ 0． 000 1＊＊＊
X2
2 3． 184 × 10 －3 1 3． 184 × 10 －3 0． 02 0． 894 4
X3
2 0． 13 1 0． 13 0． 79 0． 403 7
残差 Ｒesidual 1． 18 7 0． 17
失拟项 Lack of fit 0． 61 3 0． 20 1． 43 0． 358 9
纯误差 Pure error 0． 57 4 0． 14
总离差 Cor total 27． 25 16
注:＊＊＊P ＜ 0． 000 1，差异高度显著;＊＊P ＜ 0． 01，差异显著。
Note:＊＊＊P ＜ 0． 000 1 highly significant difference;＊＊P ＜ 0． 01 significant difference．
2． 4． 2 各因素的交互作用及分析
根据拟合模型绘制肋柱花总黄酮的响应面图
形，从图上可以直观、形象地看出最佳参数及各参数
之间的交互作用，以此确定最佳工艺参数范围。
(1)乙醇体积分数和液料比两因素的交互作用
及分析:结果见图 4。
505第 6 期 刘婷等 响应面法优化蒙药肋柱花总黄酮超声提取工艺
图 4 乙醇体积分数和液料比的等高线(a)及
响应面(b)图
Fig． 4 Contour plot (a)and response surface
plot (b)of ethanol volume fraction and liquid to
material ratio interaction
图 4(超声时间固定)表明，乙醇体积分数不变
时，总黄酮含量随着液料比的增加几乎不变;液料比
不变时，总黄酮含量随着乙醇体积分数的增加呈上
升趋势，到达一定程度后，随着数值的增加反而下
降。当乙醇体积分数在 60% ～ 70%时，总黄酮含量
最高且几乎不变，根据相似相溶原理可知，肋柱花总
黄酮极性与此范围乙醇溶液的极性相当。
(2)乙醇体积分数和超声时间两因素的交互作
用及分析:结果见图 5。
图 5(液料比固定)表明，乙醇体积分数不变时，
总黄酮含量随着超声时间的增加而有减小的趋势，
响应值变化较小;当超声时间不变时，总黄酮含量随
着乙醇体积分数的增加而增加，到达一定程度后，随
着乙醇体积分数的增加反而下降。当乙醇浓度在
60% ～70% 时，总黄酮含量最高且几乎不变。
(3)液料比和超声时间两因素的交互作用及分
析:结果见图 6。
图 5 乙醇体积分数和超声时间的等高线(a)及响应面(b)图
Fig． 5 Contour plot (a)and response surface
plot (b)of ethanol volume fraction and
sonication time interaction
图 6(乙醇体积分数固定)表明，液料比不变时，
总黄酮含量随着超声时间的增加而减少，且减小的
趋势较为平缓;超声时间不变时，总黄酮含量随着液
料比的增加而增加，响应值变化较小，表现为曲面较
为平坦。三者的交互作用与回归方差分析结果
一致。
2． 4． 3 肋柱花总黄酮提取工艺
通过软件预测，超声提取肋柱花总黄酮的最佳
提取参数条件为:乙醇体积分数为 64． 96%，液料比
为 20 mL /g，超声时间为 20 min。考虑到实际操作
的可行性，将肋柱花总黄酮的提取工艺修正为:乙醇
体积分数为 65%，液料比为 20 mL /g，超声时间为
20 min。
2． 4． 4 验证性试验
为检验响应面法的可靠性及稳定性，精密称取
3 份药材样品按上述修正的最佳提取工艺进行验证
试验，操作方法同前述。结果供试液的总黄酮含量
分别为 21． 48、21． 22、21． 09 mg /g ，ＲSD =0． 93% (n
605 北京中医药大学学报 第 39 卷
图 6 液料比和超声时间的等高线(a)及响应面(b)图
Fig． 6 Contour plot (a)and response surface
plot (b)of liquid to material ratio and sonication
time interaction
= 3)，平均值为 21． 26 mg /g。与理论预测值 21． 15
mg /g基本吻合。
3 结论
目前国内药用植物总黄酮提取工艺优化的相关
报道［11，15 － 16］多采用正交设计法。与正交试验相比，
响应面法的优势在于在试验条件寻优过程中，可以
连续对试验的各个水平进行分析，而正交试验只能
对一个个孤立的试验点进行分析，且未能给出直观
的图形，预测结果的准确性较差。
本试验结合单因素试验和响应面法对超声提取
肋柱花总黄酮的工艺条件进行优化，获得最佳提取
工艺条件。优选的提取工艺稳定可行，其参数条件
对今后合理开发利用肋柱花具有一定的指导意义。
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