全 文 ：中国肿瘤 !! 年第 # 卷第 $期 !#$%&’() *++(’# ,+ -./ 0’12( *3#)1’# 4)(51)(6 +),7
4,5.2.8 9116(8:8
!#$%&%’()* %&+,-./) 01,-&.12 +34 !%’516+7281,2 9: !133 ;&939-< +,= >1,12&?@’A?B993 9: ;+@&? /1=&?+3 A?&1,?1@’01C&,- D,&E17@&2< 1+32B A?&1,?1 F1,217.;1&G&,- ())*+,FB&,+H&’;&,IB9J /1=&?+3 F9331-1’;&,IB9J &$$-)+,FB&,+ 加杨芽鳞提取物的抗肿瘤作用研究 陈 希 !赵 翔 !马 朋 &!张 页 !’ 北京大学基础医学院细胞生物与遗传学系北京 )))*+# &’ 山东省滨州医学院山东滨州 &$--)+$摘 要!目的#建立杨树芽鳞提取物$./0%的制备方法&研究其抗肿瘤活性并探讨其作用机制’
方法#采集加杨芽鳞&提取醇溶性成分 ./0’以顺铂为阳性对照&通过酸性磷酸酶法检测 ./0 对
体外培养肿瘤细胞的抑制作用&并进行腹腔接种腹水型肝癌 122 细胞的荷瘤小鼠抗癌实验’ 在
光镜与电镜下观察癌细胞的形态学改变’ 以流式细胞仪和荧光显微镜分析细胞凋亡状况’ 结
果# ./0 对肿瘤细胞系 /03#4!(&(560(657#1!-)(8%*) 的增殖均有明显抑制作用&75$)分别为 *(-(! 和 %2!9:;<&最小有效剂量分别为 )’!()’$()’* 和 %’)!9:;<’ 与顺铂不同的是&./0 对人正
常肝细胞 3)2 未见明显抑制作用’体内实验显示 ./0 可延长荷瘤小鼠的生存期’在 ./0 作用下
癌细胞出现明显形态学变化&包括分裂相细胞减少(细胞表面微绒毛样突起明显增多(细胞连接
消失(胞质内积累大量囊泡等’ 细胞凋亡率未发生明显变化’ 结论# ./0 对多种肿瘤细胞有显
著抑制和杀伤作用’ 其作用机理可能与改变膜限区室结构(影响细胞表面分子表达(影响微丝系
统有关&而非与凋亡途径活化有关’
关键词#加杨)植物提取物)肿瘤
中图分类号#=4+#+ 文献标识码#> 文章编号#%))!?)2!2@&((!A)$B)+)!B)$
;<8#)1%#=!#$%&’#CD EFGHIGJRHPREO HRGJWJGJEF HPL ;ERKHPJF;FX()*+,-&#/QL FRHGOHRGEL YJGK EGKHPD< GD DIGHJP ./0’ZHOJDQF RQDM RE<< NOD>PGJRHPREO ESNEOJ;EPG YHF LDPE DP ;JRE JPDRQRKHP9EF YEOE FGQLJEL IV NDNGDFJF YHF HPH58 HPL MREPG ;JRODFRDNEX.)&/*&#./0 JPKJIJGEL NOD)X!^ )X$^ )X* HPL %X)!9:;< OEFNERGJWEGKE PDO;H< KQ;HP GEFG FKDYEL GKHG ./0 RDQFJ9PJMJRHPG ;DONKDFQOMHRE^ LJ;JPJFK DM RE<< _QPRGJDPF^ HPL HRRQ;QWHOJHGJDPF JP HNDNGDFJF OHGE YEOE DIFEOWELX0,12/&3,1# ./0 KHF JPKJIJGDOV HPL RVGDGDSJR EMMERGF DP WHOJ#
DQF RHPREO RE<< RD;NHOG;EPGF^WHOJHGJDP DM GKE ESNOEFFJDP DM RE<< FQOMHRE ;DFVFGE;X1DYEWEO^HRGJWHGJDP DM GKE HNDNGDFJF NHGKYHV JF PDG JPWD>(? @,)68!696J3J@ ?+,+=1,@&@)N收稿日期$!!%)%%)$#修回日期%2))!B)#B%‘
基金项目%国家自然科学基金面上项目&#))4)%*!$和国家自然科学基金重点项目&#)##)-‘)$
!#
中国肿瘤 !! 年第# 卷第 $期 从植物中寻找抗肿瘤药物已成为国内外重要 的研究课题! 近期调查显示植物类药在抗肿瘤药 物市场销售额中占首位%&’! 我国传统和民间植物药 应用历史长涵盖人群广大极具研发前景! 本课题 参考民间抗癌验方采集植物资源极为丰富的加杨 芽鳞制备其乙醇提取物! 研究显示提取物对多种 肿瘤细胞均有很强的抑制增殖和细胞毒作用而对 正常细胞毒性很低! 我们进而对其抗癌机理进行了 初步探讨! 本课题在国内外未见相关报道! ! 材料与方法 &(& 加杨芽鳞提取物的制备 采集春季加杨#!#$%$& ’()(*+)&,&$开花后脱落
的芽鳞#样品经北京林业大学生物与技术学院康向
阳教授鉴定$%室温干燥后称取$)*用适量蒸馏水
浸泡 $小时匀浆器匀浆过夜! 在加滤纸的布氏漏 斗上抽滤弃滤液! 残渣用 &)))+, 无水乙醇浸泡 并于$)#水浴 & 小时!过滤弃残渣!滤液经减压旋
转蒸发至浸膏状于干燥器中干燥! 所得固体杨树
芽鳞提取物 &-.-,/0 123$45/,6 6780/589:;$ 经 <=>
&铝基硅胶层析板 ?@,@5/ A6,BC DE$!F60G$ 检测后
用于实验%
&(H 细胞培养与体外抗肿瘤实验
人肝癌细胞 :;=$I!CH’人鼻咽癌细胞 >J;’人 大细胞肺癌细胞 J>K$L!BC’小鼠肉瘤细胞 ?&MC’人
正常肝细胞 =CH均由本实验室保存!细胞培养于含
&CN小牛血清的 O9FK$&B!C 培养基中 &A@15.$
PI#$N>QH培养常规传代! 细 胞 按 & %&CPR孔 的 密 度 接 种 于 SB 孔 板 &J2T5$培养 E!小时后分组加入以下待测溶液(实
验组加入先以无水乙醇溶解’再经 I$N乙醇与无菌 水分级稀释的 9:;使最终作用浓度为 C(PE!*R+,& PE!*R+,)阴性对照组加入经同样稀释的溶剂其中 含 C(CPN&PN乙醇) 阳性对照组加入终浓度为 &!*R +,&!!*R+,的顺铂%作用 BC小时后用酸性磷酸酶法 &/5@3 -U.4-U/8/46 /44/VW X9X$ %E’经 ;=P&& 酶联免疫
检测仪测定细胞相对数目% 计算细胞增殖抑制率’
半数抑制浓度 K>$)和最小有效剂量% 绘制细胞生长 曲线时细胞接种密度为$%&)PY+,其中 9:; 作用
浓度为 &B!*Y+,顺铂作用浓度为 &!*Y+,阴性对照
为 &Z$N无水乙醇 加药后每 H! 小时用 X9X 法测 定% 实验中每组每个浓度设 # 个平行孔结果用平 均值表示% &Z# 急性毒性实验和体内抑瘤实验 实验动物(:X=:R5 小鼠 雄性B[M 周 体重 &M[HH*% 急性毒性实验为 # 只R组% 实验组腹腔注射 9:; &无水乙醇溶解后用无菌水稀释$ 倍$&+*R只 对照组注射经同样稀释的无水乙醇% 药物体内抑瘤 实验为 B 只R组 按 CZ$%&C$R只的浓度腹腔接种小鼠 腹水型肝癌细胞 LHH% 实验组每天一次腹腔注射 9:; &Z$!*R只共 &I 天% 对照组注射经同样稀释的
无水乙醇%
&Z! 细胞形态学观察
人肝癌 I!CH 细胞按 &C!R+, 接种于 H! 孔板孔
中预先放入圆形盖玻片% 加入 9:; 作用 &HC 小时
后取出盖玻片结晶紫染色于光镜&J@G.T Q-$8@-U.8$下观察并用美国 K+/*690.9,24 图像分析系统
记录图像%细胞另经 9:;作用 &HC小时并经固定’
脱水’临界点干燥’镀膜&金$等制片程序后在扫描 电镜&\;Q=$$BCC=]日本$下观察并照像%
&Z$细胞凋亡实验 第一组实验以浓度为 &B!*R+, 的 9:; 处理 I!CH 和 L!BC 细胞在不同时间点搜集细胞使用 碘化丙啶&-0.-@3@2+ @.3@369K$单染:^$=?O 流式 细胞分析仪分析细胞凋亡率每个时间点重复 P 次 并计算平均值% 第二组实验用 XTT67@T$双染&细
胞凋亡检测试剂盒宝赛公司$和流式细胞分析仪 测定 9:;作用 EC 小时后 I!CE 细胞的凋亡% 第三 组实验用丫啶橙染色经显微荧光图像分析系统检 测 9:;处理后 I!CE细胞核的形态变化% 结 果 EZ 提取物的性质 9:; 的产率为 EIN为深咖啡色固体有芳香 气味易溶于有机溶剂较难溶解于水在乙醇中的 溶解量为 MC+*Y+,%<=>使用含 EN冰乙酸的氯仿Y异 丙醇&氯仿’异丙醇_’E$为展开剂%P’展开后可见一个
橙色拖尾斑点O‘ ICN% 紫外灯下呈暗色无荧光%
EZE 提取物体外抗肿瘤活性实验
9:; 对 I!CE 细胞’>J; 细胞’J>K$L!BC 细胞’ !# 中国肿瘤 !! 年第 # 卷第$ 期
%&’(细胞和 )(*细胞的增殖抑制作用见图 &! 不同
处理方法下 +!(*细胞的增殖曲线见图 *各点数值
以 #次测试的平均值表示#! 与空白对照相比$阴性 对照乙醇溶液对细胞无明显抑制$ 仅当浓度大于
*,时稍有抑制作用! 实验表明 -./ 对多种肿瘤细
胞有明显抑制作用 $01$( 值对 +!(* 为 ’!2345$对 16/ 为 7!2345$对 610#8!7( 为 !!2345$对 %&’( 为 &*!2345! 最小有效剂量对 +!(* 为 (9!!2:45$对
16/ 为 (;$!2:45$对 610#8!7( 为 (;’!2:45$在 %&’( 为 &;(!2:45! 阳性对照顺铂与 -./ 分别对肝癌细胞 +!(<和 正常肝细胞 )(<的作用见图 =! 传统化疗药物顺铂 虽然对各种癌细胞均有很高的抑制率$但也强烈抑
制正常细胞的增殖图 =>#! 与顺铂相比$-./不仅 对肝癌细胞的增殖有显著抑制作用$而且对正常肝
细胞的毒性很低 图 =.#! 表明植物来源的抗肿瘤
成分 -./可能更容易被耐受$副作用小! *;= 提取物对荷瘤小鼠生存期的影响和毒性实验 实验组 7 只 .>).:? 小鼠$ 其中 = 只分别在接
种肿瘤细胞 *&天$*+ 天和 =( 天死亡! 对照组 7 只 .>).:? 小鼠$ 其中 $只分别在接种肿瘤细胞 &@ 天$*(天$*& 天$*+ 天和 =(天死亡! 实验组与对照
组生存曲线见图 !! 表明在肿瘤接种后的第 *& 天$对照组已有一半小鼠死亡$而给药组只有 & 只鼠死
亡! 在肿瘤接种后的第 =(天$对照组只有 &只鼠存 活$而给药组仍有一半小鼠存活! 初步显示 -./ 可
延长荷瘤小鼠的存活时间! 小鼠急性毒性实验未见
明显毒性反应!
*;! 提取物作用机理研究
*;!;& 形态学分析
结晶紫染色$光镜观察 -./ 作用 &*( 小时后的 +!(* 细胞图$#! 与对照组图 $>#相比$实验组
图 $.# 细胞的密度明显减小$ 胞质中出现大量囊
泡$在局部放大的图$1中非常明显! -./ 作用时间
超过 $天后$细胞大部分死亡$剩余细胞铺展充分$
无分裂相!
与对照组 图 7># 相比$在扫描电镜下观察 -./ 作用 &*( 小时后的 +!(* 细胞图 7.#$除可见
!#
中国肿瘤 !! 年第# 卷第 $期 表 % 在 &’( 作用下 )!*+ 和 ,!-* 细胞的凋亡率 )!*+ ,!-* %+ !. %+ !. #/$.
!/0.
0/%%
-/.0
$/$*
1/$! %/)* %$/$0 细胞系 作用时间!23 凋亡率!# 实验组 对照组 注#!$*/*$4数值以 0次实验平均值表示 !!!表 5 在 &’( 作用下 )!*5 细胞早期与晚期凋亡率!# 实验组 对照组 !/!. )/)- %%/$!
%$/$0
.0/0%
)!/15
*/-)
%/$1 组别 早期凋亡率 晚期凋亡率 存活细胞 死亡细胞 注#!$*/*$6数值以 0次实验平均值表示 细胞密度明显降低外 !图 -’ 所选视野为细胞较密 的局部放大区域$还可见到分裂相细胞减少$重叠 生长现象基本消失$细胞表面微绒毛样突起明显增
多$细胞间距加大$细胞连接减少或丧失%
5/!/5 流式细胞术和荧光显微镜检测
&7 单染测定 )!*5 和 ,!-* 细胞凋亡率的结果
见表 %% 以 899:;<9%!&&7 双染测定 )!*+ 细胞凋亡
率的结果见表 +% 结果显示各时间点均未检测到细
胞凋亡率的明显变化% 在 &’( 作用下的 )!*+ 细胞
经丫啶橙染色后$通过显微荧光图像分析显示$细胞
数目较对照组明显减少$但未观察到胞核破碎&出泡 以及凋亡小体出现等凋亡特征性的形态学改变% !# 中国肿瘤 !! 年第 # 卷第$ 期
! 讨 论
本文报道了一种从加杨芽鳞中提取抗肿瘤有
效成分的方法! 体内外抗瘤实验显示提取物对多种
肿瘤细胞具有明显的抑制作用而对正常细胞的抑
制作用很弱亦即其细胞毒作用的选择性明显优于
顺铂!
国内外大量研究提示多种天然产物可引起细
胞凋亡 %!#&’如影响 ($)#*+,$- 基因表达 %.’改变线粒
体通透性等%&’但亦有抑制细胞凋亡的报道%!’! 我们
探讨了 /01 的抗癌活性是否与促进癌细胞凋亡有
关! 在流式细胞术实验中采用了 /2单染分析凋亡
率以及 /2和 3445674$!双染分析早期与晚期凋亡 率两种方法! 3445674$!是一种钙依赖性磷脂结合
蛋白能与细胞凋亡过程中翻转到质膜外片的磷脂
酰丝氨酸特异性结合! /2 是一种核酸染料! /2 和
3445674$!双染可以将凋亡早期# 凋亡晚期以及死 细胞区分开! 两种方法的统计结果表明实验组与对 照组之间的凋亡率无显著性差异! 丫啶橙亦为一种 核酸染料染色后经显微荧光图像分析进一步证明 /01的抗癌机理与凋亡途径活化无关! 目前已知一些植物抗肿瘤有效成分可通过凋 亡以外的其它途径起作用例如黄连提取物可通 过细胞周期调节激酶起作用 %8’#灵芝多糖则通过体 内免疫途径起作用%9’! 根据形态学分析推测/01有 可能通过干扰癌细胞中膜限区室$:5:*;<45$*=>4? +=:(<;@:54@A%的转运途径#干扰内质网和高尔基体 等细胞器的糖链加工和质量控制体系#破坏糖链参 与的细胞内环境稳定#改变细胞连接和细胞表面特 化结构的分布# 改变细胞外被上的糖链表达等途 径对癌细胞产生选择性杀伤效应! 经 /01 处理的 癌细胞另一个显著特征是出现了大量微绒毛样突 起提示微丝系统发生了特异性改变! 深入研究有 关机制将可望发现新的抗肿瘤作用靶点! 以上研究表明加杨芽鳞有效成分具有研发新 型植物类抗肿瘤药的前景! 有关活性成分的分离鉴 定和进一步的机理研究等工作正在进行中! 致谢! 加杨芽鳞的采集得到张鼎扉的协助在 此感谢# 参考文献! 王佩 B 李玉珍齐有利C 植物类抗肿瘤药成为市场主导 %D’E 首都医药B -FF)B GFH$IJ ))K)!E
陈学清B 杨晓鸥B 潘国宗等E酸性磷酸酶法在体外化疗
药物筛选中的应用%D’E 癌症998&H.LJ !&&K!&8C
何丽一C 平面色谱方法及应用%M’C 北京&化学工业出版
社G999C 9$K9&C 李晓波季莉莉王钊C 中药对细胞凋亡影响的研究进展 %D’C 中药材N -FF-N -$O-LJ G)$KG)9E 程若川 汤礼贵 兰丽琴 E 槐耳清膏诱导人直肠癌 PQ8)!8 细胞凋亡的实验研究 %D’E 中国肿瘤 -FF)N G- H-LJ G--KG-!E R=;;75 DN S<(<,< TN U>474= SDE V<;4=A=,$74?>+5? <(=(@=A7A
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林志彬E灵芝抗肿瘤活性和免疫调节作用的研究进展%D’E
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