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China Pharmaceuticals
2013年 12月 20日 第 22卷第 24期
Vol． 22，No． 24，December 20，2013
石荠 提取物对流感病毒感染小鼠氧自由基损伤的保护作用＊
臧家娜 1，邓丽丽 1，余陈欢 2，方 杰 1，应华忠 2，吴晓宁 3
(1． 浙江中医药大学，浙江 杭州 310053; 2． 浙江省医学科学院，浙江 杭州 310000; 3． 浙江医学高等专
科学校，浙江 杭州 310053)
摘要:目的 观察石荠 提取物对流感病毒感染小鼠氧自由基损伤的预防作用。方法 建立小鼠流感病毒性肺炎的生物模型，用不同剂
量石荠 提取物灌胃给药，检测小鼠肺指数、肺组织病毒载量并观察其病理形态变化，测定肺组织匀浆丙二醛(MDA)含量及超氧化物
歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH － Px)、总一氧化氮合酶(NOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性。结果 石荠 提取物能明
显降低感染小鼠肺指数和病毒载量，减轻肺组织病变程度及过氧化水平。结论 石荠 提取物可通过抑制流感病毒性肺炎小鼠脂质过
氧化水平及氧自由基损伤而发挥保护作用。
关键词:石荠 ;氧自由基损伤;脂质过氧化
中图分类号:Ｒ285． 5;Ｒ282． 71 文献标识码:A 文章编号:1006 － 4931 (2013 )24 － 0024 － 03
Preventive Effects of Mosla Scabrous Extracts against Influenza Virus Induced Oxygen Free
Ｒadical Injury in Mice
Zang Jiana1，Deng Lili1，Yu Chenhuan2，Fang Jie1，Ying Huazhong2，Wu Xiaoning3
(1． Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou，Zhejiang，China 310053; 2． Zhejiang Provincial Academy of Medical Sciences，Hangzhou，Zhejiang，
China 310000; 3． Zhejiang Provincial Medical College，Hangzhou，Zhejiang，China 310053)
Abstract:Objective To observe the preventive effects of Mosla Scabra extracts (MSE)on the oxygen free radical injury in influenza
virus infected mice． Methods The mice biological model of influenza viral pneumonia was established． The different doses of MSE were
given by gavage administration． The lung index and pulmonary tissue viral load were detected． The pathological morphological changes
were observed． The malondialdehyde(MDA) level in the pulmonary tissue homogenate and activities of superoxide dismutase(SOD)，glu-
tathione peroxidase(GSH － Px)，nitric oxide synthase(NOS) and induced nitric oxide synthase(iNOS) were determined． Ｒesults MSE
could significantly reduce the lung index and pulmonary viral load in the infected mice，alleviated the lung tissue lesion severity and
peroxide level． Conclusion MSE can play the protective role by inhibiting the lipid peroxidation level and the oxygen free radical in-
jury in influenza virus infected mice．
Key words:Mosla Scabrous;oxygen free radical injury;lipid peroxidation
流行性感冒(简称流感)是由流感病毒感染引起的常见的呼
吸道急性传染病。临床常用的西药仅通过抑制病毒表面受体而发
挥疗效，极易产生耐药性和不良反应 [ 1 ]。中药为中华民族瑰宝，在
防治流感病毒方面具有独特的优势。石荠 (M． scabra)为江浙地
区常用中草药，省地方标准收录药材，在我国分布广阔，具有清热
解毒、理气化痰的功效，主治流行时疫、痰湿内蕴、疮毒和慢性支
气管炎等症。项目组前期研究表明，石荠 提取物(MSE)可显著
改善流感病毒小鼠病理状态，延长其存活时间，提高机体免疫
水平 [ 1 － 2 ]。此外其还具有抗炎 [ 3 ]、抗氧化 [ 4 ]等多种药理作用，但其
抗流感病毒的具体机制尚不清楚。因此，本试验以氧自由基损伤
为切入点，探讨 MSE改善流感病毒性肺炎的机制。
1 材料与方法
1． 1 仪器、试药与动物
DYQ － 838 型高速微型粉碎机(浙江瑞安永历制药机械有限
公司);TU － 1900 型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用
仪器有限责任公司);DC300 型莱卡图像处理显微镜(德国莱卡公
司)。石荠 药材采于 2009 年 8 月浙江浦江，经本校俞冰副教授
鉴定为石荠 (Mosla scabra Thunb．)的干燥全草，阴干、粉碎、过
40 目筛，备用;利巴韦林泡腾片(浙江艾康礼德制药有限公司，批
号为 091210)。甲型流感病毒小鼠肺适应株 A / PＲ / 8 /34，由浙江
省疾病预防控制中心病毒所提供。病毒效价为 1 ∶ 512。清洁级
ICＲ小鼠，雌雄各半，体重 18 ～ 22 g，由中国科学院上海实验动物
中心提供，实验动物许可证号:SCXK(沪)2010 － 0014;10 日龄
SPF 鸡胚，由浙江省农业科学院提供。本试验在浙江省医学科学
院 ABSL2 生物安全实验室进行。
1． 2 方法
石荠 提取物的制备: 称取石荠 干燥粗粉 500 g，加药材
20 倍量的 70%乙醇，于 90 ℃水浴回流提取 3 次，每次 1． 9 h，提
取液减压浓缩至含醇量 10%左右抽滤，以除去树脂、叶绿素等杂
质 [ 5 ]，继续回收溶剂至无乙醇味，乙酸乙酯萃取，减压干燥、粉碎，
得棕黄色浸膏粉末，作为供试样品(MSE)。临用前以无菌生理盐
水溶解干浸膏粉末，配制成所需试验药物浓度。
分组及给药:取清洁级ICＲ小鼠，雌雄各半，按体重随机分为
6 组: 正常对照组、病毒模型组、利巴韦林给药组(75 mg / kg)和
MSE 高剂量给药组(752 mg / kg)、中剂量给药组(376 mg / kg)，低
剂量给药组(188 mg / kg)，每组 10 只。各组于攻毒前预先灌胃给
药 3 d，每次给予 0． 2 mL /10 g，于第 3 天给药 2 h后在乙醚轻度麻
醉下以 10倍半数致死是(LD50)病毒量滴鼻感染小鼠，每只 25 μL。
连续给药至第 8 天试验结束。称重，处死，迅速取肺组织称重，
计算肺指数及肺指数抑制率，观察肺脏形态，测定肺组织病毒
载量 [ 6 － 7 ]，并检测肺组织匀浆液中丙二醛(MDA)含量及超氧化
物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH － Px)、一氧化氮合
＊国家自然科学基金，项目编号:81202977;浙江省自然科学基金，项目编号:LQ12H28007，LY13H280002。
·药物研究·
Drug Ｒesearch
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China Pharmaceuticals
2013年 12月 20日 第 22卷第 24期
Vol． 22，No． 24，December 20，2013
组别
正常对照组
病毒模型组
利巴韦林给药组
MSE低剂量组
MSE中剂量组
MSE高剂量组
剂量(mg / kg)
－
－
75
188
376
752
MDA含量(nmol /mg prot)
0． 096 ± 0． 015＊＊
0． 163 ± 0． 030
0． 152 ± 0． 015
0． 110 ± 0． 024＊＊
0． 099 ± 0． 017＊＊
0． 102 ± 0． 025＊＊
NOS活性(U / mg prot)
0． 407 ± 0． 059＊＊
0． 612 ± 0． 050
0． 473 ± 0． 041＊＊
0． 459 ± 0． 039＊＊
0． 422 ± 0． 062＊＊
0． 417 ± 0． 066＊＊
iNOS活性(U /mg prot)
0． 127 ± 0． 024＊＊
0． 231 ± 0． 034
0． 170 ± 0． 030＊＊
0． 216 ± 0． 030
0． 194 ± 0． 035＊
0． 157 ± 0． 025＊＊
SOD活性(U /mg prot)
6． 17 ± 0． 54＊＊
2． 36 ± 0． 21
3． 23 ± 0． 52＊＊
2． 33 ± 0． 45
2． 91 ± 0． 24＊＊
3． 63 ± 0． 49＊＊
GSH － Px活性(103U /mg prot)
1． 84 ± 0． 35＊＊
1． 18 ± 0． 12
1． 52 ± 0． 13＊＊
1． 59 ± 0． 27＊＊
1． 73 ± 0． 13＊＊
2． 12 ± 0． 11＊＊
表 2 MSE对感染小鼠肺组织 MDA，NOS，INOS，SOD，GSH － PX含量或活性的影响(X ± s，n = 10)
3 讨论
现代医学研究表明，病毒在肺组织内复制的过程中，炎症细胞
大量趋化、聚集和激活，并释放过量的炎症介质及氧自由基等，导致
组织损伤。研究发现，通过抗氧化剂治疗，可减少流感病毒感染小鼠
的肺损伤和死亡 [8 － 9 ]。因此，本试验以氧自由基损伤为切入点，通过
建立急性感染小鼠模型，探讨 MSE改善流感病毒性肺炎的机制。
正常情况下，机体内有一套清除自由基的酶系(超氧化物歧化
酶 SOD和谷胱甘肽过氧化物酶 GSH － Px)，机体的氧化和抗氧化系
统存在动态平衡，生理条件下体内自由基处于低浓度动态平衡。当
机体受到损伤，或因某种因素体内自由基产生过多或清除能力降低
时，体内活性氧自由基增多，体内脂质过氧化反应加剧。另外，MDA
作为脂质过氧化的重要降解产物，可用于评价机体脂质过氧化损伤
的程度 [10 ]。NOS主要有结构型一氧化氮合酶(cNOS)和诱导型一氧
化氮合酶(iNOS)2种亚型，iNOS主要由被激活的胶质细胞、中性粒
细胞和巨噬细胞释放产生，一般在炎症中后期大量生成且持续较长
时间，是炎症中后期脑损伤加重的重要因素 [11 ]。
黄酮类化合物具有多酚结构，通过夺氢反应生成自由基中间
体而阻断或终止自由基连锁反应链，从而阻止或抑制氧自由基反
应和脂质过氧化反应，抑制脂质过氧化物及其代谢产物丙二醛
MDA和共轭二烯等毒性物质的生成。同时，黄酮类化合物还可调
节和提高体内抗氧化酶活性 [ 2 ]。
本试验结果表明，流感病毒感染后，病毒模型组小鼠肺组织
中 MDA含量、NOS活性及 iNOS活性明显增加，SOD，GSH － Px和
T － AOC 活性明显下降，提示病毒感染肺组织存在明显的脂质
过氧化损伤及抗氧自由基损伤的能力下降。经 MSE 给药干预
后，小鼠肺组织中 SOD，GSH － Px 和 T － AOC 等活力增加，
MDA 含量明显减少，NOS 及 iNOS 活性明显降低，提示流感感
染小鼠肺组织脂质过氧化损伤明显减轻，抗氧自由基损伤能
力明显增强。
综上所述，MSE能够有效减轻流感病毒引发的肺组织脂质过
氧化损伤，提高机体的总抗氧化能力和抑制炎症反应，这可能是
其减轻流感病毒性肺炎病理损伤的作用机制之一。
作者简介:臧家娜(1987 －)，女，山东日照人，硕士研究生在
读，研究方向 为抗病毒抗炎药理 学研究，(电子 信箱)
abc1986abc@ 126． com; 应华忠(1963 －)，男，浙江兰溪人，硕士研
究生导师，硕士研究生，研究方向为中药药理学研究，本文通讯作
者，(电子信箱)yhz0101@ 126． com。
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表 1 MSE对流感感染小鼠肺指数及病毒载量的影响(n = 10，X ± s)
组别
正常对照组
病毒模型组
利巴韦林给药组
MSE低剂量组
MSE中剂量组
MSE高剂量组
剂量
(mg / kg)
－
－
75
188
376
752
肺指数
(mg / g)
7． 35 ± 0． 68＊＊
19． 26 ± 4． 67
15． 12 ± 3． 60＊
15． 03 ± 4． 76＊＊
14． 80 ± 4． 45＊＊
11． 90 ± 2． 80＊＊
肺指数抑
制率(%)
－
－
21． 50
21． 96
23． 16
38． 21
血凝滴度
(lnX)
－
5． 55 ± 0． 73
2． 29 ± 0． 93＊＊
2． 91 ± 1． 34＊＊
2． 84 ± 1． 44＊＊
2． 50 ± 1． 19＊＊
病毒抑制
率(%)
－
－
58． 76
47． 52
48． 78
54． 91
注:血凝滴度值越大，表明肺组织中病毒载量越大，小鼠流感感染程
度越严重;与病毒模型组相比，＊ P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01，下表同。
酶(NOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性。
1． 3 统计学处理
采用 SPSS 17． 0 统计软件，数据以均数 ±标准差(X ± s)表
示，以 P ＜ 0． 05为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 化学成分定性检查结果
通过碱性铝盐比色法测定了 MSE 中总黄酮的含量 [1 ]，结果
MSE中总黄酮以芦丁计，其平均含量为 83． 3%。
2． 2 MSE对流感感染小鼠肺指数及病毒载量的影响
结果见表 1。可见，病毒模型组肺指数最大，与正常对照组比
较，具有显著性差异(P ＜ 0． 01)，MSE 高、中、低各剂量给药组均
可明显降低感染小鼠的肺指数，提高肺指数抑制率，减轻小鼠流
感病毒所致肺炎的病变程度，并呈剂量依赖性;同时，MSE高、中、
低各剂量给药组肺组织中流感病毒载量明显降低，其中 MSE 高
剂量给药组肺组织中流感病毒载量降低最显著，与病毒模型组比
较，具有显著性差异(P ＜ 0． 01)。
2． 3 MSE对感染小鼠肺组织 MDA，SOD，GSH －Px，NOS和
iNOS含量或活性的影响
结果见表 2。可见，病毒模型组感染小鼠肺组织中 MDA含量、
NOS及 iNOS活性明显升高，SOD和 GSH － Px活性明显降低，与正
常对照组比较，具有显著性差异(P ＜0． 01);MSE各剂量给药组肺组
织中各指标含量及活性均有不同程度的改善，且呈剂量依赖性。
·药物研究·
Drug Ｒesearch
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China Pharmaceuticals
2013年 12月 20日 第 22卷第 24期
Vol． 22，No． 24，December 20，2013
Virusol，2012，57(6):30 － 36．
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中药材，2010，10(33):1 609 － 1 611．
(收稿日期:2013 － 08 － 16 )
＊河北省自然基金项目，项目编号:C2011206186。
檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨
高效液相色谱法测定大鼠血浆中咪达唑仑含量＊
刘宏达 1，张志清 2，任静华 1，何文娟 2
(1． 河北省沧州市人民医院，河北 沧州 061000; 2． 河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000)
摘要:目的 建立检测大鼠血浆中咪达唑仑质量浓度的高效液相色谱法。方法 取大鼠 20只，一次性给予尾静脉注射咪达唑仑 10 mg / kg，
分别于给药后 0 min，5 min，10 min，20 min，30 min，1 h，1． 5 h，2 h，4 h，6 h 时眼内眦取血，采用高效液相色谱法检测其血药浓度。采用
Diamonsil C18 柱(250 mm × 4． 6 mm，5 μm)，流动相为乙腈 －水(62 ∶ 38)，流速 1． 0 mL /min，检测波长 225 nm，柱温 30 ℃，进样量 20 μL。
结果 咪达唑仑的保留时间为 6． 7 min，回归方程为 Y = 0． 075 2 X － 0． 004 2(r = 0． 999 9，n = 7)，检测质量浓度的线性范围为 0． 1 ～
30 mg / L。低、中、高 3 种质量浓度血浆样品的绝对回收率分别为(109． 8 ± 4． 54)%，(101． 6 ± 3． 28)%和(104． 9 ± 4． 30)%;日内ＲSD分
别为 2． 86%，4． 38%，3． 54%，日间 ＲSD分别为 3． 25%，3． 17%，3． 14%;咪达唑仑血浆样品－ 40 ℃保存 3 d及反复冻融 3 次，性质稳
定，血浆样品处理后放置 4 h对测定无影响。20 只大鼠血浆样品中咪达唑仑的平均质量浓度为(8． 78 ± 2． 18)mg / L。结论 该方法简便、
准确、灵敏度高、重现性好，可用于大鼠血浆中咪达唑仑浓度的测定。
关键词:高效液相色谱法;咪达唑仑;血药浓度;大鼠
中图分类号:Ｒ969． 1;Ｒ965;Ｒ971 + ． 3 文献标识码:A 文章编号:1006 － 4931 (2013 )24 － 0026 － 02
Determination of Midazolam Concentration in Plasma of Ｒats by HPLC
Liu Hongda1，Zhang Zhiqing2，Ｒen Jinghua1，He Wenjuan2
( 1． Cangzhou Municipal People  s Hospital，Cangzhou，Hebei，China 061000; 2． Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei，
China 050000)
Abstract:Objective To establish a HPLC method for detecting plasma midazolam concentration in rats． Methods 20 rats were taken
and injected midazolam once at a dose of 10 mg / kg by tail intravenous． All of the rats were taken blood by intraocular canthus re-
spectively at 0，5，10，20，30 min，1，1． 5，2，4，6 h after drug administration． Then the high performance liquid chromatography (HPLC)
method was adopted to detect the blood concentration． The chromatographic conditions:Diamonsil C18 chromatographic column(250 nm ×
4． 6nm，5． 0 μm)，the temperature:30℃，the mobile phase:acetonitrile － water(62 ∶ 38)，the flow rate:1． 0 mL /min，the determination
wavelength:225 nm and the injected sample size:20 μL． Ｒesults The retention time of midazolam was 6． 7 min，the linear range was
0． 1 － 30 μg /mL，the regression equation:Y = 0． 075 2 X － 0． 004 2(r = 0． 999 9)． The absolute recovery rates of midazolam plasma sam-
ples at low，middle and high concentrations were (109． 8 ± 4． 54)%，(101． 6 ± 3． 28)% and (104． 9 ± 4． 30)%，respectively;ＲSD of in-
tra － day precision were 2． 86%，4． 38% and 3． 54% and that of the inter － day precision were 3． 25%，3． 17% and 3． 14% respectiv-
ely． The plasma samples of midazolam were stable after storage at － 40℃ for 3 d and repeated freeze thaw for 3 times，and the pro-
cessed samples were stable within 4h． The average midazolam concentration in plasma samples of 20 rats was (8． 78 ± 2． 18)mg / L．
Conclusion This method is simple and accurate with good reproducibility，and can be applied to the determination of midazolam con-
centration in rat plasma．
Key words:HPLC;midazolam;blood concentration;rats
咪达唑仑又称速眠安，属苯二氮 类镇静催眠药。咪达唑仑
为亲脂性物质，能直接抑制脑干网状结构上行激活系统，具有强
大的镇静催眠作用，临床广泛用于抑郁症、焦虑等疾病。其在 pH ＜4
的酸性溶液中形成稳定的水溶性盐，临床制剂为盐酸盐或马来酸
盐。咪达唑仑主要在肝脏经肝微粒体酶 CYP3A4 氧化，因此经常
将此药作为探针药物 [ 1 － 2 ]研究其药代动力学变化。目前已报道的
咪达唑仑血药浓度测定方法，流动相制备复杂，血浆样品处理操
作烦琐、成本高。本研究中建立了检测大鼠血浆中咪达唑仑质量
浓度的高效液相色谱法，方法简便、准确、灵敏度高，可为咪达唑
仑大鼠体内的药动学研究提供方法学参考。
1 仪器、试药与动物
高效液相色谱系统，包括 515 泵、486 紫外检测器、Empower
Application 操作平台 (美国 Waters 公司);GL － 20G －Ⅱ型冷冻离
心机(上海安亭科学仪器厂);XW － 80A型涡旋混合器(上海医科
大学仪器厂)。咪达唑仑对照品(宜昌人福药业责任有限公司，批
号为 MD111106，含量 100． 8%);咪达唑仑注射液(江苏恩华药业
集团有限公司，批号 20110825，规格为 5 mL ∶ 5 mg); 乙腈(色谱
纯，天津市康科德科技有限公司，批号为 111203)。健康 SD大鼠，
清洁级，雄性，体重(300 ± 10)g，由山西省动物实验中心提供，动
物许可证号为 SCXK(晋)2009 － 0001。
2 方法与结果
2． 1 色谱条件
色谱柱:Diamonsil C18 柱(250 mm × 4． 6 mm，5 μm); 流动相:
乙腈 －水(62 ∶ 38，V / V); 流速:1． 0 mL /min; 检测波长:225 nm;
·药物研究·
Drug Ｒesearch