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越南凉粉草无菌芽增殖生长的影响因子



全 文 :收稿日期:2013-02-17
基金项目:广西梧州市科学研究与技术开发计划项目(200901024)
作者简介:韦鹏霄(1956-),副研究员,主要从事植物组织培养和生物技术育种研究工作,E-mail: weipengxiao@163.com
0 引言
【研究意义】凉粉草(Mesona blumes)又名仙人
草、仙草、薪草,为唇形科凉粉草属一年生草本植物,
其性寒、甘、凉,具有清热利湿、凉血解暑的作用,是一
种重要的药用和食用植物资源(全国中草药汇编编
写组,1978)。凉粉草主要分布于热带亚热带湿润地区
(严胜柒等,2005),在我国的主产区有广西灵山、平
南、桂平和广东阳春、增城及福建武平、建瓯;国外如
印度尼西亚、越南,其产量大且成分含量较高。在我
国,凉粉草作为中草药和制作凉粉草冻原料的历史悠
越南凉粉草无菌芽增殖生长的影响因子
韦鹏霄,谭木秀,岑秀芬,覃柳兰,刘洁云,周芳芳
(广西大学农学院,南宁 530005)
摘要:【目的】探讨越南凉粉草无菌芽增殖生长的影响因子,为越南凉粉草离体快繁体系的建立提供技术参考。
【方法】从培养基配方(不同基本培养基、不同蔗糖浓度及不同细胞分裂素CPPU)和外植体材料(不同接种部位)两方
面研究其对越南凉粉草无菌芽增殖的影响。【结果】在MS、Miller与改良White 3种基本培养基中,以MS对凉粉草芽增
殖效果最好,芽增殖倍数达8.53倍;当蔗糖浓度为20.0 g/L时芽增殖倍数最高,为8.34倍,而当蔗糖浓度为25.0 g/L时
芽增殖倍数为7.05倍,芽长势最好;添加CPPU对芽的增殖效果优于6-BA和KT,芽增殖倍数达9.80倍。对于外植体茎
上部、茎中部和茎基部,以茎上部的芽增殖效果最好,芽增殖倍数达9.35倍,芽生长健壮。【结论】适宜越南凉粉草无
菌芽增殖生长的基本培养基为MS培养基,蔗糖浓度为20.0~25.0 g/L,CPPU为0.5 mg/L,适宜接种材料为茎上部。
关键词:越南凉粉草;无菌苗;芽增殖;影响因子
中图分类号:S567.239 文献标志码:A 文章编号:2095-1191(2013)06-0909-05
Study on effect factors for multiplication and growth of
aseptic buds of Vietnam Mesona blumes
WEIPeng-xiao,TANMu-xiu,CENXiu-fen,QINLiu-lan,LIUJie-yun,ZHOUFang-fang
(Agricultural College,Guangxi University,Nanning 530005,China)
Abstract:【Objective】The effect factors on multiplication and growth of the aseptic buds were studied in order to provide
technical references for rapid propagation system in vitro of Vietnam Mesona blumes. 【Method】The experiments were carried
out from two aspects of media directions (different basic media, sucrose concentration and cytokinins) and explant materials
(different inoculation positions). 【Result】Comparison of the basic media of MS, Miller and modified White displayed that MS
medium showed the best effect on bud multiplication and growth of the aseptic buds, in which bud proliferation multiple was
8.53 times. While sucrose concentration was 20.0 g/L, bud proliferation multiple peaked at 8.34 times. When sucrose concentra-
tion reached 25.0 g/L, bud proliferation multiple showed 7.05 times and bud growth was the best. The bud multiplication effect of
CPPU was better than that of 6-BA and KT, in which bud proliferation multiple reached 9.80 times. Comparing the inoculated
materials from stem upper position, the middle part of the stem and the stem base position, the bud multiplication effect of stem
upper position was the best, in which the bud proliferation multiple was 9.35 times and the bud growth exhibited the best status.
【Conclusion】It was suitable to the bud multiplication and growth of Vietnam Mesona blumes that the basic medium was MS
medium, 20.0-25.0 g/L sucrose concentration and 0.5 mg/L CPPU. The proper inoculated material was the stem upper position.
Key words: Mesona blumes; aseptic seedling; bud multiplication; effect factor
DOI:10.3969/j:issn.2095-1191.2013.6.909
南方农业学报 JOURNAL OF SOUTHERN AGRICULTURE 2013,44(6):909-913
ISSN 2095-1191;CODEN NNXAAB http://www.nfnyxb.cn
南 方 农 业 学 报
久、市场需求大,如王老吉、和其正、杨协成、晨光等饮
料主要原料即为凉粉草。目前,国内凉粉草野生资源
十分紧缺,主要从印尼、越南等国家进口。在人工栽培
上,又存在种子少且易变异、出苗成活率低等问题(王
越云等,2010)。凉粉草作为制作保健食品和功能性食
品的重要原料,以越南凉粉草为优,但越南凉粉草一
直供不应求,优良种苗十分匮乏。因此,对越南凉粉草
无菌芽增殖生长的相关因子进行优化,建立越南凉粉
草种苗快速繁育技术体系,对其生产将具有重要的现
实意义。【前人研究进展】目前,国内外有关凉粉草组
织培养的研究报道较少,特别是有关越南凉粉草离体
快繁研究尚未见报道。严胜柒等(2005)以引进的印尼
凉粉草茎尖及带腋芽的茎段为外植体,进行丛生芽诱
导增殖、生根培养及移栽试验,获得丛芽分化培养基
为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L,增殖培养基为
MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L,生根培养基为MS+
NAA 0.5 mg/L。Zhao等(2011)以凉粉草带茎节的茎段
为外植体,对影响凉粉草组培快繁过程的3种生长激
素(6-BA、ZT和NAA)进行优化试验,筛选出凉粉草在
初代诱导、继代增殖和生根培养中的部分生长激素配
比。此外,部分学者对凉粉草扦插栽培技术进行了研
究。吴庆华等(2012)将凉粉草枝条剪成长约10 cm(含
3个茎节)的插条,扦插于以沙壤土为基质的苗床上,
插条5 d后开始生根,10 d后生根插条迅速增多,15~
20 d后普遍生根成活,成活率在95.0%以上,说明凉粉
草枝条的再生能力较强,枝插繁殖生根发芽快且整
齐。【本研究切入点】目前,尚未对凉粉草无菌芽继代
增殖生长的相关影响因子进行系统研究。为此,本研
究以越南凉粉草为试验材料,从不同基本培养基、不
同蔗糖浓度、不同细胞分裂素和不同部位接种材料等
方面,探讨凉粉草无菌芽继代增殖生长的相关影响因
子。【拟解决的关键问题】通过对越南凉粉草无菌芽继
代增殖生长的相关因子进行比较试验,筛选出适宜无
菌芽继代增殖生长的基本培养基、蔗糖浓度、细胞分
裂素和外植体材料,为越南凉粉草离体快繁体系的建
立奠定基础。
1 材料与方法
1. 1试验材料
供试越南凉粉草组培无菌苗由广西大学植物组
织培养中心提供。
1. 2试验方法
在超净工作台上将生长健壮的凉粉草组培无菌
苗(苗龄35 d)剪切成长1.0~1.5 cm带芽茎段,转接到
配制的不同处理培养基。每处理设3次重复,每重复接
种10瓶,每瓶接种5个带芽茎段,置于培养室培养架上
培养,30 d后观察记录芽生长状况及增殖倍数。培养
条件:温度(25±1)℃,光照12 h/d,光照强度1600 lx。
(1)不同基本培养基比较试验:以MS、Miller和改
良White为基本培养基,附加6-BA 0.5 mg/L+NAA
0.05 mg/L+蔗糖25.0 g/L+琼脂6.0 g/L。
(2)不同蔗糖浓度比较试验:以MS+6-BA 0.5
mg/L+NAA 0.05 mg/L+琼脂6.0 g/L为继代培养基,分
别添加蔗糖0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0 g/L。
(3)不同细胞分裂素比较试验:以MS+NAA 0.05
mg/L+蔗糖25.0 g/L+琼脂6.0 g/L为继代培养基,分别
添加6-BA 0.5 mg/L、KT 0.5 mg/L和CPPU 0.5 mg/L,
设不添加任何细胞分裂素培养基为对照(CK)。
(4)不同接种部位比较试验:以MS+6-BA 0.5
mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖25.0 g/L+琼脂6.0 g/L为继
代培养基,将无菌苗分别剪取长1.0~1.5 cm带芽的茎
顶部、茎中部和茎基部进行接种。
1. 3统计方法
试验数据采用DPS 6.55统计软件进行统计分析,
以Duncan’s法进行多重比较分析。
2 结果与分析
2. 1不同基本培养基对越南凉粉草芽增殖生长的影响
从表1可知,不同基本培养基对越南凉粉草芽增
殖生长的效果不同。3种不同培养基中,以MS培养基
的效果最好,芽平均增殖倍数达8.53倍,芽生长状况表
现最佳;其次为Miller培养基,芽平均增殖倍数为5.77
倍;最差为改良White培养基,芽平均增殖倍数仅为
2.53倍,且芽生长状况较差。3种基本培养基间芽增殖
倍数差异达极显著水平,因此MS培养基适宜作为越
南凉粉草芽增殖生长的基本培养基。
2. 2不同蔗糖浓度对越南凉粉草芽增殖生长的影响
由表2可知,不同蔗糖浓度对越南凉粉草芽增殖
的效果不同。在蔗糖为0~35.0 g/L范围内,随着蔗糖浓
度的逐渐升高,凉粉草芽增殖倍数呈低—高—低变化
趋势;当蔗糖浓度为20.0 g/L时,芽增殖倍数最高,达
8.34倍;随着蔗糖浓度的继续升高,芽增殖倍数则逐渐
下降,说明当蔗糖浓度高于20.0 g/L时对凉粉草芽增
殖有抑制作用;但芽生长状况以蔗糖浓度为25.0 g/L
时最佳。8种蔗糖浓度处理间的芽增殖倍数差异均达
极显著水平。因此,当培养基中蔗糖浓度为20.0 g/L时
有利于越南凉粉草芽增殖,而蔗糖浓度为25.0 g/L时
适宜芽生长。
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韦鹏霄等:越南凉粉草无菌芽增殖生长的影响因子
表 1 不同基本培养基对越南凉粉草芽增殖生长的效果
Tab.1 Effects of different basic media on multiplication and growth of Vietnam Mesona blumes bud
基本培养基
Basic medium
MS
Miller
改良White
重复Ⅰ RepeatⅠ
8.47
5.72
2.54
重复Ⅱ RepeatⅡ
8.53
5.75
2.50
重复Ⅲ RepeatⅢ
8.59
5.84
2.55
平均 Average
8.53aA
5.77bB
2.53cC
生长状况 Growth status
正常,小苗多,叶片较大,叶色淡绿
正常,小苗多,叶片小,叶色淡绿
苗少,叶小,顶端少量叶片透明,褐化
同列不同大、小写字母表示在1%、5%水平上的差异显著性。下同
Different capital and lowcase letters represent significant difference at 1% and 5% level,respectively. The same was applied in the following tables
表 2 不同蔗糖浓度对越南凉粉草芽增殖生长的效果
Tab.2 Effects of different sucrose concentrations on multiplication and growth of Vietnam Mesona blumes bud
蔗糖浓度(g/L)
Sucrose concentration
0(CK)
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
重复Ⅰ RepeatⅠ
1.20
2.80
4.00
6.66
8.28
7.00
5.57
4.33
重复Ⅱ RepeatⅡ
1.29
2.77
3.98
6.70
8.53
7.10
5.65
4.40
重复Ⅲ RepeatⅢ
1.26
2.85
4.06
6.80
8.40
7.05
5.60
4.30
平均 Average
1.25hH
2.81gG
4.01fF
6.72cC
8.34aA
7.05bB
5.61dD
4.34eE
生长状况 Growth status
苗弱小,黄绿色,严重玻璃化
苗弱小,黄绿色,玻璃化严重
苗稍壮,淡绿色,玻璃化较轻
苗稍壮,淡绿色,玻璃化较轻
苗稍壮,淡绿色,玻璃化更轻
苗较粗壮,绿色,长势较好
苗稍壮,淡绿色,长势好
苗稍壮,淡绿色,长势好
2. 3不同细胞分裂素对越南凉粉草芽增殖生长的影响
如表3所示,不同细胞分裂素种类对越南凉粉草
无菌芽增殖生长的效果不同。在培养基中添加相同浓
度(0.5 mg/L)的3种细胞分裂素(6-BA、KT、CPPU),其
中以添加CPPU 0.5 mg/L处理的越南凉粉草无菌芽增
殖倍数最高,达9.80倍;6-BA 0.5 mg/L处理次之,芽增
殖倍数为8.50倍;KT 0.5 mg/L处理的芽增殖倍数较
低,为6.24倍;而未添加任何细胞分裂素的处理(CK),
芽增殖倍数最低,仅为2.49倍;各处理之间的芽增殖倍
数差异均达极显著水平。从苗的生长状况来看(图1),
不同处理间表现为CK>KT>6-BA>CPPU。
表 3 不同细胞分裂素对越南凉粉草芽增殖生长的效果
Tab.3 Effects of various cytokinins on multiplication and growth of Vietnam Mesona blumes bud
细胞分裂素(mg/L)
Cytokinins
0(CK)
6-BA 0.5
KT 0.5
CPPU 0.5
重复Ⅰ RepeatⅠ
2.45
8.53
6.30
9.77
重复Ⅱ RepeatⅡ
2.50
8.47
6.17
9.80
重复Ⅲ RepeatⅢ
2.53
8.52
6.25
9.84
平均 Average
2.49dD
8.50bB
6.24cC
9.80aA
生长状况 Growth status
苗稀疏,叶片较大,植株最粗壮
苗较密,叶片细小,植株弱小
苗较为稀疏,叶片大,植株粗壮
苗最密集,叶片细小,植株弱小
芽增殖倍数Multiple of buds multiplication
图 1 添加不同细胞分裂素培养基中培养20 d的芽苗生长表现
Fig.1 Performance of multiplication plantlets cultured for 20 days in different media adding with different cytokinins
A:无任何细胞分裂素的培养基;B:添加CPPU的培养基;C:添加6-BA的培养基;D:添加KT的培养基
A:MS medium without any cytokinins;B:MS medium with CPPU;C:MS medium with 6-BA;D:MS medium with KT
2. 4不同接种部位对越南凉粉草芽增殖生长的影响
从表4可看出,凉粉草不同接种部位对芽增殖生
长的影响不同。在3个不同接种部位中,以茎上部的芽
增殖效果最好,芽增殖倍数最高,达9.35倍;其次为茎
中部,芽增殖倍数为7.53倍;最差的为茎基部,芽增殖
倍数仅为5.21倍。3个接种部位间的芽增殖倍数差异均
达极显著差异水平。从3个接种部位诱导的增殖芽生
长状况来看,表现为:茎上部>茎中部>茎基部。
芽增殖倍数Multiple of buds multiplication
芽增殖倍数Multiple of buds multiplication
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南 方 农 业 学 报
表 4 不同接种部位对越南凉粉草芽增殖生长的效果
Tab.4 Effects of distinct inoculation explants on multiplication and growth of Vietnam Mesona blumes bud
接种部位
Inoculation position
茎上部 Upper of stem
茎中部Middle of stem
茎基部 Basal of stem
重复Ⅰ RepeatⅠ
9.30
7.45
5.18
重复Ⅱ RepeatⅡ
9.35
7.60
5.20
重复Ⅲ RepeatⅢ
9.40
7.55
5.24
平均 Average
9.35aA
7.53bB
5.21cC
芽增殖倍数Multiple of buds multiplication 生长状况 Growth status
前期苗较好,叶片肥大,后期长势最好
前期苗弱小,叶片较壮,后期长势较好
前期苗弱小,叶片弱小,后期长势较差
3 讨论
3. 1基本培养基与越南凉粉草无菌芽增殖生长的
相关性
基本培养基是植物离体培养的基本条件之一。不
同基本培养基的特点不一,对植株增殖和生长影响效
果也不同。与其他培养基的基本成分相比,MS培养基
最大特点是硝酸盐、钾离子与铵离子含量丰富,元素
平衡及缓冲性能好,有机成分和微量元素含量丰富、
齐全,能较好满足快速增长组织对营养元素的需求
(冉懋雄,2004;王蒂,2004)。本研究结果表明,MS基
本培养基比Miller和改良White培养基更利于凉粉草
无菌芽的增殖和生长,可能是凉粉草在组培中对无
机盐、离子和硝酸盐的需求较高,而MS培养基能满
足其需要。
3. 2蔗糖浓度与越南凉粉草无菌芽增殖生长的相关性
在植物组织培养中,蔗糖是培养基中最理想的有
机营养成分——碳源之一(吕芝香,1981;仲乃琴等,
2000)。在本研究中,当蔗糖浓度为20.0 g/L时,芽增殖
倍数最高,而蔗糖浓度为25.0 g/L时,芽长势最好;当
蔗糖浓度过低(<20.0 g/L)或过高(>25.0 g/L)时,均不
利于凉粉草无菌芽的增殖和生长。这是因为蔗糖具有
碳源和渗透调节作用,并作为植物体内一种信号分子
参与调控植物生长发育进程(Ho et al.,2001;梁称福,
2005),其浓度增加时虽可以为植株提供更多的碳源
从而促进植株生长,但培养物是依靠培养基的渗透压
来吸取养分和水分,只有植物细胞和培养基之间处于
等渗或略低于培养基的渗透压时,其才可能从培养
基中吸取养分和水分(巩振辉和申书兴,2007)。蔗
糖浓度过低,不能满足培养物对碳源和渗透压的要
求;蔗糖浓度过高,则会导致培养基的渗透压过大,
不利于植株吸收水分及养分,从而抑制植株增殖生
长。因此,越南凉粉草芽增殖生长的适宜蔗糖浓度为
20.0~25.0 g/L。
3. 3细胞分裂素与越南凉粉草无菌芽增殖生长的
相关性
细胞分裂素(Cytokinins)可以促进细胞分裂、分化
及芽增殖,常用于继代增殖培养和芽诱导(巩振辉和
申书兴,2007)。但不同种类的细胞分裂素对芽增殖生
长的影响不同,常用的细胞分裂素一般为6-BA。最早
报道对凉粉草无菌芽增殖用的细胞分裂素是6-BA,使
用浓度为0.5 mg/L,芽增殖倍数为5~8倍(严胜柒等,
2005)。而Zhao等(2011)认为ZT对凉粉草无菌芽的增
殖效果优于6-BA,在使用浓度相同(0.5 mg/L)的条件
下,芽增殖系数为9.1。在本研究中,在MS培养基中添
加3种不同细胞分裂素,对越南凉粉草无菌芽增殖的
效应表现为:CPPU 0.5 mg/L处理(9.8倍)>6-BA 0.5
mg/L处理(8.5倍)>KT 0.5 mg/L处理(6.24倍)。虽然
KT处理的芽增殖倍数最低,但芽生长状况为最佳。与
前人在凉粉草无菌芽增殖中所用的细胞分裂素比较,
本研究发现在使用同等浓度条件下,CPPU具有比
6-BA和KT更高的活性。因此,越南凉粉草如以芽增殖
为主,可在培养基中添加CPPU进行诱导;要使芽生长
健壮,则可选用KT。至于不同细胞分裂素的适宜配组,
尚有待今后进一步研究。
3. 4接种部位与越南凉粉草无菌芽增殖生长的相关性
据研究表明,同一植物或同一器官不同部位组织
的再生能力也不一致。一般来说,年幼的茎尖再生能
力强,内源激素含量高,易形成生长素,遗传稳定,易
培养成功(葛胜娟,2005;巩振辉和申书华,2007)。本
研究结果表明,凉粉草无菌苗的茎上部芽比茎中部和
茎基部的更易增殖。因此,今后应优先选择生长健壮的
无菌苗茎上部接种,以提高继代培养的芽增殖效果。
4 结论
本研究结果表明,适宜越南凉粉草无菌芽增殖生
长的基本培养基为MS培养基,蔗糖浓度为20 .0~
25.0 g/L,CPPU 0.5 mg/L有利于芽的增殖,KT(0.5 mg/L)
有利于芽苗的生长,茎上部为适宜的接种材料。
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(责任编辑 韦莉萍)
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