全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2016 年
收稿日期：2015－09－15
基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项（2009ZX08003－009B）；邯郸市科学技术研究与发展计划项目（1322101065）；邯郸学院校级
项目（13208）；河北省社科基金项目（HB13JJ084）
作者简介：李志亮（1966－），男，河北魏县人，副教授，博士，主要从事植物生理、植物细胞工程和分子生物学研究，（电话）18732089216
（电子信箱）zhiliangli09＠126．com；通信作者，黄丛林（1969－），男，四川仁寿人，研究员，博士，主要从事植物抗旱、抗寒、耐盐分子
生物学及基因工程改良研究，（电子信箱）huangconglin＠hotmail．com。
菘蓝（Isatis indigotica Fort，2n＝14）是十字花科
菘蓝属二年生草本植物，是一种用途较广的中药材［1］，
多分布于河南、河北、北京、黑龙江、江苏、甘肃等地［2］。
其干燥根入药，称为板蓝根，干燥叶入药，称为大青
叶［3］。菘蓝中含有靛蓝、靛玉红、蒽醌类、β－谷甾醇和
多种氨基酸，具有清热解毒、凉血利咽、抗病毒细菌
的作用［4］，同时，在防治流感、乙肝、流行性腮腺炎等
病毒性疾病方面有着广泛的应用［5］。菘蓝中的成分靛
玉红能有效遏制肿瘤，对治愈慢性粒细胞白血病有
一定疗效［6］；靛红是单胺氧化酶的抑制剂［7］。 菘蓝多
糖能加强人体的免疫功能［8］。此外，板蓝根在预防严
重急性呼吸综合征（SARS）方面发挥着很大作用 ［9］。
Yang 等 ［10］从菘蓝根中提取的抗病毒成分 Clemas-
tanin B 可以抵抗人类和禽流感病毒和乙型病毒。
Shan 等 ［11］的研究表明，从菘蓝根中提取的 α－葡聚
IIP－A－1 是一种有效的辅助性和治疗性疫苗的候选
菘蓝组培再生体系的建立
李志亮 1，2，3，叶 嘉 1，3，邢浩春 1，3，王玉文 4，焦云红 1，3，胡亚新 1，黄丛林 2
（1．邯郸学院生命科学与工程学院，河北 邯郸 056005；2．北京农业生物技术研究中心，北京 100097；3．河北省高校冀南太行
山区野生资源植物应用技术研发中心，河北 邯郸 056005；4．邯郸市禾下土种业有限公司，河北 邯郸 056500）
摘要：以菘蓝（Isatis indigotica）无菌苗的叶片和叶柄为外植体，分别接种到添加不同生长调节剂浓度的
MS 培养基上，研究不同生长调节剂配比对菘蓝愈伤组织诱导与分化的影响，建立菘蓝组培再生体系。 结
果表明，叶片是菘蓝愈伤组织形成的最佳外植体，菘蓝愈伤组织诱导的最佳培养基为 MS＋6－BA 1．0 mg ／ L＋
NAA 0．5 mg ／ L，愈伤组织分化的最佳培养基为 MS＋6－BA 1．5 mg ／ L＋NAA 1．0 mg ／ L。 以 1 ／ 2MS 培养基添
加 0．1 mg ／ L NAA 可使再生植株的生根率达到 92．3％。
关键词：菘蓝（Isatis indigotica）；无菌苗；培养基；愈伤组织；再生植株
中图分类号：S567．1＋9 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2016）14－3716-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.044
Establishment of Isatis indigotica Tissue Culture Regeneration System
LI Zhi－liang1，2，3，YE Jia1，3，XING Hao－chun1，3，WANG Yu－wen4，JIAO Yun－hong1，3，HU Ya－xin1，HUANG Cong－lin2
（1．College of Life Sciences and Engineering，Handan University， Handan 056005，Hebei，China；
2．Beijing Research Center of Agro－Biotechnology，Beijing 100097，China；3．Hebei Institutions of Higher Learning Application Technology
Research and Development Center of Wild Resource Plants in Taihang Mountain Area of Southern Hebei，Handan 056005，Hebei，China；
4． Handan Hexiatu Seeds Co．，Ltd．，Handan 056000，Hebei，China）
Abstract： To study the effects of growth regulator on callus induction and differentiation，so that establish tissue culture
regeneration system of Isatis indigotica，the leaves and petioles of Isatis indigotica aseptic seedings were cut and inoculated on
MS medium supplemented with different growth regulator． The results showed that the leaf is the optimum explant for callus
formation of Isatis indigotica and the optimum medium for callus induction and differentiation is MS＋6－BA 1．0 mg ／ L＋NAA 0．5
mg ／ L，MS＋6－BA 1．5 mg ／ L＋NAA 1．0 mg ／ L，respectively． When the shoots were cultured on 1 ／ 2MS medium supplemented with
0．1 mg ／ L NAA， the rooting rate could reach 92．3％．
Key words： Isatis indigotica； aseptic seedling； medium； callus； regenerated plant
第 55 卷第 8期
2016年 4月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 55 No.7
Apr.，2016
2
1
1
Jan
14期
7
Vol． 5 No.14
Jul
第 14 期
佐剂。Yang等［12］从菘蓝根中提取出 3种新的吲哚类
生物碱，对一氧化氮产生具有抑制作用。 Liu等［13］从
菘蓝根中提取出 7 种具有抗流感病毒和柯萨奇病
毒活性的物质－糖苷双吲哚类生物碱。 在菘蓝的遗
传转化方面，许铁峰等 ［14］用根癌农杆菌 EHA105 转
化获得转 bar 基因的四倍体菘蓝植株。 唐俊等［15］用
根癌农杆菌转化获得草甘膦抗性的菘蓝植株。 Xiao
等［16］用含有 bar 基因作为筛选标记基因的根癌农杆
菌转化菘蓝， 获得的转 Bt Cry1Ac 和半夏凝集素
（Pta）基因的四倍体菘蓝增强了对蛾和蚜虫的抗性。
再生体系的建立是植物遗传转化的前提，需进行愈
伤组织的诱导。 研究者利用子叶 ［17］、下胚轴 ［17］、叶
片［18，19］、叶柄［18］、上胚轴［20］为外植体研究了不同生长
调节剂及组合对菘蓝愈伤组织诱导的影响。
本研究以菘蓝无菌苗作为培养材料，研究不同
生长调节剂组合对菘蓝愈伤组织诱导和分化的影
响，探讨菘蓝组培再生体系的建立，以期为菘蓝快
速繁殖和高产栽培，高效益、规模化生产提供技术
支持，为菘蓝细胞的大规模培养以及靛玉红、靛蓝
等重要成分的产业化应用提供原材料，为菘蓝遗传
转化提供必要基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
颗粒饱满、大小基本一致、无病斑的菘蓝种子
无菌条件下培养所得的实生苗。
1．2 试验方法
将挑选出的菘蓝种子先用自来水清洗，再用无
菌水浸泡 4 h，转移到超净工作台中进行消毒处理。
用无菌水冲洗种子 5 次，再用 75％的乙醇溶液表面
消毒 30 s， 无菌水冲洗 2 次， 然后用 10％的 NaClO
溶液浸泡 20 min，无菌水冲洗 5 次；最后，用无菌滤
纸吸干种子表面的水分后， 接种于 MS 基本培养基
进行培养以获得无菌苗。
挑选长势较好的无菌苗叶片与叶柄作为外植
体， 将幼嫩叶片切成面积为 1～2 cm2的小块并使叶
片正面朝上， 将叶柄切成长度为 1～2 cm 的小段，分
别接种于添加不同生长调节剂浓度组合的 MS 培养
基上（表 1），每个处理 5瓶，每瓶接种 3个。MS基本
培养基均添加蔗糖 30 g ／ L， 琼脂 7．0 g ／ L，pH 5．8，高
压蒸汽灭菌。 25 ℃下进行暗培养 5 d， 然后光照培
养，光照强度 1 800 lx，光照 12 h ／ d。
2 结果与分析
2．1 愈伤组织的诱导
2．1．1 不同外植体对愈伤组织诱导的影响 将叶
片、叶柄两种外植体分别接种到培养基中，在适宜
的条件下连续培养。 7 d后，叶片向上卷曲，外缘增厚
鼓起，并形成绿色颗粒状的愈伤组织；10 d 后，叶柄
两端向上翘起、肿胀，形成浅黄色的愈伤组织；14 d
后，统计愈伤组织诱导率，结果见表 2。由表 2 可知，
在相同的诱导条件下，叶片、叶柄愈伤组织的诱导
情况有较大差异， 叶片愈伤组织的平均诱导率较
高，为 72．6％；叶柄的相对低些，为 57．8％，这可能是
不同外植体内源生长调节剂含量不同以及对外源
生长调节剂和营养物质的吸收差异造成的。 另外，
两种外植体上形成的愈伤组织质量优劣不同，叶片
较优。 从多种因素考虑，菘蓝诱导愈伤组织的最佳
外植体是叶片。
2．1．2 不同生长调节剂浓度组合对愈伤组织诱导
的影响 将叶片与叶柄两种外植体分别接种于添
加了不同浓度的 6－BA 和 NAA 的培养基上，叶片与
叶柄在不同的培养基上愈伤组织的诱导率有所差
异，其结果见图 1。 由图 1 可知，6－BA 和 NAA 的交
互作用，均可诱导叶片、叶柄形成愈伤组织，但诱导
情况有明显差异。 将 NAA 的浓度从 0．2 mg ／ L 提高
表 1 不同生长调节剂浓度组合
处理
1
2
3
4
5
6
7
8
9
6-BA//mg/L
1.0
1.0
1.0
1.5
1.5
1.5
2.0
2.0
2.0
NAA//mg/L
0.2
0.5
1.0
0.2
0.5
1.0
0.2
0.5
1.0
表 2 不同外植体愈伤组织的诱导率
外植体类型
叶片
叶柄
接种外植体数//个
135
135
愈伤组织数//个
98
78
愈伤组织诱导率//%
72.6
57.8
1 2 3 4 5 6 7 8 9
处理
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
愈
伤
组
织
诱
导
率
//%
* 表示不同处理间差异显著（P＜0．05）。
图 1 不同生长调节剂浓度组合对愈伤组织诱导的影响
叶片
叶柄
*
*
李志亮等：菘蓝组培再生体系的建立 3717
湖 北 农 业 科 学 2016 年
到 0．5 mg ／ L 时，两种外植体愈伤组织的平均诱导率
都得到提高， 但继续提高 NAA浓度至 1．0 mg ／ L，诱
导率反而下降了。 将 6－BA的浓度从 1．0 mg ／ L提高
至 2．0 mg ／ L 的过程中，愈伤组织的平均诱导率呈现
出下降趋势， 说明高浓度的 6－BA 不利于菘蓝诱导
形成愈伤组织。 生长调节剂浓度组合为 6－BA 1．0
mg ／ L、NAA 0．5 mg ／ L时，愈伤组织诱导率最高。
2．2 愈伤组织的分化
2．2．1 不同外植体形成愈伤组织的分化情况 在
适宜条件下，连续培养愈伤组织，可以分化出不定
芽。 对于叶片、叶柄两种外植体而言，愈伤组织的分
化情况有较大差异，其结果见表 3。从愈伤组织分化
率、不定芽出现的时间、分化情况 3 个方面因素综
合考虑，菘蓝叶片诱导形成的愈伤组织的分化情况
较叶柄好。
2．2．2 不同生长调节剂浓度组合对愈伤组织分化
的影响 6－BA 与 NAA 的不同浓度组合，对菘蓝愈
伤组织的分化有着不同的作用效果，结果见表 4。由
表 4 可知，生长调节剂对愈伤组织分化成苗起着至
关重要的作用，不同的生长调节剂配比对两种外植
体愈伤组织的分化情况有显著差异。 当固定 6－BA
浓度时，将 NAA的浓度由 0．2 mg ／ L提高到 1．0 mg ／ L，
两种外植体愈伤组织的分化率都得到了提高，最适
合愈伤组织分化的 NAA浓度为 1．0mg ／L。将 6－BA浓
度由 1．0 mg ／ L 提高到 1．5 mg ／ L 时，愈伤组织的分化
率得到提高，但如果继续提高 6－BA浓度至 2．0 mg ／ L
时，愈伤组织的分化率降低了，可能是因为生长调
节剂含量太高， 抑制了芽的分化。 由此可见，6－BA
为 1．5 mg ／ L与 NAA为 1．0 mg ／ L 的激素浓度组合是
诱导愈伤组织分化的最佳浓度组合。
2．3 不同生长调节剂浓度组合对叶片直接分化的
影响
6－BA 与 NAA 的不同生长调节剂配比，可使叶
片先诱导出愈伤组织，并在愈伤组织上分化出不定
芽。 有些叶片并没有形成愈伤组织，而是在叶片的
切口处直接分化出不定芽。 6－BA与 NAA的不同生
长调节剂配比对菘蓝叶片分化的影响见表 5。 由表
5 可知，6－BA 2．0 mg ／ L 与 NAA 0．2 mg ／ L 的生长调
节剂浓度组合，可使叶片的出芽率最高。
2．4 生根诱导
待不定芽长到一定高度（2～3 cm）后，选择长势
好、健壮的芽，转移到生根培养基中使其分化生根，
连续培养 20 d 后，统计生根率，结果见表 6。 1 ／ 2MS
培养基添加 0．1 mg ／ L 的 NAA 对菘蓝的生根有显著
作用， 不定根的诱导率高达 92．3％， 说明低浓度的
NAA有利于植株生根。
2．5 组培再生
将菘蓝叶片和叶柄分别接种在愈伤组织诱导
培养基 MS＋6－BA 1．0 mg ／ L＋NAA 0．5 mg ／ L，可形成
愈伤组织，将愈伤组织接种在 MS＋6－BA 1．5 mg ／ L＋
NAA 1 mg ／ L的分化培养基上，逐渐形成不定芽并发
育成具有茎叶的小植株。 移入 1 ／ 2MS＋NAA 0．1 mg ／ L
的生根培养基中，20 d 开始生根， 逐渐发育为再生
植株（图 2、图 3）。
2．6 驯化移栽
当根的长度达到 2～3 cm时，揭开组培瓶上的封
口膜，炼苗 3 d 后，小心取出菘蓝苗，用清水轻轻冲
表 3 不同外植体愈伤组织分化情况
外植
体
叶片
叶柄
愈伤
组织数
块
98
78
分化的愈
伤组织数
块
50
26
愈伤组
织分化率
%
51.0
33.3
分化情况
较早，丛生芽较多，长势较快
较晚，芽较少，长势缓慢
表 4 不同生长调节剂配比对愈伤组织分化的影响
6-BA
mg/L
1.0
1.0
1.0
1.5
1.5
1.5
2.0
2.0
2.0
NAA
mg/L
0.2
0.5
1.0
0.2
0.5
1.0
0.2
0.5
1.0
叶片
12
13
11
11
12
10
9
11
9
叶柄
9
12
10
8
10
8
7
9
6
叶片
5
6
6
5
7
7
4
5
5
叶柄
2
3
4
2
3
5
2
3
3
叶片
41．7 a
46．2 ab
54．6 ab
45．5 ab
58．3 ab
70．0 b
44．4 ab
45．5 ab
55．6 ab
叶柄
22．2 a
25．0 a
40．0 ab
25．0 a
30．0 a
62．5 b
28．6 a
33．3 a
50．0 ab
愈伤组织数//块分化的愈伤组织数//块愈伤组织分化率//%
注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P＜0．05）。 下同。
表 5 不同生长调节剂配比对叶片直接分化的影响
6-BA//mg/L
1.0
1.0
1.0
1.5
1.5
1.5
2.0
2.0
2.0
NAA//mg/L
0.2
0.5
1.0
0.2
0.5
1.0
0.2
0.5
1.0
叶片数//个
9
9
9
9
9
9
9
9
9
直接分化叶片数//个
4
4
2
3
4
3
6
5
3
分化率//％
44．4 abc
44．4 abc
22．2 a
33．3 ab
44．4 abc
33．3 ab
66．7 c
55．6 bc
33．3 ab
表 6 不定根诱导
培养基
1/2MS+0.1 mg/L NAA
接种的不定芽数
个
65
生根的不定芽数
个
60
生根率
%
92.3
3718
第 14 期
洗根部，洗掉根部携带的琼脂块，再用吸水纸吸掉
根部的水，最后移栽到花盆中培养，成活率可达到
85％以上。
3 小结与讨论
植株再生体系的建立是植物组织培养的一个
重要应用，影响菘蓝组培再生体系建立的因素有多
种，主要包括生长调节剂的种类与浓度、外植体的
生理状态、接种方式、光照条件和培养温度等。 菘蓝
再生体系具有独特之处，当 6－BA 与 NAA 配合使用
时，可先由外植体诱导形成愈伤组织，再分化出不
定芽；同时，还能不经过愈伤组织诱导阶段，直接于
叶片切口部位分化出芽，这种直接器官发生途径为
菘蓝快速繁殖提供了一条新的途径。
以菘蓝无菌苗作为培养材料，以菘蓝叶片和叶
柄为外植体，初步建立了菘蓝组培再生体系。 菘蓝
愈伤组织诱导的最佳培养基为 MS＋6－BA 1．0 mg ／ L＋
NAA 0．5 mg ／ L，愈伤组织分化的最佳培养基为 MS＋
6－BA 1．5 mg ／ L＋NAA 1．0 mg ／ L。 最佳生根培养基为
1 ／ 2MS培养基添加 0．1 mg ／ L NAA。
参考文献：
［1］ 苏淑欣，李 世，李佳楠，等．菘蓝生长发育规律的研究［J］．职大
学报，2012，28（6）：93－96．
［2］ 崔振刚 ．板蓝根的用途和栽培种植技术应用 ［J］．黑龙江医药 ，
2014，27（4）：825－827．
［3］ 程春松，彭代银，黄和平，等．菘蓝育种研究现状及现代生物技术
的应用［J］．安徽中医学院学报，2012，31（4）：84－87．
［4］ 李戈莲，高义富，江成君，等．板蓝根的药用价值及 GAP 示范栽
培技术［J］．陕西农业科学，2004（1）：60－61．
［5］ 裴 毅，聂江力，韩英梅，等．菘蓝根化学成分研究［J］．安徽农业
科学，2011，39（25）：15258－15259．
［6］ 陈红霞，王康才，吕建军．菘蓝春化机理的初步研究［J］．现代中药
研究与实践，2003，17（5）：6－8．
［7］ HAMAUE N． Pharmacological role of Isatin， an endogenous
MAO inhibitor［J］．Yakugaku Zasshi，2000，120（4）：352－362．
［8］ 太光聪，李 友，朱继富．菘蓝的药用价值及开发利用［J］．现代农
业科技，2011（9）：134，136．
［9］ LIN C W，TSAI F J，TSAI C H，et al． Anti－SARS coronavirus
3C－like protease effects of Isatis indigotica root and plant－de-
rived phenolic compounds［J］． Antiviral Research，2005，68（1）：
36－42．
［10］ YANG Z，WANG Y，ZHENG Z，et al．Antiviral activity of Isatis
indigotica root －derived clemastanin B against human and a-
vian influenza A and B viruses in vitro［J］．International Jour-
nal of Molecular Medicine，2013，31（4）：867－873．
［11］ SHAN J，SUN G，REN J，et al．An α－glucan isolated from root
of Isatis Indigotica，its structure and adjuvant activity ［J］．Gly-
coconjugate journal，2014，31（4）：317－326．
［12］ YANG L，WANG G，WANG M， et al． Indole alkaloids from
the roots of Isatis indigotica and their inhibitory effects on
nitric oxide production［J］． Fitoterapia，2014，95：175－181．
［13］ LIU Y F，CHEN M H，GUO Q L，et al． Antiviral glycosidic
bisindole alkaloids from the roots of Isatis indigotica ［J］．Jour-
nal of Asian Natural Products Research，2015，17（7）：1－16．
［14］ 许铁峰，唐克轩，张汉明，等．抗除草剂基因导入四倍体菘蓝［J］．
中药材，2003，26（5）：313－315．
［15］ 唐 俊，张富生，廖志华．基于草甘膦筛选的菘蓝转化体系的建
立［J］．江西农业学报，2011，23（3）：129－131．
［16］ XIAO Y，WANG K，DING R，et al． Transgenic tetraploid Isatis
indigotica expressing Bt Cry1Ac and Pinellia ternata agglu-
tinin showed enhanced resistance to moths and aphids ［J］．
Molecular Biology Reports，2012，39（1）：485－491．
［17］ 彭 菲，王凤翱 ．菘蓝子叶和下胚轴组织培养再生植株的研
究［J］．湖南农学院学报，1994，20（5）：450－456．
［18］ 苗永美，简 兴，石 静．菘蓝两种外植体愈伤组织诱导研究［J］．
生物技术通报，2008（1）：147－150．
［19］ 胡冬南，柯国庆，王恒芬，等．激素对菘蓝叶片组织培养的影响［J］．
安徽农业科学，2009，37（17）：7868－7869．
［20］ 王 瀚，赵淑玲，赵桂芳，等．药用植物菘蓝的组织培养技术研
究［J］．甘肃高师学报，2015，20（2）：50－52．
A．菘蓝幼苗叶柄 B．叶柄诱导形成的愈伤组织
C．愈伤组织分化产生的不定芽 D．再生植株
图 3 菘蓝叶柄组培再生体系的建立
A B
C D
A．菘蓝幼苗叶片 B．叶片诱导形成的愈伤组织
C．愈伤组织分化产生的不定芽 D．再生植株
图 2 菘蓝叶片组培再生体系的建立
A B
C D
李志亮等：菘蓝组培再生体系的建立 3719