全 文 ：RP-HPLC法同时测定湿生扁蕾中 4种有效成分的含量
冯丽娟1 ,2 , 纪兰菊 1 ,2
(1.中国科学院西北高原生物研究所 , 西宁 810001;
2.青海省青藏高原特色生物资源研究重点实验室 , 西宁 810001)
摘　要:建立同时测定藏药湿生扁蕾中獐牙菜苦苷 、獐牙菜苷 、异荭草苷 、1 ,7-
二羟基-3 ,8-二甲氧基口山酮含量测定方法 。RP-HPLC 法 , 使用 VP-ODS C18柱(5
μm , 150 mm×4.6 mm), 流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液 , 梯度洗脱[ 0 ～ 40.00
min乙腈的体积分数(以下同)由 10%线性递增至 30%;40.01 ～ 55.00 min由
30%线性递增至 100%] , 流速为1.0 mL min , 柱温 30 ℃, 检测波长 260 nm 。结
果:獐牙菜苦苷 、獐牙菜苷 、异荭草苷 、1 ,7-二羟基-3 ,8-二甲氧基口山酮的线性
范围为 2.80 ～ 14.0μg (r=0.9992), 4.12 ～ 20.6μg(r=0.9997), 0.34 ～ 1.68 μg
(r=0.9997), 2.64 ～ 13.2 μg (r =0.9994);回收率分别为 99.89%, 99.52%,
101.88%, 99.42%。该方法可用于控制湿生扁蕾的质量。
关键词:湿生扁蕾;獐牙菜苦苷;獐牙菜苷;异荭草苷;1 ,7-二羟基-3 ,8-二甲氧
基口山酮;RP-HPLC法
　　湿生扁蕾(Gentianopsis paludosa Ma)为龙胆科
扁蕾属植物 , 藏药名称机合斗 , 具有清热解毒的
功效。藏医用全草治疗流行性感冒及胆病引起的
发烧。由湿生扁蕾制成的冲剂对治疗小儿腹泻疗
效显著[ 1, 2] 。对湿生扁蕾的化学成分研究发现 , 其
主要含有苦味素类 、口山酮 、黄酮 、三萜类化合
物。口山酮和黄酮类化合物具有广泛的生物活性 ,
如抗氧化 、抗菌 、护肝等[ 3 ～ 5] 。王焕弟等[ 6] 选择木
犀草素和 1 ,7-二羟基-3 ,8-二甲氧基口山酮作为对
照品进行了HPLC 含量测定。但目前对湿生扁蕾中
的苦苷类 、黄酮苷类成分的含量测定未见报道 ,
因此本试验选择了 2个代表性的苦苷类成分 , 即
獐牙菜苦苷 、獐牙菜苷;1个黄酮苷类成分 , 即异
荭草苷;1个口山酮类成分 , 即 1 ,7-二羟基-3 ,8-二
甲氧基口山酮作为对照品 , 建立了高效液相色谱
法同时测定湿生扁蕾中 4种有效成分的含量 , 为
湿生扁蕾药材的质量控制提供了可行的方法 。
1　实验部分
1.1　仪器 、试剂与材料
LC-10ATVP 二元泵(岛津公司);Rheodyne 7725
进样器(美国);SPD-M10AVP 二极管阵列检测器
(岛津公司);Class-VP 液相色谱工作站(岛津公
司);Milli-Q 超纯水装置;AT-130柱温箱(天津);
AB104-N电子天平(Mettler-toledo 公司);ZM 震动
超微粉碎机;2200B超声波仪 。乙腈购自山东禹城
禹王试剂厂 , 为色谱纯;H3PO4 和甲醇为分析纯;
水为自制重蒸水并经 0.45 μm 滤膜过滤;獐牙菜
苦苷 、獐牙菜苷 、异荭草苷 、1 , 7-二羟基-3 ,8-二甲
氧基口山酮对照品均由中国科学院西北高原生物
研究所孙洪发教授提供 , 纯度均为 96%以上。
实验材料采自青海省 , 采集时间为 2005 年 8
月 、 9月 , 由中国科学院西北高原生物研究所陈桂
琛研究员鉴定 , 样品来源见表 1。
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第 27卷增刊
2008 年 12 月　　　　　　　　　　　　 分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory　　　　　　　　　　　　Vol.27.Suppl.2008-12
基金项目:国家中西部专项(2001BA901A17)项目资助
作者简介:冯丽娟(1982-), 女 , 硕士研究生;E-mail:FLJ0118@163.com
DOI :10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2008.0563
表 1　2005年样品来源
样品编号 采集时间 采集地点 海拔高度 m 纬度 经度
1 2005.09.04 青海省循化县尕楞乡 2610 35°44.556′ 102°18.339′
2 2005.09.04 青海麦秀林场 2810 35°19.827′ 101°55.713′
3 2005.08.19 青海省大通县宝库乡 2920 37°13.961′ 101°01.234′
4 2005.08.25 青海省互助县 3090 37°01.750′ 102°14.379′
5 2005.08.25 青海省互助北山 3130 37°00.424′ 102°08.335′
6 2005.09.03 青海青沙山 3300 36°16.389′ 101°58.273′
7 2005.09.04 青海省泽库县 3620 35°08.991′ 101°43.704′
1.2　色谱条件
色谱柱:VP-ODS C18柱(5 μm , 150 mm ×4.6
mm);流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液 , 梯度洗脱
[ 0 ～ 40.00 min , 乙腈的体积分数(下同)由 10%线
性递增至 30%;40.01 ～ 55.00 min , 乙腈由 30%线
性递增至 100%] ;流速 1.0 mL min;检测波长 260
nm;柱温:30 ℃;在上述色谱条件下 , 混合标准品
及样品的色谱图如图 1。
图 1　对照品(a)及样品(b)的 HPLC 色谱图
1-獐牙菜苦苷;2-獐牙菜苷;3-异荭草苷;4-1 , 7-二羟
基-3 , 8-二甲氧基口山酮
1.3　溶液制备
1.3.1　对照品溶液　分别精密称取獐牙菜苦苷 、
獐牙菜苷 、异荭草苷 、 1 ,7-二羟基-3 ,8-二甲氧基口
山酮对照品适量 , 加甲醇制成浓度分别为 0.7 、
1.03 、 0.084 、 0.66 mg mL的单一对照品溶液 。
1.3.2　供试品溶液　分别将样品置粉碎机中粉碎
成细粉(过 40目筛), 精密称取 2.5 g , 置于 100mL
具塞锥形瓶中 , 加入甲醇50 mL , 密塞 , 称定重量 ,
超声提取 1 h , 放冷 , 再称定重量 , 用甲醇补足减
失的重量 , 摇匀 , 过 0.45 μm 滤膜 , 弃取初滤液 ,
收集续滤液为供试品溶液。
1.4　线性关系考察
分别精密吸取獐牙菜苦苷 、獐牙菜苷 、异荭
草苷 、 1 , 7-二羟基-3 , 8-二甲氧基口山酮的单一对
照品溶液 4 , 8 , 12 , 16 , 20 μL , 按上述色谱条件测
定。以相应组分的色谱峰面积(Y)对其进样量(X ,
μg)进行线性回归 , 计算回归方程。獐牙菜苦苷 、
獐牙菜苷 、异荭草苷 、 1 ,7-二羟基-3 ,8-二甲氧基口
山酮的回归方程分别为:
Y =33100.8X+178572.5 , r=0.9992
Y =18268X +321963.1 , r=0.9997
Y =-63171.8X +190578.9 , r=0.9997
Y =-535451X+1483826 , r=0.9994
线性范围分别为:2.80 ～ 14.0 μg , 4.12 ～
20.60μg , 0.34 ～ 1.68 μg , 2.64 ～ 13.2μg 。
1.5　精密度试验
分别精确吸取单一对照品溶液獐牙菜苦苷 、
獐牙菜苷 、异荭草苷 、 1 ,7-二羟基-3 ,8-二甲氧基口
山酮 , 按上述色谱条件进行测定。进样 20 μL , 重
复 5次 , 以峰面积计算可得獐牙菜苦苷 、獐牙菜
苷 、异荭草苷 、 1 ,7-二羟基-3 ,8-二甲氧基口山酮的
RSD (n =5)分别为 1.02%, 1.10%, 0.99%,
1.33%, 表明精密度良好 。
1.6　重复性试验
精密称定同一批样品 , 按“1.3.2”项下方法分
别制备5份供试品溶液 , 分别测定 , 结果獐牙菜苦
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苷 、獐牙菜苷 、异荭草苷 、 1 ,7-二羟基-3 , 8-二甲氧
基口山酮含量平均值分别为 0.67%, 1.43%,
0.09%, 0.41%;RSD 分别为 2.07%, 0.92%,
2.45%, 1.33%, 表明该方法的重复性较好。
1.7　稳定性试验
取上述供试品溶液 , 分别间隔2 h进样 , 每次
20μL , 重复5次 , 进行测定方法的稳定性实验 , 求
得獐牙菜苦苷 、獐牙菜苷 、异荭草苷 、1 ,7-二羟基-
3 ,8-二甲氧基口山酮峰面积的 RSD分别为 2.96%,
3.32%, 2.87%, 1.86%, 说明供试品在 0 , 2 , 4 ,
6 , 8 h内稳定 。
1.8　加样回收率试验
精密称取已知獐牙菜苦苷 、獐牙菜苷 、异荭
草苷 、 1 , 7-二羟基-3 , 8-二甲氧基口山酮含量的湿
生扁蕾药材全草样品 5份 , 加入一定量的对照品 ,
按“1.3.2”项下方法制备溶液 , 进行 HPLC 分析 ,
测得獐牙菜苦苷 、獐牙菜苷 、异荭草苷 、 1 ,7-二羟
基-3 , 8-二甲氧基口山酮回收率分别为 99.89%
(RSD = 1.29%), 99.52%(RSD = 1.68%),
101.88%(RSD=1.73%), 99.42(RSD=1.92%)。
1.9　样品测定
按“1.3.2”项下方法制备各样品的供试品溶
液 , 精密吸取 20 μL进样 , 按上述色谱条件测定峰
面积积分值 , 代入回归方程计算 2005年不同地区
湿生扁蕾中有效成分的含量 , 结果见表 2。
表 2　2005年样品含量测定结果(%)
样品编号 獐牙菜苦苷 獐牙菜苷 异荭草苷 1 , 7-二羟基-3 , 8-二甲氧基口山酮 总含量
1 0.32 0.70 0.07 0.58 1.67
2 0.23 0.89 0.02 0.45 1.59
3 0.40 0.81 0.03 1.03 2.26
4 0.48 0.61 0.04 0.71 1.84
5 0.44 0.78 0.05 0.86 2.12
6 0.41 0.46 0.11 0.86 1.84
7 0.18 0.84 0.06 2.33 3.41
2　讨论
2.1　提取溶剂的选择
本实验采用甲醇 、乙醇 、丙酮进行超声提取 ,
结果发现采用甲醇超声提取效率高 , 且杂质峰少 。
2.2　流动相的选择
本实验考察了甲醇-水 、甲醇-水-H3PO4 、乙腈-
水 、乙腈-水-H3PO44种流动相系统。结果表明 , 用
乙腈-水-H3PO4做流动相时 , 能使湿生扁蕾中的成
分得到很好的分离 , 而且能得到完美基线的谱图 。
2.3　检测波长的选择 　湿生扁蕾中所含的三萜
类 、口山酮类 、黄酮类化合物等成分 , 它们多在
260 ～ 280 nm的范围内有较强的紫外吸收。本研究
采用二极管阵列监测器(DAD)对湿生扁蕾的成分
进行全波长扫描 , 通过比较不同波长下的图谱中
色谱峰的数目 、高度及面积。最终确定了最佳检
测波长为 260 nm。
参考文献
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[ 5] 　王焕弟 , 谭成玉 , 白雪芳等.天然产物研究与开发 ,
2005 , 17:598
[ 6] 　王焕弟 , 谭成玉 , 赵静玫等.药物分析杂志 , 2007 ,
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