全 文 ：RP-HPLC法测定湿生扁蕾中当药黄素和当药醇苷的含量
贾红光　(青海大学 ,青海西宁 810016)
摘要　[ 目的]建立反相高效液相色谱法 ,同时测定湿生扁蕾中有效成分当药黄素、当药醇苷含量。[方法]采用Kromasil-C18(250 mm×
4.6 mm , 5μm)色谱柱 ,流动相甲醇和水(含 0.04%H3PO4),在 0～ 20 min甲醇∶水由 40∶60～ 63∶37线性梯度洗脱 ,流速 0.8 ml/min, 检测波
长 254 nm ,柱温 30 ℃。[结果] 当药黄素、当药醇苷 2种有效成分都在 17 min内均达到基线分离 ,当药黄素、当药醇苷的线性范围分别是
0.338～ 2.025μg(r=0.999 5)、0.275～ 1.650μg(r=0.999 5), 加标回收率为 103.30%(RSD=3.20%)、99.60%(RSD=2.70%)。[结论]该
方法快速 ,结果准确、可靠。
关键词　反相高效液相色谱法;湿生扁蕾;当药黄素;当药醇苷
中图分类号　S567.21+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)24-10520-02
Determination of Swertisin and Swertianolin Contents in Gentianopsis paludosa(Munro)Ma by RP-HPLC
JIA Hong-guang　(Qinghai University , Xining , Qinghai 810016)
Abstract　[ Objective] The research aimed to establish a quantitative determination method of swertisin and swertianolin in Gentianopsispaludosa(Munro)
Ma by RP-HPLC.[ Method] The sample were separated on the column of Kromasil-C18(4.6 mm×250 mm , 5μm)which eluted with methanol and water
(0.04% phosphoric acid).The ratio of methanol andwater increased from 40∶60 to 63∶37 in 20 min with detected wave-length at 254 nm , flow rate at 0.8
ml/min , column temperature at 30 ℃.[ Result] Two effective components were base-isolated.The linear ranges of swertisin and swertianolinwere 0.338
-2.025μg(r=0.999 5), 0.275-1.650μg(r=0.999 5)respectively.The average recoveries were 103.30%(RSD=3.20%),99.60%(RSD=2.
70%).[ Conclusion] The method was rapid , precise and reliable.
Key words　RP-HPLC;Gentianopsis paludosa(Munro)Ma;Swertisin;Swertianolin
作者简介　贾红光(1965-),男 ,青海西宁人 ,副教授 ,从事化工机械
和控制工程方面的研究。
收稿日期　2008-04-25
　　湿生扁蕾[ Gentianopsis paludosa(Munro)Ma)] ,藏语称“吉
合斗” ,为 1年生龙胆科草本植物 ,主要分布在青海省海东 、
黄南 、海北 、海西 、玉树 、果洛等地 ,生长在海拔2 500～ 4500 m
的河滩 、沼泽地 、山坡草地及林缘 ,是青藏高原地区已用于临
床的药用植物。湿生扁蕾藏药称“机合滴” ,具有清热 、解毒 、
利湿消黄之功效 ,主治肝炎 、胆囊炎 、热病发斑 、泄泻 、肠胃
炎 、结膜炎 、高血压 、急性肾盂肾炎和疮疥肿毒等症 ,已被列
入青海重要的开发藏草药项目[ 1] 。体外抑菌试验表明 ,该植
物对绿脓杆菌 、巨大芽孢杆菌 、金色葡萄球菌 、八叠球菌 、大
肠杆菌 、变形杆菌 、梭状牙孢杆菌等均有显著的抑制作用[ 2] 。
当药黄素是黄酮苷类化合物 ,对鼠伤寒杆菌具有中度抑
制作用 ,当药醇苷为山酮苷类化合物时 ,具有抑制结核菌的
作用[ 3] ,是龙胆科药物中的有效成分 。但目前有关龙胆科植
物中当药黄素和当药醇苷的检测方法的报道较少[ 4-5] ,而关
于湿生扁蕾中上述成分的检测方法未见报道。为此 ,笔者建
立了反相高效液相色谱法 ,同时测定了该藏药材中当药黄素
和当药醇苷的含量 ,旨在为客观准确地评价藏药湿生扁蕾的
质量提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　仪器。Agilent1100高效液相色谱仪(配置:手动进样
器 、在线脱气机 、高压二元梯度泵 、恒温柱温箱 、DAD检测器 、
Agilent1100色谱工作站);Kromasil-C18(250 mm ×4.6 mm , 5
μm)色谱柱;KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公
司生产);SZ-97自动三重纯水整流器(上海亚荣生化仪器厂
生产)。
1.1.2　试剂。高效液相色谱专用试剂甲醇(山东禹王实业
有限公司禹城化工厂生产);娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团
公司生产);磷酸(AR级 ,北京红星化工厂生产)。
对照品:当药黄素和当药醇苷由青海民族学院药学系林
鹏程教授提供 ,经归一化法检测 ,纯度大于 98%。
1.1.3　样品。2005年样品采于青海省互助北山林场 ,经青
海民族学院药学系毛继祖教授鉴定。样品阴干后粉碎至 80
目 ,冷藏备用。
1.2　方法
1.2.1　对照品溶液的配制。精密称取当药黄素 、当药醇苷
对照品 2.7、2.2mg ,分别置于 10 ml容量瓶中 ,以甲醇溶解并
定容至 10 ml ,配制成相应浓度的对照品储备液 ,使用时稀释
成所需浓度。
1.2.2　样品溶液的制备。精密称取 0.5 g样品 ,加入 10 ml
甲醇超声 60 min ,过滤 ,滤渣重复提取 2次 ,合并滤液 ,浓缩后
定容至 25 ml ,过 0.45 μm 滤膜 ,在选定色谱条件下测定峰
面积 。
2　结果与分析
2.1　不同提取方法对当药黄素 、当药醇苷提取率的影响　
精密称取 9份湿生扁蕾样品 ,每份重 0.5 g ,分别用甲醇热回
流(2 h)、超声(20 min)、冷浸(24 h),测定不同提取法下当药
黄素 、当药醇苷的含量 ,结果发现 ,超声提取方法提取时间
短 ,提取率最高 ,因此该试验选用超声提取法。
2.2　不同提取溶剂对当药黄素和当药醇苷提取率的影响　
精密称取 9份湿生扁蕾样品 ,每份重 0.5 g ,分别用甲醇 、乙
醇 、水超声提取 20 min , 测定甲醇 、乙醇 、水对当药黄素 、当药
醇苷提取率的影响 ,结果发现 ,甲醇提取率最高 ,故选用甲醇
为提取溶剂。
2.3　检测波长的确定　从图 1可以看出 ,利用 DAD检测器
在 220～ 400 nm扫描其吸收光谱 ,当药黄素和当药醇苷对照
品在 254 nm波长处均有较高的吸收 ,结合文献[ 5]选择 254
nm为检测波长。
2.4　流动相的选择　经试验 ,当流速为 0.8 ml/min时 ,在 0
～ 20 min ,流动相组成MeOH∶H2O由 40∶60至 63∶37线性梯度
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008, 36(24):10520-10521, 10523　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　姜丽　责任校对　马君叶
洗脱 ,当药黄素和当药醇苷与其他组分在 17 min内达到基线
分离;水中加入 0.04%的磷酸 ,可抑制上述成分的拖尾。
2.5　色谱条件选择　色谱柱:Kromasil-C18(250 mm ×4.6
mm ,5μm)色谱柱;流动相:0 ～ 20 min ,MeOH∶H2O(含 0.04%
H3PO4)由 40∶60增至 63∶37线型梯度洗脱;流速:0.8 ml/min;
柱温:30 ℃;检测波长:254 nm 。从图 2可以看出 ,该色谱条件
下当药黄素 、当药醇苷均达到基线分离。
注:A为当药黄素;B为当药醇苷。
Note:A.Swertisin;B.Swert ianolin.
图 1　当药黄素和当药醇苷的紫外吸收光谱图
Fig.1 UV absorption spectrum of swertisin and swertianolin
注:A为对照品;B为样品;1为当药黄素;2为当药醇苷。
Note:A.Control;B.Sample;1.Swert isin;2.Swertianolin.
图 2　对照品及样品色谱图
Fig.2　Chromatogramof the control and sample
2.6　系统适应性试验
2.6.1　线性关系的考察。分别取 0.027 mg/ml的当药黄素
和 0.022 mg/ml当药醇苷对照品溶液 ,稀释 20倍后 ,分别进
样2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 、15.0μl ,以绝对进样量对峰面积作
图 ,测得当药黄素和当药醇苷标准工作曲线分别为:A1 =
3 029.600X +16.600 ,A2 =5 351.300X -46.116 ,线性相关系数
均为 r=0.999 5 ,线性范围分别为 0.338 ～ 2.025 μg和 0.275
～ 1.650 μg。
2.6.2　检测限确定。在选定的色谱条件下 ,当信噪比 S/N
=3时 ,测得该条件下当药黄素和当药醇苷的最低检测限分
别为 0.27、0.44 ng。
2.6.3　精密度试验 。分别取 0.027 mg/ml当药黄素和0.022
mg/ml当药醇苷对照品溶液 ,混合后在选定色谱条件下测定
色谱峰的峰面积 ,计算得 RSD 分别为 0.73%、0.70%(n=5),
表明仪器精密性良好 。
2.6.4　重复性试验。精密称取湿生扁蕾干粉 0.5 g共 5份 ,
按“1.2.2”的方法操作 ,在选定色谱条件下 ,测定当药黄素和
当药醇苷的含量 ,计算得 RSD 分别为 1.40%、2.00%(n=5),
表明方法的重复性良好。
2.6.5　稳定性试验。精密称取湿生扁蕾干粉 0.5 g ,按“1.2.
2”的方法操作 ,在选定色谱条件下 ,分别在 0、2、4、6 、8 h 进
样 ,测定当药黄素和当药醇苷的峰面积 ,计算得 RSD 分别为
1.40%、1.80%(n=5),表明样品溶液在 8 h内稳定 。
2.6.6　回收率试验 。精密称取湿生扁蕾样品 0.05 g 3份 ,各
添加当药黄素 0.027 mg/ml 溶液 0.8 ml和当药醇苷 0.022
mg/ml溶液 0.7 ml ,按“1.2.2”的方法操作 ,测得当药黄素和
当药醇苷的平均回收率(n=3)分别为:103.30%、99.60%,
RSD分别为 3.20%、2.70%。
2.7　样品含量测定结果　精密称取 0.5 g样品 ,按“1.2.2”的
方法操作 ,在给定色谱条件下分析 ,经 DAD检测器检测待测
组分的峰纯度 ,等到紫外光谱与对照品一致后 ,用外标法定
量 ,测得样品中当药黄素和当药醇苷的含量分别为 0.072%、
0.062 5%。
3　结论与讨论
该文建立的方法具有提取完全 ,分析方法简便 、快速 ,结
果准确 、可靠等特点 ,对全面评价藏药材湿生扁蕾的质量有
重要的参考价值。
(下转第 10523页)
1052136卷 24期　　　　　　　　　　贾红光　RP-HPLC法测定湿生扁蕾中当药黄素和当药醇苷的含量
图 1　獐牙菜苦苷对照品(A)及样品(B)色谱图
Fig.1　Chromatogram of the swertisin standard(A)and the sample(B)
2.1.6　回收试验。精密称取麻花艽样品 0.05 g 3份 ,各添加
獐牙菜苦苷 0.022 mg/ml溶液 0.8 ml ,按“1.4.2”项下方法操
作 ,测得獐牙菜苦苷的平均回收率(n=3)为 99.5%,RSD 为
3.2%。
2.2　獐牙菜苦苷含量测定结果　精密称取 0.5 g样品 ,按
“1.4.2”方法操作 ,在给定色谱条件下分析 ,经DAD检测器检
测待测组分的峰纯度 ,紫外光谱与对照品一致后 ,外标法定
量 ,测得青海省不同产地麻花艽样品中獐牙菜苦苷的含量见
表 1。
表1　青海不同地区麻花艽中獐牙菜苦苷含量
　　Table 1　Swertiamarin content in GentianastramineaMaxim.at differ-
ent areas of Qinghai
%
产地
Producing area
含量
Content
产地
Producing area
含量
Content
门源仙米林场 0.359 2 贵德 Guide 0.079 4
Menyuanxianmi forest farm 0.358 2 刚察 Gangcha 0.192 2
祁连 Qilian 0.443 4 泽库 Zeku 0.518 9
互助 Huzhu 0.396 7 大通 Datong 0.257 9
湟中 Huangzhong 0.118 5 门源 Menyuan 0.304 2
玉树 Yushu 0.351 9 海堰 Haiyan 0.318 2
果洛 Guoluo
2.3　不同提取方法对分析结果的影响
2.3.1　不同提取方法对獐牙菜苦苷提取率的影响。精密称
取9份麻花艽样品 ,每份 0.5 g ,用甲醇热回流 2 h ,超声 20
min ,冷浸 24 h ,分别测定不同提取法下獐牙菜苦苷的含量 ,结
果发现 ,超声提取方法提取时间短 ,提取率最高 ,因此该试验
选用超声提取法。
2.3.2　不同提取溶剂对獐牙菜苦苷提取率的影响。精密称
取 9份麻花艽样品 ,每份 0.5 g ,分别用甲醇 、乙醇 、水超声提
取 20 min ,测定甲醇 、乙醇 、水对獐牙菜苦苷提取率的影响 ,结
果发现 ,甲醇提取率最高 ,故选用甲醇为提取溶剂 。
2.3.3　不同甲醇浓度对獐牙菜苦苷提取率的影响 。精密称
取 12份麻花艽样品 ,每份 0.5 g ,分别用 40%、60%、80%、
100%的甲醇水溶液超声提取 20 min ,测定不同浓度甲醇对獐
牙菜苦苷提取率的影响 ,结果发现 , 60%甲醇提取率最高 ,故
选用 60%甲醇为提取溶剂。
2.3.4　检测波长的确定。利用 DAD检测器在 200～ 400 nm
扫描獐牙菜苦苷吸收光谱 ,獐牙菜苦苷在 240 nm处有较高的
吸收 ,选择 240 nm为检测波长。
2.3.5　流动相的选择。试验中 ,当流速为 1 ml/min时 ,以
26%甲醇水溶液(含 0.04%H3PO4)为流动相等度梯洗脱 ,柱
温 30 ℃,獐牙菜苦苷与其他组分在 12 min内达到基线分离 ,
水中加入 0.04%的磷酸 ,可抑制上述成分的拖尾 。
3　结论
该研究所建立方法具有提取完全 ,分析方法简便 、快速 ,
结果准确 、可靠等特点 ,对全面评价麻花艽的质量有重要的
参考价值。青海不同地区麻花艽中獐牙菜苦苷含量有较明
显的差异 ,其中以泽库县产麻花艽中獐牙菜苦苷含量最高 ,
贵德县麻花艽中含量最低 。
参考文献
[ 1] 杨永昌 ,何廷农,卢生莲 ,等.藏药志[M] .西宁:青海人民出版社 , 1991:
9-11.
[ 2] 中国科学院西北高原生物研究所.青海经济植物志[M] .西宁:青海人
民出版社 ,1987:453-454.
[ 3] 纪兰菊 ,孙洪发,丁经业,等.青藏高原四种龙胆植物化学成分初步研
究[ J] .高原生物学集刊, 1992(11):113-118.
[ 4] 孙文基 ,绳金房.天然活性成分简明手册[M] .北京:中国医药科技出版
社 ,1998:256.
[ 5] 林鹏程 ,冶兆辉,卢永昌 ,等.藏药秦艽、麻花艽中的番木鳖酸和龙胆苦
甙的HPLC法含量测定[ J] .中药材, 2004, 27(11):819-821.
[ 6] 林鹏程 ,卢永昌,梁永欣,等.青海不同地区藏药麻花艽中裂环烯醚帖苷类成分含量与品质评价[ J] .中国药学杂志 ,2006,41(10):783-785.
(上接第 10521页)
参考文献
[ 1] 曹长年,米琴,赵宙兴,等.藏药湿生扁蕾有效成分的研究[ J] .青海农
林科技, 2004(3):12-13.
[ 2] 米琴 ,曹长年 ,王慧春 ,等.湿生扁蕾有效成分抑菌活性的测定[ J] .青
海大学学报:自然科学版 ,2004, 22(2):84-85.
[ 3] 孙文基 ,绳金房.天然活性成分简明手册[M] .北京:中国医药出版社 ,
1998:539-541.
[ 4] 胡凤祖 ,宋娅莉,刘梅 ,等.青藏高原龙胆科植物药用有效成分的高效
液相色谱分析[ J] .色谱, 2003,23(1):63-65.
[ 5] 纪兰菊 ,保怡 ,陈桂琛 ,等.15种獐牙菜属植物中主要药用成分的高效
液相色谱测定[ J] .西北植物学报 ,2004, 24(7):1298-1302.
1052336卷 24期　　　　　　　　　　　　　　　　李梅兰　RP-HPLC法测定青海不同地区麻花艽中獐牙菜苦苷含量