全 文 ：2016 年 3 月 第 18 卷 第 3 期 中国现代中药 Mod Chin Med Mar. 2016 Vol. 18 No. 3
·专题·
△［基金项目］ 云南省科技创新强省计划项目(2014AE015) ;云南省科技创新人才计划(2015HB102)
*［通信作者］ 杨斌，副研究员，研究方向:药用植物规范化栽培;Tel: (0871)65033575，E-mail:yb0872@ 163. com
云南粗茎秦艽斑枯病病原鉴定
△
马维思，杨丽英，王馨，董志渊，李林玉，李绍平，严世武，杨斌*
(云南省农业科学院 药用植物研究所，云南 昆明 650205)
［摘要］ 目的:明确云南种植的粗茎秦艽斑枯病的发生规律及病原菌的分类地位，以期为该病的防治提供依
据。方法:通过田间调查掌握该病发生的基本规律，经组织分离、柯赫氏法则验证获得病原菌，依据真菌的形态特
征和 ITS序列特征确定其分类地位。结果:基于真菌形态和 ITS序列特征，粗茎秦艽斑枯病病原被鉴定为小孢壳针
孢 Septoria microspora，该病在云南粗茎秦艽主要种植区普遍发生。结论:小孢壳针孢 Septoria microspora 是粗茎秦艽
斑枯病病原菌。
［关键词］ 粗茎秦艽;斑枯病;病原鉴定;小孢壳针孢
Pathogen Identification of Gentiana crassicaulis Leaf Spot in Yunnan Province
MA Weisi，YANG Liying，WANG Xin，DONG Zhiyuan，LI Linyu，LI Shaoping，YAN Shiwu，YANG Bin*
(Institute of Medicinal Plants，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650205，China)
［Abstract］ Objective:To identify the pathogen of Gentiana crassicaulis leaf spot in Yunnan province. Methods:The
pathogen was isolated from leaf spot of G. crasicaulis with Potato Dextrose Agar medium，tested and verified with Koch’s
postulates，and identified Based on morphological and ITS DNA sequence. Ｒesults: The pathogen was identified as
S. microspora. Conclusion:S. microspora is the pathogen of G. crasicaulis leaf spot.
［Keywords］ Gentiana crasicaulis;leaf spot;pathogen identification;Septoria microspora
doi:10． 13313 / j． issn． 1673-4890． 2016． 3． 008
粗茎秦艽 Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk. 为
龙胆科多年生草本植物，是 2015 年版 《中华人民共
和国药典》收录的秦艽 4 种基原植物之一，具有祛
风湿、清湿热，止痹痛，退虚热的功效。用于风湿
痹痛，中风半身不遂，筋脉拘挛，骨节酸痛，湿热
黄疸，骨蒸潮热，小儿疳积发热［1］。粗茎秦艽主要
分布于云南、西藏东南部、四川、贵州西北部、青
海东南部、甘肃南部［2］，其中云南是粗茎秦艽最大
产区，主要种植在滇西北丽江玉龙县、迪庆维西县
以及大理花甸坝等地，目前种植面积已达 2000 多公
顷［3］。在长期种植过程中，一种叶部斑枯病已经成
为粗茎秦艽的主要病害之一，该病在云南粗茎秦艽
主产区均有发生，造成较为严重的损失，关于该病
病原的鉴定目前尚未见报道。本文报道了粗茎秦艽
斑枯病的发生规律以及病原菌的分离、鉴定，以期
为该病的研究与防治提供依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
粗茎秦艽斑枯病病株与接种用健康植株均采自
丽江市玉龙县鲁甸乡拉美荣村粗茎秦艽基地，经云
南省农科院药用植物研究所李绍平研究员鉴定为粗
茎秦艽 Gentiana crassicaulis。
PDA培养基:200 g马铃薯去皮切块浸煮，滤除
残渣，20 g 葡萄糖，17 g 琼脂，加水定容至 1 L，
121 ℃高压湿热灭菌 20 min。不加琼脂的 PDA 培养
基为 PD培养液。
Omega D3390-02 真菌 DNA 小量提取试剂盒(广
州飞扬生物工程有限公司) ;2X PCＲ Master(Taq，
染料)即用 PCＲ 扩增试剂盒［生工生物工程上海
(股份)有限公司，简称生工生物］;真菌 ITS 通
用引物 ITS4(5 TCCTCCGCTTATTGATATGC3)与
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ITS5(5GGAAGTAAAAGTCGTA ACAAGG3)由生工
生物合成。
1. 2 方法
1. 2. 1 病害调查 2013—2014 年，在粗茎秦艽不同
生长期，通过田间观察与走访，对云南丽江市玉龙
县、迪庆州维西县等粗茎秦艽主产区的斑枯病发生
情况进行调查，了解该病的发生规律。
1. 2. 2 病原菌的分离与形态鉴定 从病叶上采集病
原物，在显微镜(凤凰 PH100-3B41L-IPL)下，用显
微镜摄像头(MC-D500U(C) )拍照记录其特征，用
Phmias2008 Cs ver3. 0 图像处理软件，分别测量 50
个分生孢子器和孢子的大小。采用组织分离法，从
叶片病斑的病健结合处，剪取 5 mm2 左右的小块，
用有效氯含量 4. 8% ～6%的 84 消毒液分别浸泡 40、
60、80、100 s进行表面消毒，无菌水冲洗 3 次，将
4 片相同消毒时间的组织小块置于同一 PDA 平板上
培养，将长出的真菌转接到新的 PDA 平板上，与病
叶上病原物特征一致的真菌初步视为粗茎秦艽斑枯
病病原菌，用于致病性测定。
1. 2. 3 致病性测定 取 3 盆 3 年生健康粗茎秦艽，每
盆 2 株，从 PDA平板上取真菌孢子配成浓度 1 × 106
个孢子·mL －1的孢子液，用毛笔将孢子液刷到叶片
上进行接种，另取 3 盆植株刷清水作对照。将对照
和接菌植株置于人工气候箱(上海一恒 MGA-400H
型)中，25 ℃、95%相对湿度，12 h 光照、12 h 黑
暗培养，持续观察 30 d。对发生斑枯病的病叶进行
病菌再分离，与接种菌进行形态比较，依据柯赫氏
法则确定病原菌。
1. 2. 4 病原菌的分子鉴定 从 PDA 平板上挑取菌块，
接种到含 PD培养液的三角瓶中，25 ℃、140 r·min －1
摇床培养 120 h。培养好的菌液，10 000 r·min －1离
心 10 min，取沉淀。根据 Omega D3390-02 真菌 DNA
小量提取试剂盒说明书进行 DNA 提取，以真菌
ITS4、ITS5 为引物，用 PCＲ 扩增试剂盒扩增病原菌
的 ITS 序列。PCＲ 扩增程序:95 ℃预变性 3 min，
95 ℃变性 1 min，54 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 1 min，
30 个循环，72 ℃补平 5 min，4 ℃终止反应。PCＲ
产物送生工生物进行双向测序。
测序结果在 NCBI 数据库进行 BLAST 比对，从
比对结果中，选择已公开发表的、ITS序列相似度最
高的 10 株菌，与粗茎秦艽斑枯病病原菌进行比较，
经过 CLASTALX 1. 83 进行序列比对，利用 MEGA6
软件，采用 NJ(邻接法)构建系统发育树以确定病原
菌的分类地位，系统树各分支的置信度用 bootstra
Ptest(自举检验法)检验，共进行 1000 次循环，根据
Kimura-2 参数计算各株遗传距离值。
2 结果与讨论
2. 1 病害调查结果
粗茎秦艽一般播种育苗 1 年后移栽，移栽 2 ～ 3
年后采挖，经调查，在云南丽江市玉龙县、迪庆州
维西县等主产区，1 年生粗茎秦艽很少发生斑枯病，
2 ～ 4 年生植株均发病普遍，严重地块植株发病率高
达 100%。病原菌在植株残体上越冬，来年 4 月份新
叶展开后即可见零星侵染，雨季到来后病情逐渐加
重，其中 8 至 9 月发病最严重，斑枯病在田间常与
锈病同时发生，一般不造成植株死亡，但导致叶片
大面积枯萎，影响植株生长。
病害一般从近地面老叶的叶尖、叶缘开始发生，
初生黄色、褐色小点，后扩大成近圆形不规则的病
斑，病斑中央黄色至黄褐色，边缘红褐色，呈不明
显的轮纹，外缘有靛青色的晕圈，随着病情加重，
病斑扩大连成片，造成叶片大面积枯黄死亡，后期
病斑中央产生深褐色的分生孢子器，多呈环状或片
状聚集在叶片正面，背面较少(见图 1A、B、C)。
病斑上产生分生孢子器释放出的分生孢子成为粗茎
秦艽生长期的传染源。
注:A. 田间发病症状;B. 病斑;C. 分生孢子器;D. 病叶上分生孢子。
图 1 粗茎秦艽斑枯病
2. 2 病原菌的分离与形态鉴定
通过组织分离法获得一种与叶片真菌孢子形态
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特征相似的真菌，编号 CJQJ，依据柯赫氏法则，取
CJQJ的孢子接种健康粗茎秦艽叶片，出现典型的斑
枯病症状，而对照植株健康未见发病(图 2A)。从病
斑上进行病原物的二次分离，获得与接种真菌形态
特征一致的真菌，据此确定 CJQJ 为粗茎秦艽斑枯病
病原菌。
病原菌 CJQJ在叶片病斑上的分生孢子器呈扁球
形，具 1 圆形孔口，分生孢子器初时透明，埋生于
叶表皮下，逐渐成熟后颜色加深变成暗褐色并突破
叶表皮，露出叶表皮的分生孢子器直径 75. 9 ～
230. 8 μm、平均(127. 9 ± 29. 3)μm(见图 1C)。分
生孢子针形，直或弯，两端尖，基部较圆，有 1 ～ 5
(多为 3)个隔膜，长 16. 2 ～ 29. 4 μm、平均(22. 1 ±
2. 8)μm，宽 1. 6 ～ 3. 1 μm、平均(2. 1 ± 0. 3)μm，
孢子内具油球(见图 1D)。
病原菌在 PDA 培养基上生长缓慢，25 ℃培养
20 d后的菌落直径 1. 6 cm，菌落隆起，正面紫灰色，
背面紫色，菌丝生长致密、具隔。将带菌丝的菌块
转移到新的 PDA 培养基上，2 周后能在接种菌块上
产生大量分散的分生孢子器(见图 2B 菌落中央的深
色部分)，扩散到新培养基上的菌落部分，只长菌丝
而不产生分生孢子器(见图 2B 中灰白色的部分)。
分生孢子器的形成首先是病原菌菌丝结集形成黑色
乳突状结构，再从其顶端产生近无色透明的分生孢
子器，随着体积的增加，分生孢子器颜色由无色透
明逐渐变为肉红色，无明显的孔口，成熟的孢子器
最后液化释放分生出孢子(见图 2C)。PDA培养基培
养长出的分生孢子较病叶产生的分生孢子短且分隔
较少，披针形或镰刀形，长 10. 3 ～ 21. 2 μm、平均
(14. 1 ± 2. 3)μm，宽 1. 6 ～ 3. 5 μm、(2. 6 ±
0. 4)μm，1 ～ 4 个隔，多为 1 个隔(见图 2D)。
依据寄主和真菌的形态特征，参考 《中国真菌
志》［4］，初步将粗茎秦艽斑枯病病原真菌鉴定为球壳
孢目(Sphaeropsidales)壳针孢属(Septoria)真菌小孢
壳针孢 S. microspora。
2. 3 基于 ITS序列的病原真菌鉴定
经双向测序获得粗茎秦艽斑枯病病原菌 CJQJ
533bp的 ITS序列，提交 NCBI数据库进行 BLAST比
对，同源性最高的 10 株菌均为壳针孢属 Septoria，
其中序列登录号 KC874679 的菌株 Septoria microspora
与 CJQJ菌株同源性最高，相似性达到 99%，文献记
载 KC874679 为甘肃产秦艽 Gentiana macrophylla
注:A. 致病性测定;B. 菌落特征;C. 分生孢子器;D. 分生孢子。
图 2 致病性测定与 PDA培养基上的病原菌特征
Pall. 斑枯病的病原菌［5］。
以 1 株 序 列 编 号 GU237772 的 壳 二 孢 属
(Didymella)真菌为外群，从 BLAST检索结果中，选
已公开发表、且与 CJQJITS 序列相似度最高的 10 株
菌，用 MEGA6 软件的 NJ 法构建系统发育树，结果
见图 3。粗茎秦艽斑枯病病原菌 CJQJ 与小孢壳针孢
(S. microspora)KC874679 关系最为密切，只有 2 碱
基差异，处在同一分支，据此确定 CJQJ 的分类地位
为小孢壳针孢 S. microspora，与形态鉴定结果一致。
图 3 基于真菌 ITS序列构建的系统发育树
3 讨论
壳针孢(Septoria)引起的斑枯病是栽培龙胆科植
物中较为常见的病害，鄢洪海等报道了龙胆草斑枯
病 由 S. microspora Speg. 和 S. gentianae Thum. ，
S. gentinicola Baudys et Picb 3 种真菌引起，其中
S. microspora是主要病原菌，危害性最强［6］。王艳、
李金花等分别报道了甘肃栽培秦艽 G. macrophylla、
G. spp斑枯病的病原菌分别为 S. microspore Speg. ［5］
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和 S. gentianae Thum. ［7］。球壳孢目(Sphaeropsidales)
真菌的分生孢子大小和颜色等特征在不同寄主植物
可能出现比较大的差异，目前全世界报道的壳针孢
属(Septoria)有 2000 种以上，其中有些是同物异
名［2］。在 本 研 究 中，云 南 粗 茎 秦 艽 斑 枯 病
S. microspora在病叶上的分生孢子，形态特征与 PDA
培养基上长出的孢子有较大差异，病叶上的孢子较
长、针形，分隔数多为 3，与王艳报道的甘肃产秦
艽 G. macrophylla 斑枯病病菌 S. microspora 相似［5］，
ITS序列同源性达 99%，只有 2bp 的差异，而 PDA
培养基长出的孢子较短、披针形，多为 1 个隔，与
李金花等报道的甘肃栽培秦艽 G. spp 斑枯病病原菌
S. gentianae接近［7］，二者是否为同物异名需要进一
步研究确定。
粗茎秦艽以滇西北地区种植面积最大，基本为
农户自发分散种植，病害防治做不到统防统治，无
法从源头上彻底消除病原，导致斑枯病普遍持续发
生。实践证明，适时施用合适的杀菌剂对该病具有
很好的防治效果。病害发生前喷施代森锰锌、福美
双等保护性杀菌剂进行预防，病害发生后，喷施 1
～ 2 次多菌灵、三唑酮等内吸性杀菌剂，对粗茎秦
艽斑枯病及伴生的锈病均有很好的控制作用。秋末
粗茎秦艽地上部分枯萎后，及时清理并集中烧毁干
枯残体，可有效减少越冬病原，对控制来年病害的
发生也有积极作用。
致谢:论文撰写过程中得到中国医学科学院药用植物研
究所陈君老师的亲切指导，本研究所需实验仪器得到云南省
农业科学院药用植物研究所季鹏章博士的直接帮助，在此致
以谢意!
参考文献
［1］ 国家药典委员会． 中华人民共和国药典:一部［S］． 北
京:中国医药科技出版社，2015:270-271．
［2］ 中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志:第 62
卷［M］．北京:科学出版社，1988:68．
［3］ 聂燕琼，李海彦，孙娜，等．粗茎秦艽资源研究进展［J］．
中国现代中药，2012，14(5) :37-40．
［4］ 鄢洪海，夏淑春，于莉，等． 龙胆草斑枯病的发生与病原
菌鉴定［J］．植物保护学报，1999，26(4) :315-318．
［5］ 白金铠．中国真菌志:第 17 卷·球壳目·壳二孢属壳针
孢属［M］．北京:科学出版社，2003:211-212．
［6］ 王艳．甘肃省药用植物球壳孢目真菌病害及其病原研
究［D］．兰州:甘肃农业大学，2013．
［7］ 李金花，柴兆祥，王蒂．秦艽斑枯病病原菌鉴定及生物学
特性研究［J］．中药材，2007，30(1) :3-6．
(收稿日期 2016-03-01)
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