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肾茶提取物含药血清对大鼠肾小球系膜细胞增殖及 TGF-β1 表达的影响
林志民，黄荣桂* ，李月婷，郑兴中(福建医科大学附属第二医院肾内科 泉州 362000)
摘要:目的 探讨肾茶两种不同化学提取物对大鼠肾小球系膜细胞( MCs) 增殖与 TGF-β1 分泌、TGF-β1 mＲNA表达的影响。方法 对肾茶提
取分离得到乙酸乙酯、正丁醇两种不同化学提取物，分别给大鼠灌胃后，采血制备含药血清。以肾茶提取物含药血清为干预因素，体外培养的肾
小球系膜细胞( MCs) 为研究对象，采用 CCK-8、ELISA、ＲT-PCＲ技术，探讨其对脂多糖( LPS) 诱导的系膜细胞增殖、TGF-β1 分泌及 TGF-β1 mＲNA
表达的影响。结果 不同剂量的肾茶正丁醇与乙酸乙酯提取物的含药血清均明显抑制 LPS 刺激的大鼠 MCs增殖及 TGF-β1 分泌( P ＜ 0. 01 或
P ＜ 0. 05) ;肾茶正丁醇提取物高、低剂量组与乙酸乙酯提取物高剂量组的含药血清可明显抑制 LPS 刺激的大鼠 MCs TGF-β1 mＲNA 表达( P ＜
0. 01 或 P ＜ 0. 05) 。其中，肾茶正丁醇提取物抑制作用明显优于乙酸乙酯提取物，二者同剂量比较差异有统计学意义( P ＜ 0. 01) ，且抑制作用呈
一定的剂量相关性( P ＜ 0. 01) 。结论 体外实验表明，肾茶二种提取物含药血清可抑制 MCs的异常增生及 TGF-β1 的过度表达，其中正丁醇提
取物作用优于乙酸乙酯提取物，为肾茶开发新制剂治疗肾小球疾病提供参考。
关键词:肾茶提取物;肾小球系膜细胞; TGF-β1
中图分类号:Ｒ969 文献标识码:A 文章编号:1006-3765(2013)-12-1126-0046-03
作者简介:林志民，男(1980. 11 －)。从事肾内科工作。E-mail:lindoc-
tor2006@ 163. com
通讯作者:黄荣桂。教授，主任医师。 E-mail:minnanshenyou @
126. com
肾小球系膜细胞(Mesangial cells，MCs)是肾小球基质合
成和降解的场所，系膜细胞增殖、系膜基质(ECM)增多是多
种肾小球疾病的重要病理特征。MCs 增殖与 ECM 的过度聚
积，导致疾病的发生、发展及最终肾小球硬化。在此病理过程
中，有许多细胞因子参与。其中，转化生长因子 β1(TGF-β1)
在肾小球损伤与肾脏纤维化过程中起着重要的作用〔1〕。因
此，通过抑制系膜细胞增殖及 TGF-β1 的过度表达，可能是一
种治 疗 途 径。肾 茶 Clerodendranthus spicatus (Thunb. )
C. Y. Wu又名猫须草(见封三图)，是一种民间传统中草药，临
床用于急、慢性肾炎，尿路结石、尿路感染等疾病〔2-3〕。本实验
拟观察肾茶两种不同化学提取物的含药血清对体外培养的肾
小球系膜细胞增殖与 TGF-β1 分泌、TGF-β1mＲNA 表达的影
响，比较其作用并探讨其机制。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验动物:健康清洁级雄性 SD 大鼠，体质量 150 ～
200g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号:
SCXK(沪)2007-0005。
1. 1. 2 实验药物:肾茶购自泉州市医药分公司，产地福建同
安。肾茶化学提取物由中国科学院上海药物研究所赵维民研
究员课题组提供，其中乙酸乙酯提取浸膏(240g 生药 /g 浸
膏)，正丁醇提取浸膏(416g生药 /g浸膏)。
1. 1. 3 主要试剂:ＲPMI 1640，Gibco 公司;胎牛血清(FCS)，
Hyclone公司;抗肌动蛋白抗体(山羊 IgG 多抗) ，Santa Cruz
Biotechnology公司;LPS，Sigma 公司;CCK-8 试剂盒，碧云天生
物技术研究所;大鼠 TGF-β1 ELISA试剂盒，武汉博士德公司。
Trizol试剂，Invitrogen公司;逆转录(ＲT)试剂盒，Stratagene 公
司;PCＲ试剂盒，TIANGEN BIOTECH公司。
2 方法
2. 1 大鼠 MCs培养 取雄性 SD大鼠 2 只，麻醉后无菌操作
取出双肾，分离肾皮质，分别过 80 目，120 目钢筛，用 200 目筛
网收集肾小球，胶原酶消化后置于 20% FCS ＲPMI 1640 培养
液中，在 37℃ CO2培养箱培养，原代培养 20 ～ 24d 后常规传
代，经相差显微镜、透射电镜及抗肌动蛋白抗体免疫组织化学
鉴定为系膜细胞。
2. 2 含药血清制备 取 SD雄性大鼠 20 只，按体质量随机分
为 5 组，每组 4 只，即正常对照组;肾茶正丁醇提取物高剂量、
低剂量组;肾茶乙酸乙酯提取物高剂量、低剂量组。肾茶各提
取物的低、高剂量按相当于临床剂量的 2. 5 倍(生药 2. 5g·
kg －1·d －1)、10 倍(生药 10g·kg －1·d －1)，用生理盐水制成
混悬液灌胃，对照组给予同体积生理盐水灌胃。各组给药体
积为 10mL /(kg·d) ，于固定时间每日灌胃 1 次，连续灌 7d，
并于第七天重复给药 2 次，间隔时间 2h，末次给药后 1h 无菌
操作心脏采血，离心 1500rpm × 6min，分离血清，56℃水浴
30min灭活，0. 2μm微孔滤膜过滤，分装，-20℃保存备用。
2. 3 MCs 增殖的测定 取第三代 MCs，用 20% FCS ＲPMI
1640培养液，以密度 1 × 105 /mL，按每孔 100μL 接种于 96 孔
培养板中，共分 6 组，每组设 6 个复孔，培养 48h后换为 0. 5%
FCS ＲPMI 1640 培养 24h，使细胞同步化后去上清，分别加入
100μL含药血清的 ＲPMI 1640，各组血清终浓度为 10%:正常
组(5%正常大鼠血清、5% FCS)，LPS 对照组(5%正常大鼠血
清、5% FCS、LPS 10μg·mL －1) ，肾茶正丁醇提取物高剂量组
(5%正丁醇高剂量血清、5% FCS、LPS 10μg·mL －1)，肾茶正
丁醇提取物低剂量组(5%正丁醇低剂量血清、5% FCS、LPS
10μg·mL －1)，肾茶乙酸乙酯提取物高剂量组(5%乙酸乙酯
高剂量血清、5% FCS、LPS 10μg·mL －1)，肾茶乙酸乙酯提取
物低剂量组(5%乙酸乙酯低剂量血清、5% FCS、LPS 10μg /
mL)。置于 37℃、5% CO2 饱和湿度条件下培养 48h 后，各孔
加入 CCK-8 试剂 10μL，于培养箱中孵育 2h后，酶标仪测定波
长 450nm各孔的吸光度 A450 值。同时经台盼蓝排斥试验，
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海峡药学 2013 年 第 25 卷 第 12 期
表明各组含药血清对系膜细胞无毒性作用。
2. 4 ELISA法检测 TGF-β1 蛋白水平 细胞处理方法及分组
同 2. 3，每组设 5 个复孔，细胞同步化后去上清，分别加入各
组受试含药血清培养液干预，每孔 200μL，培养 48h后收集上
清液，采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法检测 TGF-β1
含量，按试剂盒说明书进行，根据标准品的标准曲线求出相应
的含量。
2. 5 ＲT-PCＲ测 TGF-β1mＲNA的表达 取传第三代 MCs，按
6 × 105 /孔的密度接种于 6 孔板中，分组同上，每组设 3 个复
孔，细胞同步化后去上清，分别加入受试含药血清培养液干
预，每孔 2mL，培养 48 h后以 Trizol抽提细胞总 ＲNA。使用逆
转录试剂盒，以 OligodT 为引物，取总 ＲNA3μg 进行逆转录反
应(所用 ＲNA 的 OD260 /OD280均在 1. 8 ～ 2. 0 之间) ，之后以
25μl总反应体系进行体外 PCＲ 扩增，以 β-actin 作为内参。
PCＲ引物序列由上海生物工程有限公司合成，TGF-β1 上游引
物:5-CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC-3，下游引物:5-
CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC-3，扩增片断为 296bp。
内参 β-actin 基因上游引物:5-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-
3，下游引物:5-GTCACGCACGATTTCCCGCT-3，扩增片断为
619bp。反应条件:94℃预变性 5min 后，TGF-β1 进行 30 个循
环:94℃ 30s，61. 5℃ 30s，72℃ 30s;β-actin 进行 25 个循环:
94℃ 30s，64℃ 30s，72℃ 30s;最后 72℃延伸 7min。PCＲ产物
于 1. 5%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统拍照，进行灰度扫
描。β-actin值校正，得出 TGF-β1 /β-actin条带的光密度比值。
3 统计学方法
用 SPSS 11. 5 软件进行分析，计量资料以(x ± s)表示，多
组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用 SNK-q 检
验，P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。
4 结果
4. 1 肾茶提取物对大鼠 MCs 增殖的影响 与正常组比较，
LPS作用下 MCs 增殖明显增加，差异有统计学意义(P ＜
0. 01);药物干预后各组细胞增殖受抑制，与 LPS 对照组比较
差异有统计学意义(P ＜ 0. 01) ，表明肾茶正丁醇提取物与乙
酸乙酯提取物含药血清均能抑制 LPS 诱导的系膜细胞增殖，
其中，肾茶正丁醇提取物较乙酸乙酯提取物抑制作用强，二者
同剂量比较差异有统计学意义(P ＜ 0. 01)(见表 1)。
表 1 肾茶各提取物含药血清对 MCs增殖的影响(x ± s)
组别 n A450
正常组 6 0. 6333 ± 0. 0103
LPS对照组 6 0. 8157 ± 0. 0210*
正丁醇提取物高剂量组 6 0. 6627 ± 0. 0138△
正丁醇提取物低剂量组 6 0. 6813 ± 0. 0246△
乙酸乙酯提取物高剂量组 6 0. 7092 ± 0. 0168△▲
乙酸乙酯提取物低剂量组 6 0. 7295 ± 0. 0264△
注:与正常组比较，* P ＜ 0. 01;与 LPS对照组比较，△P ＜ 0. 01;与正丁
醇高剂量组比较;▲P ＜ 0. 01;与正丁醇低剂量组比较P ＜ 0. 01。
4. 2 肾茶提取物对大鼠 MCs TGF-β1 分泌的影响 LPS作用
下 MCs TGF-β1 分泌明显升高，与正常组比较，差异有统计学
意义(P ＜ 0. 01)，药物干预后各组细胞 TGF-β1 分泌受抑制，
与 LPS对照组比较差异有统计学意义(P ＜ 0. 01 或 P ＜
0. 05);其中，肾茶正丁醇提取物 TGF-β1 分泌较乙酸乙酯提
取物降低，差异有统计学意义(P ＜ 0. 01) ，且各组肾茶提取物
的高、低剂量组比较差异有统计学意义(P ＜ 0. 01)(见表 2) ，
抑制强度呈剂量依赖性。而且肾茶正丁醇提取物抑制作用较
乙酸乙酯提取物强。
表 2 肾茶各提取物含药血清对 MCs TGF-β1 分泌的影响(x ± s)
组别 n TGF-β1(ng·L －1)
正常组 5 263. 0588 ± 10. 1324
LPS对照组 5 420. 0000 ± 19. 8984＊＊
正丁醇提取物高剂量组 5 317. 7648 ± 12. 5779△
正丁醇提取物低剂量组 5 354. 8234 ± 11. 4473△▲
乙酸乙酯提取物高剂量组 5 371. 6472 ± 10. 3370△▲★
乙酸乙酯提取物低剂量组 5 399. 0590 ± 19. 0518＊★
注:与正常组比较，＊＊P ＜ 0. 01;与 LPS对照组比较，* P ＜ 0. 05，△P ＜
0. 01;与正丁醇高剂量组比较▲ P ＜ 0. 01;与正丁醇低剂量组比
较P ＜ 0. 01，乙酸乙酯高、低剂量比较★P ＜ 0. 01
4. 3 肾茶提取物对大鼠 MCs TGF-β1 mＲNA 表达的影响
ＲT-PCＲ半定量分析显示，LPS对照组与正常组比较差异有统
计学意义(P ＜ 0. 01)，肾茶正丁醇提取物高、低剂量组与乙酸
乙酯提取物高剂量组含药血清均能抑制 LPS 诱导的 TGF-
β1mＲNA表达的上调，差异有统计学意义(P ＜ 0. 01) ，前者优
于后者(P ＜ 0. 01)。乙酸乙酯提取物低剂量组与 LPS 对照组
比较差异无统计学意义(P ＞ 0. 05)，表明在一定的剂量范围
内才具有抑制作用。肾茶正丁醇及乙酸乙酯提取物抑制作用
呈一定的剂量依赖关系(P ＜ 0. 01)(见表 3、图 1)。
表 3 各组 MCs TGF-β1mＲNA的表达(x ± s)
组别 n TGF-β1 /β-actin
正常组 3 1. 1564 ± 0. 0215
LPS对照组 3 1. 8364 ± 0. 0506＊＊
正丁醇提取物高剂量组 3 1. 3132 ± 0. 0386△
正丁醇提取物低剂量组 3 1. 5364 ± 0. 0755△▲
乙酸乙酯提取物高剂量组 3 1. 5666 ± 0. 0186△▲★
乙酸乙酯提取物低剂量组 3 1. 7562 ± 0. 0523＊★
注:与正常组比较，＊＊P ＜ 0. 01;与 LPS 对照组比较，△P ＜ 0. 01;* P ＞
0. 05;与正丁醇高剂量组比较▲ P ＜ 0. 01;与正丁醇低剂量组比
较P ＜ 0. 01;乙酸乙酯高、低剂量比较★P ＜ 0. 01
图 1 肾茶各组分对系膜细胞 TGF-β1 mＲNA表达的影响
注:1:正常组 2:LPS 对照组 3:正丁醇高剂量组 4:正丁醇低剂量
组 5:乙酸乙酯高剂量组 6:乙酸乙酯低剂量组
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Strait Pharmaceutical Journal Vol 25 No. 12 2013
5 讨论
5. 1 肾茶性凉味苦，在民间作为草药用于治疗急、慢性肾炎，
泌尿系结石、尿路感染等症，但其药理机制仍不明确。前期研
究发现肾茶水煎剂能够抑制肾小球 MCs 增殖及 LPS 诱导的
MCs致炎因子 IL-1β的产生〔4〕，本实验仍然采用 MCs 体外培
养技术，以 LPS作为炎症刺激物，探讨肾茶的正丁醇、乙酸乙
酯提取物对 MCs增殖及 TGF-β1 表达的影响。本实验采用含
药血清方法，是一种模拟药物在体内的过程，能较客观反映中
草药的药效和机理〔5〕。实验结果显示:高、低剂量肾茶两种
提取物含药血清能明显抑制 LPS 刺激条件下 MCs 增殖及
TGF-β1 的表达，在一定范围内随着剂量的增大，抑制作用增
强，呈现量效关系。其中，肾茶正丁醇提取物抑制作用优于乙
酸乙酯提取物，分析其机制可能是正丁醇提取物主要含有肾
茶的水溶性化学成分，而乙酸乙酯提取物主要含有肾茶的脂
溶性化学成分，可以推测肾茶的水溶性成分抑制 MCs增殖及
TGF-β1 表达的作用明显强于脂溶性成分，为肾茶开发新制剂
治疗肾小球疾病提供依据。
5. 2 TGF-β在系膜增殖的过程中具有重要作用，其通过自分
泌和旁分泌作用直接促进系膜细胞增殖、肥大，增加细胞外基
质中纤维连接蛋白、硫酸肝素糖蛋白和胶原的合成〔6〕，致细
胞基质的过度分泌、积聚，最终引起肾小球硬化。炎症刺激可
使肾小球系膜细胞分泌多种炎症性细胞因子及其他炎症介
质，而细胞因子又可通过自分泌和旁分泌作用方式使炎症效
应不断放大〔7〕。在实验中我们观察到，LPS 可明显促进 MCs
增殖及 TGF-β1 mＲNA的表达，肾茶提取物含药血清却可以显
著抑制该过程，分析其原因可能是系膜细胞受 LPS 刺激后分
泌多种能促进细胞增殖及 TGF-β的表达有关的细胞因子，如
PDGF、IL-6 等。同时 TGF-β本身具有自我放大作用〔8〕，可刺
激 MCs合成和分泌更多的 TGF-β，从而促进其基因表达水平
升高;而肾茶提取物含药血清在基因水平上抑制 TGF-β1 的
表达，减少肾小球 TGF-β的含量，减弱其放大作用，从而减轻
MCs增殖，减少系膜基质增多，从而达到延缓肾小球硬化的发
生。
总之，本实验结果显示肾茶二种提取物含药血清明显抑
制 LPS刺激条件下 MCs 增殖及 TGF-β1 的表达，对肾小球疾
病可能具有治疗价值。且正丁醇提取物药效明显强于乙酸乙
酯提取物，对肾茶开发新制剂具有一定的参考意义。
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酸枣仁总皂苷化学成分及药理活性初探
邱 麒(福建卫生职业技术学院 福州 350101)
摘要:酸枣仁总皂苷在酸枣仁中含量较高、成分复杂、药理作用广泛的有效成分之一，具有镇静安神、降低血压、抗心肌缺血、降血脂和防治动脉
粥样硬化、抗脂质过氧化、保护脑组织等作用。
关键词:酸枣仁;总皂苷; 药理活性
中图分类号:Ｒ28271;Ｒ969. 4 文献标识码:B 文章编号:1006-3765(2013)-12-1124-0048-02
作者简介:邱麒，女(1985 －)。硕士研究生，专业:中药学。联系电
话:15395903316，E-mail:shxqiuqi366@ qq. com
基金资助:福建省教育厅 A 类科技项目(JA12432) ，福建省教育厅 B
类科技项目(JB12298)。
酸枣仁为鼠李科枣属植物酸枣 Ziziphus jujubes Spinosa
(Bunge)HuexH. F. Chow 的干燥种子，别名枣仁、酸枣核，味
甘，性平，有宁心安神，敛汗，生津，养肝功能。用于虚烦不眠，
惊悸怔松，头晕眼花等症。有关酸枣仁的化学成分、药理作
用。酸枣仁总皂苷又是酸枣仁中含量高，化学成分复杂及药
理作用广泛的一种有效成分。
1 酸枣仁总皂苷化学成分
普遍认为，皂苷是酸枣仁的有效镇静成分，为三萜类化合
物，在结构上与人参、三七的皂苷类有效成分较为接近。一般
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