全 文 ：收稿日期: 2009 - 03 - 29
基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目 ( 11511357 )
作者简介:宋立群 ( 1957 - ) ,男, 山东黄县人,主任医师,博士研究
生导师,博士,研究方向:中医药治疗肾系疾病的研究。
证发于冬初者,先于八九月未寒之时,用大承气汤下其热,
至冬寒时无热可包, 此为妙法。0
( 3)冬病夏治。冬秋所发之哮病, 采取冬病夏治之法,
于夏月三伏中,用白芥子敷之,详见外治法。
( 4)节厚味、忌饮食。由于饮食不节而来的哮病, 在缓
解期应用此法。5诸证提纲# 哮证6中曰: /欲拔病根,必断
厚味0。
3. 2 外治法
3. 2. 1 针法和灸法治疗哮病 宋5针灸资生经6曰: /因此
与人治哮喘,只缪肺俞0, /凡有哮与喘者, , ,皆为缪刺肺
俞,令灸而愈0。
3. 2. 2 导引按摩法治疗哮病 清5沈氏尊生书6中云: /导
引 (哮喘同 ) , ,用手法于十一椎下脊中穴, 掐之六十四
度,擦亦如数, 兼行后功, 喘自然安 0, /运动, ,以手摩擦
两乳下数遍,后擦背、擦两肩,定心咽津降气, 以扶其喘0。
3. 2. 3 外敷穴位法预防哮病复发 清5张氏医通# 诸气门
下# 喘6云: /冷哮, ,夏月三伏中, 用白芥子涂法,往往获
效。方用白芥子净末一两,延胡索一两, ,姜汁调涂肺俞、
膏盲、百劳等穴。, ,十日后涂一次, 如此三次, 病根去
矣。0此法属于冬病夏治的范围, 但因药多为辛热刺激之
品,则热哮病人当慎用或忌用。
参考文献
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虫草肾茶胶囊对肾小球系膜细胞增殖及分泌 Ô型胶原的影响
宋立群,金丽霞,宋业旭
(黑龙江中医药大学附属第一医院, 黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要:目的:研究虫草肾茶胶囊对培养在高糖条件下系膜细胞 ( HMC )增殖及细胞上清液中胶原纤维 ( C ol
- IV )的表达影响, 探讨其在糖尿病肾病 ( DN )防治中的意义。方法: 利用四甲基偶氮唑蓝 ( MTT )比色法动态观
察各种处理因素的作用下各组 HMC增殖情况 ;酶联免疫吸附试验 ( ELISA )测定经体外培养的人肾小球系膜细胞
在各种处理因素的作用下上清液中 IV型胶原的表达情况, 并以福辛普利为对照。结果:高糖能明显刺激体外培
养的 HM C增殖, 同时促进 HMC分泌 C ol - IV (P < 0. 05或 P < 0. 01)。而虫草肾茶胶囊能抑制 HMC增殖及 HMC
分泌 Co l - IV,并呈一定量效关系 (P < 0. 05或 P < 0. 01), 且某些方面明显优于福辛普利。结论:高糖可促进 HMC
增殖及 Co l - IV分泌, 虫草肾茶胶囊能明显抑制高糖条件下 HMC增殖及其分泌 Co l - IV, 从而发挥预防肾小球纤
维化及硬化的发生、发展,进而延缓 DN的进展。
关键词:虫草肾茶胶囊;人肾小球系膜细胞; 增殖; IV型胶原纤维
中图分类号: R2851 5 文献标识码: A 文章编号: 1673 - 7717( 2009) 09 -1811 - 03
E ffects ofChongcao Shencha Capsule on the P ro life ra tion ofHuman
Mesang ia l Cells and Expression of Collagen Type IV in H igh G lucose
SONG L i-qun, JIN L i-x ia, SONG Ye-xu
( The FirstH osp italA ff iliated to H eilongjiang Un iversity ofC hinese Medicine, H arbin 150040, H eilongjiang, Ch ina)
Abstrac t:Ob jective: To investiga te the e ffect of Chongcao Shencha capsu le on hum anm esang ia l ce ll( HMC ) pro life ra-
tion and the expression o f collagen type IV ( Co l - IV ) in v itro under h igh g lucose. M ethod s: The th ia zoly l blue tetrazo li-
um brom ide (M TT) co lorime tric me thod w as used to observe the human m esang ia l ce ll pro lifera tion; Enzym e linked im -
m unoadso rden t assay ( EL ISA ) w as adopted to de term ine the expression o f co llagen type IV in cu ltu red human m esang ial
ce lls, and estab lish the Fo sinopril Sodium g roup. Results: In v itro cu ltured hum an m esang ia l ce llsw ere obviou sly p ro lifer-
a ting unde r the stimu lation of high g lucose, w hich a lso promo te Co l IV secre tion by hum an mesang ia l cells (P < 0. 05 o r
P < 0. 01); but Chongcao Shencha capsule can inhib itcHMC s pro life ra ting and sec re ting Co l IV in a dose e ffec tm anne r
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DOI：10.13193/j.archtcm.2009.09.21.songlq.057
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(P < 0. 05 o rP < 0. 01), and in som e respec t the Chongcao Shencha capsule is mo re e ffec tive than the Fo sinopril Sodi-
um. Conclusion: H igh g lucose can p rom o te HMC pro lifera tion and secre tion o f C ol IV, but Chongcao Shencha capsu le
could inhib it i,t w hich could be he lpfu l for preven ting o f the progression o f diabetic nephropathy.
Keyw ords: Chongcao Shencha capsule; hum an m esang ia l ce l;l p ro liferation; co llagen type IV
糖尿病肾病 ( d iabeticneph ropa thy, DN )是 1、2型糖尿病
的慢性微血管并发症之一, 为引起终末期肾病的最常见病
因。系膜细胞是肾小球的固有细胞, 在肾小球中起着维持
肾毛细血管球稳定,参与吞噬与免疫,以及分泌系膜区基质
蛋白的作用。糖尿病引起肾病最早期的改变就包括了系膜
细胞数量增多,系膜细胞肥大 ,并由此导致肾小球滤过系数
增加,加重肾脏高滤过状态以及过度分泌基质蛋白,继而引
起肾小球纤维化,最终导致肾小球硬化症的发生。肾小球
系膜细胞是糖尿病肾病各种致病因子作用的主要靶细胞,
而长期高血糖是引起糖尿病肾病的主要原因。因而研究在
高糖条件下培养肾小球系膜细胞生物学功能的改变及干预
治疗,对于糖尿病肾病的防治具有重要意义。
虫草肾茶胶囊由发酵冬虫夏草菌粉、猫须草 (别名肾
茶 )、黄芪、制大黄、草豆蔻、水蛭 6味药物组成,具有健脾益
肾、化瘀排毒、芳化湿浊等作用。早期动物实验证实它可以
减轻蛋白尿,达到肾保护的目的 [1], 但其对 MC的作用机制
在体实验条件下未能阐明。本实验采用血清药理学方法和
MC体外培养技术观察虫草肾茶胶囊对高糖培养的人系膜
细胞 ( HMC)增殖及分泌 Co l - IV的影响, 以期从细胞生物
学水平探讨虫草肾茶胶囊防治 DN的作用机理, 丰富发展
中医药防治 DN的理论认识,为进一步提高 DN的中医药诊
治水平提供依据。
1 材料和方法
1. 1 主要实验材料及试剂
人肾小球系膜细胞株由哈尔滨医科大学附属第二医院
肾内科焦军东教授惠赠。虫草肾茶胶囊由黑龙江中医药大
学药学院协助制备。发酵冬虫夏草菌粉由江西金水宝制药
有限公司提供,其余药材饮片购自黑龙江中医药大学附属
第一医院。福辛普利 (蒙诺 ) : 规 格: 10mg /片; 批号:
070511。由中美上海施贵宝制药有限公司生产。 IV型胶
原 ELISA试剂盒:上海西唐生物科技有限公司; 改良型 RP-
M I -1640培养基, HyC lone公司 (美国 ) , 购自赛默飞世尔
生物化学制品 (北京 )有限公司。 4 -甲基偶氮唑蓝
(M TT )、胎牛血清: HyC lone;胰酶 :美国 Sigm a公司; 一次性
塑料培养瓶, 96孔板: 美国 Co rning公司; 37e 5% CO2恒温
培养箱:美国 REVCO 公司; 倒置显微镜: CKZ日本 Olym -
pus; 4e 冰箱:青岛海尔股份有限公司;电热恒温振荡水槽:
DKZ系列,上海一恒科学仪器有限公司; 液氮生物容器:成
都液氮容器厂;净化工作台:苏州净化。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 含药血清的制备 健康 SD大鼠 50只, 随机分为 5
组,即: 正常组 (不给药 )、虫草肾茶低剂量组 (相当于每只
用生药 0. 375g /m L)、虫草肾茶中剂量组 (相当于生药每只
用 0. 75g /mL )、虫草肾茶高剂量组 (相当于每只用生药 1. 5
g /mL )、福辛普利组 (配制成浓度为 0. 375m g /mL的水溶
液 ), 各给药组大鼠每日每次给与相应药液 4mL, 1次 /d灌
胃,各组大鼠自由饮食, 连续 7天, 在末次灌胃 2h后麻醉,
在无菌条件下经腹主动脉采血, 离心取血清, 56e 水浴
30m in灭活补体,经 0. 22Lm孔径的针头滤器过滤除菌, 分
装冻存备用。
1. 2. 2 系膜细胞的培养 将人肾小球系膜细胞株接种在
装有适量改良型 RPM I - 1640培养液 (含 10%胎牛血清 )
的培养瓶中, 置 37e 、含 5% CO2 饱和湿度的孵育箱内培
养,细胞生长状况良好, 呈单层贴壁生长。每 1~ 2天换液
1次, 每 2~ 3天以 0. 25%胰蛋白酶消化并计数后传代。采
用对数生长期的细胞制成一定浓度的单细胞悬液,接种于
96孔板置于培养箱培养。待细胞基本融合, 换用无血清
( 015% FCS)改良型 RPM I - 1640培养液同步 24h, 然后随
机分组,分别培养 24h、48h。
1. 2. 3 实验分组 对照组 (常规培养, 仅 10% 正常大鼠血
清 )、高糖组 (常规培养, 10%正常大鼠血清 + 30mm ol /L D
-g lucose)、虫草肾茶低剂量组 ( 10%虫草肾茶低剂量含药
血清 + 30mm o l /L D - g lucose)、虫草肾茶中剂量组 ( 10%虫
草肾茶中剂量含药血清 + 30mm o l /L D - g lucose )、虫草肾
茶高剂量组 ( 10%虫草肾茶高剂量含药血清 + 30mm o l /L D
- g lucose )、福辛普利组 ( 10% 福辛普利含药血清 +
30mm o l /L D - g lucose)。
1. 2. 4 MTT法检测不同处理因素对肾小球系膜细胞增殖
的影响 长满的 HMC用 0. 25% 胰蛋白酶消化后, 再用培
养液稀释为单个细胞悬液,以 4 @ 104细胞密度接种于 96孔
培养板。细胞完全贴壁后 , 用无血清的 RPM I - 1640培养
液同步化细胞 24h, 实验分组同 1. 2. 3,每组浓度设 6个复
孔,共种 2个板 ( 24h和 48h各一块板 ), 其他条件相同。将
培养板移入 CO
2
孵箱中, 分别培养到预定时间后, 每孔加
入 MTT溶液 15LL, 37e 避光继续孵育 4h, 终止培养。吸去
孔内上清液,每孔加入 150LL DMSO溶解液振荡 10m in, 待
结晶物充分溶解后, 酶标仪上检测各孔光吸收值 ( A490) ,
将所得结果列入表 1。
1. 2. 5 EL ISA法检测细胞培养液上清Ô 型胶原含量 长
满的 HMC用 0. 25% 胰蛋白酶消化后种入 48孔板, 用含
10%胎牛血清的 RPM I - 1640培养液培养 24h后进入实
验,实验分组同上, 分别培养 24h、48h后终止培养, 收集上
清液,离心后 - 80e 保存待测。操作步骤严格按照试剂盒
说明进行。
1. 2. 6 统计学处理 实验数据用 SPSS 13. 0统计软件进
行统计分析,以 (€x ? s )表示, 多组数据间比较用 ANOVA分
析,以 P < 0. 05为差异有统计学意义。
2 结 果
2. 1 各种处理因素作用下 HMC增殖的情况
由表 1可见, 与正常对照组比较, 高糖 ( 30mm o l /L)对
人肾小球系膜细胞在培养 24h、48h时段均有刺激系膜细胞
增殖的效应,有明显差异 (P < 0. 01)。在培养的 24h时段,
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与高糖组比较,虫草肾茶中剂量组、虫草肾茶低剂量组及福
辛普利组 HMC的增殖未受到明显抑制 (P > 0. 05), 而虫草
肾茶高剂量组 M TT值降低, 可有效抑制 HMC的增殖 (P <
0. 05)。但随着作用时间的延长, 48h时段, 虫草肾茶高、
中、低剂量组及福辛普利组均可有效的抑制 HMC增殖 ( P
< 0. 05, P < 0. 01), 且虫草肾茶高剂量组在抑制系膜细胞
增殖方面优于福辛普利组。
表 1 各种处理因素作用于 HMC 24h和 48h时
HMC增殖情况 ( n = 6, €x ? s )
组别 24h 48h
对照组 0. 324 ? 0. 059 0. 937 ? 0. 093
高糖组 0. 542 ? 0. 116v v 1. 286 ? 0. 069v v
虫草肾茶高剂量组 0. 379 ? 0. 057* 1. 005 ? 0. 065* *
虫草肾茶中剂量组 0. 518 ? 0. 106v v 1. 161 ? 0. 074v v*
虫草肾茶低剂量组 0. 539 ? 0. 079v v 1. 204 ? 0. 057v v*
福辛普利组 0. 446 ? 0. 099v 1. 071 ? 0. 071v* *
注:同时间与对照组比较, v P < 0. 05, v v P < 0. 01;同时间与
高糖组比较, * P < 0. 05, * * P < 0. 01。
2. 2 ELISA法检测细胞培养液上清Ô 型胶原含量
表 2 各种处理因素作用于 HMC在 24h和 48h时
培养液中 C ol IV的含量 ( ng /m L, n= 4, €x ? s)
组别 24h 48h
对照组 46. 61 ? 2. 41 49. 25 ? 2. 88
高糖组 52. 73 ? 2. 21v v 63. 22 ? 3. 62v v
虫草肾茶高剂量组 48. 23 ? 1. 56* 50. 13 ? 2. 38* *
虫草肾茶中剂量组 50. 30 ? 2. 83 54. 67 ? 3. 30v*
虫草肾茶低剂量组 51. 37 ? 2. 32v 56. 13 ? 2. 39v*
福辛普利组 50. 22 ? 2. 35 52. 69 ? 2. 69* *
注:同时间与对照组比较, v P < 0. 05, v v P < 0. 01;同时间与
高糖组比较, * P < 0. 05, * * P < 0. 01。
由表 2可见,在实验的 48h以内, 高糖可刺激Ô 型胶原
的合成 (P < 0. 01), 对照组随着培养时间的延长Ô 型胶原
的合成亦增加。在药物作用的 24h时段, 仅虫草肾茶高剂
量组对Ô 型胶原的合成有明显抑制作用 (P < 0. 05); 在药
物作用的 48h时段,虫草肾茶高、中、低剂量组及福辛普利
组均可对Ô 型胶原的合成有明显的抑制作用 (P < 0. 05, P
< 0. 01)。同一时间随着作用浓度的增加,对 Ô 型胶原合成
的抑制作用增加;同一浓度的虫草肾茶胶囊随着作用时间
的延长,对Ô 型胶原合成的抑制作用亦加强, 作用具有时
间、剂量依赖效应。
3 讨 论
糖尿病肾病是慢性肾功能衰竭的常见病因, 也是威胁
糖尿病患者生命的严重并发症, 糖尿病肾病早期表现为肾
小球系膜细胞增生,小管间质扩张,肾小球系膜区和小管间
质细胞外基质积聚,伴随出现蛋白尿及肾小球滤过率降低,
最终导致肾小球硬化及肾小管间质纤维化。以往研究已证
实,糖尿病肾病晚期的肾小球硬化与早期肾脏肥大密切相
关 [2 ]。DN的基本病理改变包括肾小球肥大、ECM增多和
肾小球硬化。异常的 ECM 积聚主要表现为 FN、Ô 型胶原
以及 LN等过度增生。实验证明, 无论是糖尿病动物模型
还是体外高糖环境培养的肾小球系膜细胞, 高糖时 ECM的
合成是增加的,包括Ñ 型、Ó 型、Ô 型胶原以及 LN、FN等,
被认为与 PKC系统和 (或 ) TGF -B1激活有关 [3 ]。
系膜组织是肾小球毛细血管之间的间质组织, 主要由
MC及 ECM 组成。研究发现, 进行性肾小球疾病的初期阶
段,大多数先出现系膜细胞增殖, 随后出现 ECM增加, 提示
ECM增多与系膜细胞增殖有关。MC的增殖引起 ECM (如
胶原蛋白、LN等成分 )合成增加, 在肾小球损害,硬化中起
着重要作用 [4 - 5 ]。所以抑制系膜细胞增殖, 减少 ECM 堆
积,是延缓肾小球疾病的进展, 防止肾小球硬化的重要环
节。
研究证实, MC是肾小球固有细胞中反应最活跃的细
胞,系膜基质是 MC生存的微环境, 在调节各种细胞因子对
MC的效应中起重要作用。C ol - IV是一种基膜胶原, 为基
底膜的基本成分。血中 Co l - IV和 LN水平可反映肾小球
硬化和肾小管间质病变的状况 [6]。 Co l - IV型胶原合成分
泌 /降解的异常,则会导致 Co l - IV型胶原在肾小球内的异
常积聚,发生肾小球硬化。为进一步从细胞生物学水平探
讨虫草肾茶胶囊的作用原理, 本实验采用人肾小球系膜细
胞体外培养技术,利用高糖作为刺激因子, 同时用福辛普利
作为对照,观察虫草肾茶胶囊对 MC的影响。
实验结果显示,经高糖刺激后, 系膜细胞增殖明显 , Co l
- IV的分泌量显著增加,与对照组相比有显著性差异 (P <
0. 05, P < 0. 01), 提示高糖不仅能够明显刺激系膜细胞增
殖,而且能明显促进系膜细胞分泌 C ol - IV增加。虫草肾
茶胶囊及福辛普利两种药物血清对高糖刺激下的系膜细胞
增殖有明显的抑制作用, 并能抑制高糖刺激下 Co l - IV的
分泌。其中虫草肾茶胶囊血清对 MC的抑制作用优于福辛
普利血清。这一结果提示系膜细胞是虫草肾茶胶囊发挥治
疗作用的重要靶细胞。阻滞高糖的损伤作用,抑制系膜细
胞增殖,减少 ECM积聚, 可能是虫草肾茶胶囊治疗肾小球
疾病的主要途径,也是延缓肾小球硬化的主要作用机制之
一。同时也提示虫草肾茶胶囊不仅可用于治疗糖尿病肾
病,另外对防治肾小球损伤的进行性发展及肾功能进行性
损害具有重要意义。其作用机制值得我们进一步深入研
究。
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