全 文 ：第 31 卷 第 8 期
2 0 1 3 年 8 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 31 No． 8
Aug． 2 0 1 3
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角花胡颓子提取物对荷瘤鼠肿瘤细胞凋亡的影响
王琪1，魏娜2，罗晓庆1，王慧1，官杰1
(1 齐齐哈尔医学院医学技术学院，黑龙江 齐齐哈尔 161042;2 海南医学院药学系，海南 海口 571101)
摘 要:目的:探讨角花胡颓子提取物( JHT) 的抑瘤机制，为其开发应用提供实验依据。方法:计算抑瘤率，
电镜观察肿瘤细胞超微结构。原位杂交法检测 Survivin mＲNA表达。结果: GFW抑瘤率为 39． 02%，透射电镜观
察到 JHT作用下的肿瘤细胞凋亡的形态学改变，可见凋亡细胞及典型凋亡小体形成。JHT抑制肿瘤细胞 Survivin
表达，与模型组比较，差异有统计学意义。结论:角花胡颓子提取物具有抑瘤作用，可诱导肿瘤细胞凋亡，其机制
可能与下调 Survivin mＲNA表达相关。
关键词:角花胡颓子提取物;凋亡; Survivin mＲNA
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标志码:A 文章编号:1673 － 7717( 2013) 08 － 1693 － 02
Influence of JHT on Tumor Apoptosis of Tumor － bearing Mice
WANG Qi1，WEI Na2，LUO Xiaoqing1，WANG Hui1，GUAN Jie1
(1． Department of Medical Technology，Qiqihaer Medical College，Qiqihaer 161042，Heilongjiang，China;
2． School of Pharmaceutical Sciences，Hainan Medical University，Haikou 571101，Hainan，China)
Abstract:Objective:To study the influence of JHT on tumor apoptosis and to apply the experimenting basis of JHT＇s
developing and utilizing． Methods:The S180 mice model was used to detective the inhibiting effects of GFW，observing the
ultrastructural change by electron microscopy． The mＲNA expression of Survivin was evaluated by situ hybridization． Ｒe-
sults:For S180 sarcoma，the inhibiting ratio of JHT was 39． 02% ． Some typical apoptotic cells and apoptotic bodies were
observed through electron microscope． Survivin mＲNA was markedly declined in the JHT group when compared with the
model group (P ＜ 0. 01 )． Conclusion:JHT induces the tumor cell apoptosis，its mechanism may be closely related with
adjusting expression levels of Survivin gene．
Key words:JHT;apoptosis;Survivin mＲNA
收稿日期:2013 － 03 － 08
基金项目:黑龙江省教育厅面上项目(11551556)
作者简介:王琪(1975 －) ，女，硕士研究生，研究方向:中药抗肿瘤
的研究。
通讯作者:官杰(1967 －) ，女，教授，研究方向:肿瘤免疫研究。
角花胡颓子 Elaeagnus gonyanthes Benth．，别名假甜酸，
是胡颓子科胡颓子属植物，为攀援状灌木，分布在广东、广
西、湖南、云南、海南等地。是黎族地区常用药之一。文献
报道［1］该科植物中主要含有挥发油，生物碱，黄酮等类型
化合物，具有一定的抑癌、抗癌功效。但对其抑瘤机理的研
究并不深入。本文拟观察角花胡颓子提取物诱导肿瘤细胞
的凋亡机制，为其临床应用提供理论依据和实验依据。
1 材料与方法
1． 1 主要仪器和试剂
原位杂交试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。
OLYMPUS显微镜(日本)、HIMAS － 2000 多媒体彩色病理
图文分析系统(同济医大)。
1． 2 实验动物 40 只昆明小鼠，体重(20 ± 2)g，雌雄各
半，由齐齐哈尔医学院实验动物中心提供。
1． 3 瘤株 小鼠 S180瘤株，由黑龙江省肿瘤研究所提供。
1． 4 药物 角花胡颓子提取物由海南医学院热带药用植
物研究开发实验室提供。环磷酰胺(Cylophosphamide，
CY) ，天津金世制药有限公司，批准文号:国药准字
H12021006。
1． 5 动物分组及给药方法 造模后将荷瘤鼠随机分为 3
组，每组 10 只，分别为模型组、中药组、CY组，另取 10 只未
荷瘤小鼠作为正常对照。模型组(Model group) :生理盐水
灌胃 0． 2 mL /10 g·d;中药组(group) :角花胡颓子提取物
灌胃 0． 2 mL /10 g·d;环磷酰胺组(CY group) :腹腔注射
CY 20 mg /kg·d。接种后次日给药，各组每天给药一次，连
续 10 d。
1． 6 角花胡颓子提取物对 S180小鼠瘤重的影响 停药后
次日称取小鼠体重，脱椎处死小鼠，取瘤块称重，计算抑瘤
率。
1． 7 透射电镜观察肿瘤细胞 每组随机取两块瘤组织，将
瘤组织快速投入 2． 5%戊二醛固定液固定 2 h以上，磷酸缓
DOI:10.13193/j.issn.1673-7717.2013.08.014
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冲液漂洗，1%锇酸后固定 1 ～ 2 h，缓冲液漂洗 20 min，依次
用 70%、80%、90%、100%丙酮梯度脱水，浸透、包埋、制备
超薄切片，醛酸双氧铀和柠檬酸铅染色，电镜观察并拍片。
1． 8 原位杂交 瘤组织及时固定，切片常规脱蜡至水。
3% H2O2室温封闭，PBS 洗，切片上滴加复合消化工作液
酶，室温消化 10 min，暴露 mＲNA核酸片段。滴加预杂交液
20 μL，40 ℃ 3 h，滴加 Survivin探针杂交液 20 μL，40 ℃杂
交过夜，杂交后洗涤，滴加生物素化抗地高辛 37 ℃ 60 min，
PBS洗 5 min × 4 次，滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合物
工作液，37 ℃ 60 min，PBS洗 5 min × 4 次，DAB显色，苏木
素复染，脱水、透明、封片。
1． 9 统计方法 所得数据经 SPSS 11． 0 系统处理，组间差
异采用方差分析，两两比较采用 t检验。结果用珋x ± s表示。
2 结 果
2． 1 抑瘤率 与模型组比较，中药组、CY组瘤重显著低于
模型组瘤重，差异有统计学意义(P ＜ 0. 05)。中药组与 CY
组比较，差异无统计学意义(P ＞ 0. 05)。中药组抑瘤率为
38． 93%，见表 1。
2． 2 肿瘤细胞电镜观察 模型组镜下可见瘤细胞核浆比
例增大，双层核膜清晰，核有明显异型性，瘤细胞表面可见
大量微绒毛，胞质内线粒体轻度肿胀，游离核蛋白体丰富;
有少量的淋巴细胞侵润，见插页Ⅹ图 1。中药组镜下可见
瘤细胞胞体显著变小，细胞表面微绒毛减少、消失，核膜清
晰，细胞核固缩，染色质呈团块状边集于核膜下，呈凋亡改
变。游离核蛋白体明显减少，线粒体嵴断裂，甚至出现空泡
变性，胞质内可见大量的脂肪堆积，见插页Ⅹ图 2。CY 组
镜下瘤细胞表现以坏死改变为主，坏死瘤细胞核崩解，细胞
器结构消失，其坏死区周围可见大量的粒细胞;在坏死区可
见凋亡细胞，胞核崩解成碎片，核膜结构清晰，细胞膜性结
构完好，见插页Ⅹ图 3。
2． 3 肿瘤细胞中 Survivin mＲNA 表达 原位杂交法对
Survivin基因 mＲNA表达进行半定量检测。染色结果 Sur-
vivin基因表达定位于胞质，呈棕黄色，弥漫性分布，见插页
Ⅹ图 4 ～ 6。在高倍镜下，每张标本随机选择 10 个视野，利
用 HIMAS － 2000 多媒体图像分析系统对 Survivin 各组阳性
细胞面密度值、阳性细胞平均灰度值进行分析。与模型组
比较，中药组与 CY组 Survivin mＲNA表达降低(P ＜ 0. 01) ，
中药组与 CY组比较，Survivin mＲNA 表达差异无统计学意
义(P ＞ 0. 05)。提示角花胡颓子提取物可下调肿瘤细胞内
凋亡相关基因 Survivin。见表 2。
表 1 JHT对 S180荷瘤小鼠体内肿瘤生长的
抑制效应(n = 10，珋x ± s)
组别 瘤重(g) 抑瘤率(%)
模型组 1． 47 ± 0． 6485
中药组 0． 90 ± 0． 4872* 39． 02
环磷酰胺组 0． 56 ± 0． 1657* 60. 05
注:与模型组比较，* P ＜ 0. 05。
3 讨 论
中草药的使用在我国源远流长，中医药在抗肿瘤方面
表 2 JHT对 S180 荷瘤小鼠 Survivin mＲNA
表达的影响(n = 10，珋x ± s)
组别 平均密度 平均灰度值
Model 0． 0683 ± 0． 0092 167． 5901 ± 16． 2373
GFW 0． 032 ± 0． 0060* 105． 3058 ± 17． 1236*
CY 0． 0294 ± 0． 0035* 100． 8869 ± 10． 0087*
注:与模型组比较，* P ＜ 0. 05。
疗效确切且不良反应小，因此，深入研究植物提取物的抗肿
瘤特性为筛选新的安全有效的抗癌药提供了契机。细胞凋
亡是机体免疫自稳和免疫监视功能的重要组成部分，对肿
瘤的发生发展及药物治疗有重要影响［2］。诱导肿瘤细胞
发生细胞凋亡是肿瘤治疗研究的新途径。凋亡与细胞生长
分化一样，受一系列基因调控，其基本过程是在有关信号刺
激下，凋亡调控基因表达发生改变，进而在某些离子参与下
激活某些酶最终启动细胞凋亡。离子中以钙和镁最为重
要，钙是多数细胞凋亡的触发剂［3］。
生存素(survivin)是目前发现的最强的凋亡抑制因子，
为凋亡抑制家族(IAP)中的新成员。广泛表达于各种肿瘤
组织。表达于胚胎发育组织和人类大多数肿瘤组织，但在
正常成熟组织中不表达，具有调控组织细胞周期和细胞凋
亡的双重功效。survivin能阻止广泛的刺激所导致的凋亡。
Survivin由 4 个外显子和 3 个内含子组成。它是凋亡抑制
因子家族中分子量最小的成员，仅有一个 N端的 BIＲ 结构
域和一个长的 C端 α螺旋结构，其 BIＲ 结构被认为在 Sur-
vivin的抗凋亡功能中起重要作用［4］新的观点认为:Survivin
抗细胞凋亡存在两种途径，一种即经典的 Caspase 途经，一
种通过促进细胞分裂而抑制细胞凋亡［5］。本实验应用原
位分子杂交技术检测 Survivin mＲNA，结果显示 Survivin
mＲNA在模型组中高表达，表明在肿瘤细胞中该基因转录
功能增强，基因蛋白生成后，破坏凋亡平衡参与肿瘤细胞发
生发展。与模型组比较，中药组 Survivin 表达下降(P ＜
0. 01) ，表明角花胡颓子提取物具有下调凋亡抑制基因 Sur-
vivin基因 mＲNA转录水平的作用，提示角花胡颓子提取物
可通过影响 Survivin表达促进肿瘤细胞凋亡。
综上所述表明角花胡颓子提取物具有诱导肿瘤细胞凋
亡作用，其分子机制与 Survivin 表达有关。而肿瘤是多基
因异常所致疾病，角花胡颓子提取物抑制肿瘤生长在基因
水平的作用是对上述基因特异的作用，或是对多种癌基因
和抑癌基因非特异作用有待进一步研究。
参考文献
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角花胡颓子提取物对荷瘤鼠肿瘤细胞凋亡的影响
(正文见 1693 － 1694 页)
SP － A在急性肠损伤大鼠大肠和肺组织中表达的相关性研究
(正文见 1741 － 1744 页)
图 1 各组大鼠大肠组织病理切片(HE* 40)