全 文 ：　中国南方果树　2010;39(5):4～ 7
卡里佐枳橙幼苗病害致病菌的分离和鉴定
刘 　娟1 , 2 ,胡军华2 ,姚廷山2 ,李鸿筠2 ,冉 　春2 ,刘浩强2 ,徐丽兰1 , 2
(1 西南大学园艺园林学院 ,重庆 , 400716;2 中国农业科学院柑桔研究所)
摘　要:在卡里佐枳橙幼苗上发生一种严重病害 , 为害卡里佐枳橙茎干 ,造成褐变 , 叶片干枯或脱
落 ,严重时植株死亡。从卡里佐枳橙病害苗上分离纯化得到 4 株真菌 ,分别为 M P1 、M P2、MP3 和
MP4。致病性测定发现 ,上述 4 种真菌的致病程度不同 , MP2 孢子悬浮液处理发病最轻 , MP3 孢子
悬浮液处理发病最为严重;对这 4 种菌进行形态学和分子生物学鉴定 , 发现 3 株属于链格孢属
(Alternaria sp.), 另外 1株属于盾壳霉属(Coniothy rium Co rda)。
关键词:卡里佐枳橙幼苗致病菌;链格孢;致病性
中图分类号:S 666.9;S 436.661.1+9　　文献标志码:A　　文章标号:1007-1431(2010)05-0004-04
　收稿日期:2010-07-21;修回日期:2010-08-30
作者简介:刘娟(1985-),女 ,在读硕士 ,主要研究方向为应用微生物。 E-mai l:maijiadew u@163.com
通信作者:胡军华。电话:(023)68349005
Isolation and Identif ication of the Causal Agents of Citrange
Seedling Diseases
Liu J uan
1 , 2 , HU J un-hua 2 ,Y AO Ting-shan2 , LI Hong-j un2 , RAN Chun2 , L IU
Hao-qiang 2 , Xu Li-lan1 , 2
(1 College of H ort icul tu re and Landscape Architectu re , Southw est Universi ty , Chongqing 400716 , China;
2 Cit ru s Research Inst itute , Chinese A cademy of Agricul t ru al Sciences , C hongqing 400712)
Abstract:A se rious citrange seedling disease that caused stem brow ning and leaf dehydra tion and ab-
scission , and even death o f the w hole tree was studied.Four fung i , M P1、MP2 、MP3 and MP4 ,
were isola ted from diseased seedling s.Inoculation te st showed tha t these st rains v aried in their pa th-
ogenicity , and the least pathogenic iso late wa s MP2 while the most pathogenic iso late w as MP3.
Morpho log ical and mo lecular studies identified tha t 3 of the iso lates belong to A lternaria and the rest
belongs to Coniothy ri um Corda after identified by methods of mo rpho lo gy and molecular bio log y.
Key words:The pa thogen of citrange seedling disease;A lternaria sp.;Pathogenicity
　　卡里佐枳橙是一种优良柑桔砧木。以卡里佐枳
橙为砧木嫁接的柑桔苗木生长快 ,植株健康 , 定植后
的柑桔树主根粗 , 根系发达 , 耐旱 , 较耐寒 , 抗衰退
病 、脚腐病和线虫病等[ 1] 。卡里佐枳橙苗期发病的
报道很少。在重庆发现部分卡里佐枳橙幼苗出现茎
干环状褐化 ,叶片干枯 , 甚至脱落 , 严重时整株幼苗
出现死亡。对这些病苗发病部位进行致病菌分离纯
化和鉴定 ,为卡里佐枳橙苗期防治该病害提供依据。
1 材料与方法
1.1　材料
受害卡里佐枳橙幼苗采自重庆。
1.2　症状观察
采集受害的卡里佐枳橙幼苗 , 并对其进行观察 ,
记录病害症状。
1.3　致病菌分离和显微观察
病原菌的分离与纯化采用组织分离法[ 1] , 分别
选取带有典型病斑的叶片和发生褐变的茎干 , 用清
水冲洗干净 , 在病健交界处剪取 2 mm×2 mm 大小
的组织块 , 先在 70%酒精中消毒 10 秒钟 , 后用无菌
水连续漂洗 3 次 , 取出后用灭菌的滤纸吸去多余的
水分 , 放在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板
上[ 2] , 25 ℃恒温培养 5 天;挑取典型菌落边缘的菌
丝 , 将其移植到新的 PDA 平板上培养 , 获得分离物
DOI :10.13938/j.issn.1007-1431.2010.05.005
　第 4 期 刘　娟 , 等:卡里佐枳橙幼苗病害致病菌的分离和鉴定
的纯培养 , 4 ℃保存备用。
将单菌落的病原菌制片 , 不染色直接在显微镜
下观察菌丝形态 、孢子形状 , 记录观察结果并拍照 ,
按照邵力平所著的真菌分类学进行种类鉴定[ 3] 。
1.4　致病性测定
　　按柯赫氏法则对菌株进行离体茎干的致病性测
定[ 2] 。选取健康卡里佐枳橙幼苗茎干 , 直径为
0.5 cm左右 ,剪成 10 cm 长的茎段 , 肥皂水清洗后自
来水冲洗干净 , 酒精棉擦拭茎段 , 在火焰上烧去酒
精 ,用无菌刀刻伤 , 待用[ 4] 。在生长有待测真菌菌落
的平板上滴入无菌水 5 mL , 用涂布棒轻轻涂抹 , 将
菌落上的分生孢子洗下 ,用毛笔蘸取分生孢子悬浮
液 ,涂抹到供试卡里佐枳橙茎段刀刻伤口处 , 放入垫
有湿润滤纸的培养皿内 , 放置在 25 ℃、12 小时光
照/ 12 小时黑暗的恒温培养箱内 , 设对照(清水), 每
处理 2次重复[ 1] 。接种后观察侵染发病情况。若侵
染发病且症状与自然条件下的症状相同 , 则在显症
后适当时间取典型病害组织再用组织分离法分离 ,
若获得与待测菌相同的菌 ,则获证其为病害病原菌。
1.5　致病菌的分子生物学鉴定
　　将致病菌接种于 200 mL 液体 PDA 培养基中 ,
28 ℃下振荡培养 3 天 , 1 000 prm 离心 8 分钟 , 弃上
清液;CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法[ 5] 提取致
病菌总 DNA , 采用 rDNA ITS 通用引物 ITS1 (5′-
TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3′)与 ITS4 (5′-
TCCTCCGC TTATTGATATGC-3′)进 行 扩 增。
PCR(聚合酶链式反应)产物用 1.0%琼脂糖电泳检
测。由上海生物工程技术有限公司测序 , 测得的序
列在 GenBank 中进行比对分析。
2　结果与分析
2.1　受害卡里佐枳橙幼苗症状
幼苗茎干出现环状褐变 , 同时出现褐变的主干
上部枝条干枯 ,部分叶片出现白色病斑 , 随着时间的
增加变为褐色病斑 , 大部分叶片完全失水 , 干枯 , 脱
落。严重时卡里佐枳橙幼苗枯死(见图 1)。
2.2　致病菌的形态特征
分离病原菌得到 4 株真菌 , 编号为 MP1 、MP2 、
MP3 和 MP4。纯化后将各菌株培养于 PDA 平板
上 ,培养 5 天后的特征如表 1 、图 2 和图 3 所示。根
据形态学鉴定 , MP1 属于盾壳霉属(Coniothy rium
Co rda), MP2 、MP3和 MP4 属于链格孢属(Alterna-
ria sp.)。
图 1 　受害卡里佐枳橙幼苗症状
表 1 　卡里佐枳橙幼苗致病菌菌株形态特征
菌株编号 形 态特 征
MP1
菌落桔红色 ,边缘整齐 ,呈轮状生长 , 气生
菌丝桔红色 ,疏松状,菌丝无隔
MP2
菌落灰白色 ,边缘不整齐 ,呈无规则生长 ,
气生菌丝白色 , 浓密状 , 分生孢子梗单生
或簇生 ,分生孢子倒棍棒状 , 淡褐色至褐
色 ,表面光滑微刺 ,具 3～ 8 个横隔膜和 1
～ 4个纵 、斜隔膜 , 分隔处略缢缩 , 孢身
(12.25～ 29.4)μm×(7.35～ 12.25)μm
MP3
菌落灰黑色 ,边缘不整齐 ,呈轮状生长 , 气
生菌丝灰色 ,浓密状 ,分生孢子梗多单生
或少数根簇生 ,直或略弯 ,淡褐色 ,孢子梗
长(12.25～ 78.4)μm×(3.45～ 5.14)μm 。
分生孢子倒棍棒状 ,卵形或近椭圆形 , 成
熟孢子具 2～ 8 个横隔膜或半横隔膜 , 1 ～
6个纵 、斜隔膜 , 分隔处略缢缩。特别是
孢身中部的隔膜明显较粗(厚), 黑褐色 ,
缢缩更为明显。孢身(12.25 ～ 31.85)μm
×(5.14～ 12.85)μm
MP4
菌落灰白色 ,中间凹 ,边缘不整齐 ,呈无规
则生长 ,气生菌丝呈白色 ,浓密状 ,分生孢
子梗多单生或少数根簇生 , 直或略弯 , 淡
褐色 ,分生孢子倒棍棒状 ,卵形或近椭圆
形 ,成熟孢子具 2～ 6个横隔膜或半横隔
膜 , 1 ～ 6 个纵 、斜隔膜 , 孢身(12.25 ～
31.85)μm×(5.14～ 12.85)μm 。
　　注:在 PDA 培养基上培养 5天后观察。图 2 、图 3同。
5
中 国 南 方 果 树　　　　　　　　　　　　　　　第 39 卷
2.3　致病性测定
　　在卡里佐枳橙幼苗的茎干上接种致病菌株的孢
子悬浮液 , 3 天后茎干上出现水浸状 , 5 天后茎干发
生褐变 ,与卡里佐枳橙幼苗发病症状相似;对茎干发
病部位进行致病菌的第二次分离 , 5 天后观察发现
病原菌形态特征与第一次分离的病原菌一致。同
时 ,发现 4 种菌的致病程度不同 , MP3 孢子悬浮液
处理的茎段发病最为严重 , 接下来依次为 MP4 、
MP1 和 MP2(见图 4)。
2.4　致病菌的分子生物学鉴定
　　采用 CTAB 法提取第一次和第二次分离到的
致病菌总 DNA , 对 MP1 、MP2 、M P3 和 MP4 的
rDNA ITS 基因进行扩增 , 均获得一条大小约为
650 bp片段。对扩增产物进行测序 ,比对序列 , 发现
前后两次分离出的致病菌 MP1 的 rDNA ITS 序列
与 Coniothyrium aleuritis 有 98%的同源性 , 推断
MP1 属于半知菌亚门 Fung i Imperficti , 腔孢纲
Coelomycetes ,球壳孢目 Sphaeropsidales , 盾壳霉属
Coniothy rium Co rda;MP2 、M P3、MP4 的 rDNA ITS
序列与 A lternaria sp.100%同源 , 从而推断 MP2、
MP3、MP4 属于半知菌亚门 Fungi Impe rfict 、丝孢纲
H yphomycetales、丝孢目 Hyphomycetale s、暗色菌科
Dematiaceae、链格孢属 Alternaria sp.。
　注:a.c.e.g 是无菌水处理;b 、d 、f 和 h 分别是 MP1 、
MP2 、MP3和 MP4孢子悬浮液处理。
图 4 　卡里佐枳橙幼苗分离致病菌致病性测定
3　结论与讨论
　　目前 , 发生在卡里佐枳橙幼苗上的这种病害在
国内报道还很少 , 查阅文献发现 , 其与 P homopsis
stem-End Ro t.[6] 相似。 Phomopsis S tem-End Rot.
病原菌是链格孢 Alternaria citri。对卡里佐枳橙幼
苗病害组织进行分离纯化 , 得到 4 种主要的致病菌 ,
经过形态鉴定和分子生物学鉴定 , 发现其中 3 种都
是 Alternaria sp., 与报道相似 , 但是这 3 株链格孢
菌在形态上与粗皮柠檬链格孢叶斑病 Alternaria
alternata 不同。致病性试验表明 , 接种这 3 株链格
孢菌的茎段发病程度不同 , 推测这 3 株致病菌可能
属于链格孢属的不同种。 由于 18 s rDNA 和 5.8 s
rDNA 序列高度保守 , ITS 序列分析只能鉴定到属。
另外 1 种致病菌为盾壳霉 Conioth y rium Co rda., 目
前这种真菌在柑桔病害上报道还很少。盾壳霉的寄
主广泛 , 可能是从别的植物传染到柑桔树上。在形
态鉴定中没有观察到分生孢子和有性阶段的特征 ,
可能是因为盾壳霉的最适生长条件还不清楚 , 有待
6
　第 4 期 刘　娟 , 等:卡里佐枳橙幼苗病害致病菌的分离和鉴定
进一步观察。
　　A lternaria sp.主要以菌丝体和分生孢子在病
株上或随病残体遗落土中越冬 , 第二年产生分生孢
子进行初侵染和再侵染。该菌寄生性不强 , 寄主种
类较多 ,分布广泛 , 在其他寄主上形成的分生孢子也
是卡里佐枳橙幼苗生长期中该病的初侵染和再
侵染源。
　　链格孢主要用化学药剂进行防治。国外一些研
究表明 , 铜制剂 、Abound、Gem 、Headline 和 Ferbam
是控制链格孢的有效药剂[ 7] 。在国内一般采用三唑
酮 、咪鲜胺及苯醚甲环唑的麦角甾醇类的生物合成
抑制剂抑制链格孢菌丝的生长 , 或是百菌清与高效
内吸性药剂混配剂抑制链格孢孢子的萌发。目前 ,
我国自主研制的啶菌噁唑新型杀菌剂 ,不仅能高效
地抑制链格孢菌丝的生长 , 同时也有一定的抑制链
格孢孢子萌发的作用;而醚菌酯和嘧菌酯是一类线
粒体呼吸抑制剂 ,对链格孢的孢子和菌丝都有较高
的抑制作用[ 8] 。
参　考　文　献
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(责任编辑:鲁玉洋;英文编辑:董朝菊)
(上接第 3 页)落花蕾和落花主要是由花器官发育不
完全和开花后不能正常授粉受精引起的 ,小果太多 、
养分供应有限且分配不均是造成第一次和第二次生
理落果的主要原因[ 3] 。另外 , 柑桔落花落果还与气
象因素有关[ 3-5] 。因此 , 在 2008 年和 2009 年不同的
气候条件下 ,夏金脐橙出现不同的落花落果时间是
正常的。
夏金脐橙 2008 和 2009 年的着果率分别为
1.83%和 1.47%,两年平均为 1.65%, 处于柑桔一
般着果水平[ 6] 。 2008 年和 2009 年的脐黄率分别为
31.4%和 27.4%,两年平均为 29.4%。脐黄落果主
要集中在 6—8 月。 2008 年和 2009 年的裂果率分
别为 4.3%和 0.4%, 两年平均为 2.4%。裂果落果
主要集中在 10 月下旬。柑桔裂果原因复杂 , 既有内
因也有外因[ 7] ,夏金脐橙两年的裂果率都较低 , 说明
该品种的裂果受外界环境影响较小 , 其果实外观结
构及生理特性是该品种裂果少的主要因素。夏金脐
橙脐黄率高的原因还不明确 ,有待进一步研究 。
针对夏金脐橙落花落果的特点 , 建议生产上宜
在谢花期 、第一次生理落果高峰前的 4 月中下旬或
5 月初各喷施一次 GA 3 50 mg/ L保花保果 , 5 月中旬
第二次生理落果高峰前再喷施一次。另外 , 夏金脐
橙的脐黄率也较高 , 应采取相应的措施防止。
参　考　文　献
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(责任编辑:鲁玉洋;英文编辑:董朝菊)
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