全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2014)06 － 2729 － 03 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2014． 06． 090
收稿日期:2014 － 01 － 28
基金项目:国家自然科学基金(31200488);云南省应用基础研
究计划(2011FB066);西南地区生物多样性保育国家林业局重
点实验室开放基金(BC2010F15);湖北省自然科学基金
(2013CFC004)
作者简介:傅本重(1978 － )，男，博士，副教授，主要从事园艺植
物病理学研究，E-mail:benzhongf@ yahoo． com。
吉祥草叶斑病菌的形态和分子鉴定
傅本重1，2，赵文丽2，周 勇1，史红安1，王立华1，李国元1，张志林1
(1．特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室 /生物质资源转化利用湖北省协同创新中心，湖北工程学院生命科学技术学院，湖北
孝感 432000;2．西南林业大学林学院，云南 昆明 650224)
摘 要:吉祥草是一种常用的园林绿化植物和中药材。为了明确吉祥草叶斑病的病原物，为病害的防治奠定基础。调查了西南交
通大学校园吉祥草叶斑病的发生情况，用组织分离法对病原物进行了分离和纯化，并完成了科赫氏法则验证。通过形态学和 rD-
NA-ITS序列分析，鉴定吉祥草叶斑病病原菌为细极链格孢(Alternaria tenuissima(Fr．)Wiltshire))。
关键词:吉祥草;叶斑病;链格孢;分子鉴定;rDNA-ITS
中图分类号:S435． 6 文献标识码:A
Morphological and Molecular Identification of
Pathogen Causing Ｒeineckea carnea Leaf Spot
FU Ben-zhong1，2，ZHAO Wen-li2，ZHOU Yong1，SHI Hong-an1，WANG Li-hua1，LI Guo-yuan1，ZHANG Zhi-lin1
(1． Key Laboratory for Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables of Hubei Province /Hubei Collaborative Innovation Center for
Biomass Ｒesource Transformation and Utilization，College of Life Science and Technology，Hubei Engineering University，Hubei Xiaogan
432000，China;2． Forestry College of Southwest Forestry University，Yunnan Kunming 650224，China)
Abstract:Ｒeineckea carnea is one of important herbaceous species with great value in ornamental and Chinese medical material． In order to
provide the foundation for the disease control，the pathogen causing Ｒeineckea carnea leaf spot was identified，as well as，the disease oc-
curred on Chendu city were invistigated in this paper． The pathogen was purified throught tissue isolating method，further more，completed
the Kochs postulates． The pathogen of causing Ｒeineckea carnea leaf spot was identified as Alternaria tenuissima(Fr．)Wiltshire)，based on
the morphological characters and rDNA-ITS sequence．
Key words:Ｒeineckea carnea;Leaf spot;Alternaria;Molecular identification;rDNA-ITS
吉祥草(Ｒeineckea carnea)别名观音草，百合科
吉祥草属多年生常绿草本［1］。主要分布于我国长
江流域以南及西南地区，其适应性强，性喜温暖湿
润，耐寒耐阴［2］。除了作为园林绿化植物而广泛种
植之外，还有润肺止咳、活血止痛、镇咳平喘等多种
药理功效［3 ～ 4］。对吉祥草病害的研究为更好的开发
利用此草本植物，促进其健康生长与科学管理提供
参考。
巫小宏等人报道吉祥草叶斑病是其主要病害之
一［2］，但未对其进行病原菌鉴定。2010 和 2011 年，
笔者在四川成都西南交通大学九里堤校区发现吉祥
草叶叶斑病发生严重，发病率达 73． 03 %。为了明
确吉祥草叶斑病的病原物，作者对其进行了分离纯
化，完成了科赫氏法则验证。从病原菌的形态和分
子方面进行了鉴定，确定其病原菌为细极链格孢 Al-
ternaria tenuissima(Fr．)Wiltshire。
1 材料与方法
1． 1 病害调查及取样
2010 和 2011 年 4 － 6 月，对成都市西南交通大
学九里堤校区吉祥草叶斑病进行了调查。采集受害
植株样本，并进行症状描述和拍照。将新鲜的受害
植株带回实验室，尽快分离病原菌并纯化。
1． 2 病原菌的分离与纯化
采用常规的组织分离法［5］进行病原菌的分离
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2014 年 27 卷 6 期
Vol. 27 No. 6
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
和纯化。纯化后菌株用于鉴定之用，并备份保存。
1． 3 病原菌的致病性
采用离体叶片接种法。将健康的吉祥草叶片采
回，用无菌水洗净备用。用浓度为 1． 0 × 107 个 /mL
的孢子悬浮液伤口接种。接种后保湿 24 h。每天观
察并记录发病情况。
1． 4 病原菌的形态鉴定
观察菌丝和孢子形态，分别测量 100 个病原菌
孢子大小和菌丝直径，并显微拍照。参照《真菌鉴
定手册》［6］和《中国真菌志》［7］，比较各种孢子的形
态特征，进行初步鉴定。
1． 5 病原菌的 rDNA-ITS分析
病原菌 DNA提取用真菌基因组 DNA提取试剂
盒(BioFlux，Bioer Technology)进行。通用引物 ITS4
(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)和 ITS5 (5-
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3)［8］，由上海 In-
vitrogen公司合成。
PCＲ扩增反应体系(25 μl)如下:12． 5 μl PCＲ
Mixture(北京全式金)，ITS4(10 μmol /L)和 ITS5(10
μmol /L)各 1． 0 μl，9． 5 μl 的去离子水，模板 DNA
为 1 μl。PCＲ循环:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性
50 s，50 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环;最
后 72 ℃延伸 5 min。
纯化后的 PCＲ产物由上海 Invitrogen 公司双向
测序。测序结果在 NCBI 上在线进行 blastn 分析。
将相似结果下载到本地数据库，用 MEGA5． 1 构建
发育树进行分析。
2 结果与分析
2． 1 病害发生情况及致病性验证
吉祥草叶斑病病斑圆形、梭形或不规则多边形，
病斑中央灰白色，有透明感，主脉明显可见，边缘有
明显的深褐色线，外围有模糊的黄色晕圈(图 1b)。
老叶首先感病，进而蔓延到整个植株。吉祥草叶斑
表 1 吉祥草叶斑病的病害分级
Table 1 Ｒeineckea carnea leaf spot disease level
病级
Disease level
面积比例(%)
Area ratio
叶片数
Diseased leaves
1 ＜ 5 63
2 5 ～ 10 18
3 10 ～ 20 6
4 20 ～ 50 0
5 ＞ 50 0
病病害调查及病害分级见表 1。
平均每片叶上有 3 ～ 10 个病斑。病斑大小为
0． 01 ～ 2． 5 cm ×0． 01 ～ 0． 4 cm，平均大小为 1． 3 × 0．
25 cm。叶斑病发病率 73． 03 %。严重度 26． 30。
经过分离纯培养得到一种菌落呈椭圆形至圆形，等
径生长，初无色或淡色或灰白色，后渐变为青褐色至
暗褐色，边缘整齐，呈波状或裂片状。菌丝细长、分
枝、分隔、浓密(图 1d，e)。通过分离物孢子悬浮液
接种可使离体叶片发病，且发病率达 100 %。发病
症状与自然发病症状相似，再次分离的病原物与前
一致。
2． 2 病原菌形态鉴定
在 PDA培养基上菌落呈圆形，菌丝生长较紧
凑，初无色，后变为青褐色至暗褐色。菌丝有隔，产
孢子，分生孢子梗在菌丝上直接产生，多数单生或少
数簇生，直立或略弯曲，淡褐色或暗褐色，基部略膨
大。分生孢子褐色，有横隔膜，隔膜处缢缩，倒棍棒
形、卵形、倒梨形、椭圆形或近圆柱形，孢子基部钝
圆，与产孢细胞的接触面大。经过显微测量，病原菌
的分生孢子大小 13． 33 ～ 50． 67 μm × 6． 67 ～ 18． 67
μm，平均值为 30． 40 μm ×12． 45 μm;菌丝直径为 2．
40 ～ 8． 0 μm，平均为 5． 07 μm。依据《真菌鉴定手
册》和中国真菌志，初步确定该分离物属于半知菌的丝
孢纲，丛梗孢目，暗色孢科的链格孢属(Alternaria)。
a 自然发病;b 病斑;c 接种发病;d 病原菌菌落形态;e 病菌菌丝和孢子形态(400 ×)
a:natural disease;b:symptom;c:inoculated disese;d:colony shape;e:mycelium and spores(400 ×)
图 1 吉祥草叶斑病症状及病原菌
Fig． 1 Symptoms and the pathogen of Ｒeineckea carnea leaf spot
0372 西 南 农 业 学 报 27 卷
JB1 Marker
1500 bp
600 bp
500 bp
Marker:100 bp DNA ladder
图 2 rDNA-ITS 区段 PCＲ 扩增凝胶电泳
Fig． 2 Electrophoresis pattern of rDNA-ITS region PCＲ
Altemaria altemata
A.altemata MYA鄄4642
A.altemata IEIHBT
A.sp.LH鄄CAF1
A.sp.LH129
A.tenuissima
A.sp.ponipodef 07
JBITS
图 3 病原菌 ITS聚类分析树状图
Fig． 3 Phylogenetic tree of the pathogen and its homologus based on
ITS sequences
2． 3 病原菌的分子鉴定
病原菌的 ITS 区段经 PCＲ 扩增产物测序，得到
554 bp的碱基序列(图 2)，包括 18S核糖体 ＲNA基
因部分序列，ITS1、5． 8S核糖体 ＲNA基因和 ITS2 全
部序列，28S核糖体 ＲNA 基因部分序列。通过 NC-
BI的 blastn 搜索核酸数据库，进行比对和同源性分
析，发现该序列与多个链格孢(Alternaria)菌株的
ITS序列一致性为 100 %。遗传进化分析树结果表
明，其与(A． tenuissima)关系更近(图 3)。
根据病原菌的形态学特征和 ITS 序列分析，鉴
定吉祥草叶斑病的病原物为半知菌亚门丝孢纲丛梗
孢目暗色孢科链格孢属的细极链格孢(A． tenuissi-
ma)。
3 结论与讨论
从西南交通大学校园的吉祥草叶斑病取样，进
行病原菌的分离和纯化。通过了科赫氏法则验证，
根据形态学特征，并结合其 rDNA-ITS 序列分析，鉴
定吉祥草叶斑病病原菌为细极链格孢(A． tenuissi-
ma)。该结果为首次报道吉祥草叶斑病病原物。病
原菌的形态主要参考张天宇(2003)主编的《中国真
菌志》［7］第十六卷链格孢属，从分生孢子形态、大
小、颜色，以及喙等重要的种级特征进行了比较。
虽然链格孢是一种弱寄生性的真菌，在自然情
况下常生于植物的枯死部位，但也有许多植物病害
是由其引起的。最近报道细极链格孢 A． tenuissima
还可以引起红枣叶斑病［9］、水杉赤枯病［10］、三叶木
通叶斑病［11］，也是柑橘煤污病的优势菌［12］。本文
为开展吉祥草叶斑病病害的深入研究和防治奠定了
基础，为解决生产中的病害识别与防治等实际问题，
提供理论和技术支撑。对保护、开发和利用吉祥草
资源亦有一定意义。
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(责任编辑 李 洁)
13726 期 傅本重等:吉祥草叶斑病菌的形态和分子鉴定