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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):152-159
葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，EC 1.1.3.4，简
称 GOD）是氧化 - 还原酶类的典型代表，能够在
氧气存在时专一催化 β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过
氧化氢。因其氧化反应生成过氧化氢，在实际应用
中葡萄糖氧化酶被用作抗菌剂。另外，葡萄糖氧化
酶作为生物催化剂常用于临床诊断、食品和饮料保
收稿日期 ：2015-11-09
基金项目 ：河北省科技计划项目（14292804D），河北省科学院科技计划项目（20150503 LR62-3）
作者简介 ：高庆华，男，博士，研究方向 ：微生物发酵技术 ；E-mail ：gaoqinghua_mbb@126.com
点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究
高庆华1  胡美荣2  吴芳彤1  陶勇2  王云鹏1  罗同阳1  胡常英1
（1. 河北省微生物研究所，保定 071051 ；2. 中国科学院微生物研究所，北京 100101）
摘 要 ： 旨在克隆点青霉菌（Penicillium notatum）中的葡萄糖氧化酶基因（GOD），在毕赤酵母（Phchia pastoris）中异源表
达，纯化并研究其酶学性质。利用 PCR技术从点青霉 No.8312菌株的基因组 DNA中克隆得到 GOD基因，将该基因克隆到穿梭载
体 pMD-AOX上并在毕赤酵母 X33中表达，对纯化后的葡萄糖氧化酶的酶学性质进行分析。结果显示，X33-GOD可高表达具有活
性的 GOD，在 30℃、pH6.5的条件下，其培养液上清 GOD酶活可达 496 U/mL，比活 123.0 U/mg ；重组表达的葡萄糖氧化酶最适
温度为 40-45℃，最适 pH为 6.0，酶的稳定性研究表明，该酶在 pH3.5-7.0区间和温度低于 50℃下稳定。1 mmol/L Zn2+对其有激
活作用；Ag+对该酶活性有较大抑制作用。构建出 GOD的高产毕赤酵母工程菌株，与点青霉 GOD相比，具有更高的发酵酶活和
比活。
关键词 ： 葡萄糖氧化酶；点青霉菌；重组表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.023
Cloning of Gene for a Glucose Oxidase from Penicillium notatum and
Its Enzymatic Properties
GAO Qing-hua1 HU Mei-rong2 WU Fang-tong1 TAO Yong2 WANG Yun-peng1 LUO Tong-yang1
HU Chang-ying1
（1. Institute of Microbiology，Hebei Academy of Sciences，Baoding 071051 ；2. Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，
Beijing 100101）
Abstract: The purpose of this work is to clone the gene of glucose oxidase（GOD）from Penicillium notatum，which was then in
heterologous expression in Pichia pastoris，and the enzymatic properties of purified proteins were studied. GOD gene was cloned from genome
DNA of P. notatum No. 8312 strain using PCR technique，the gene was ligated to the vector pMD-AOX and then expressed in strain X33 of P.
pastoris，and finally the enzymatic properties of the purified proteins were analyzed. As results，the strain X33-GOD highly expressed the GOD
with activity. Its activity of GOD in cultured supernatant reached 496 U/mL and the specific activity was 123.0 U/mg at 30℃ and pH6.5. The
optimal temperature and pH of recombinant GOD was 40-45℃ and 6.0 respectively. The result of stability of the enzyme showed that the enzyme
was stable when the temperature under 50℃ and the pH3.5-7.0，and it can be activated by 1 mmol/L Zn2+ and obvious inhibited by Ag+. The
recombinant engineering P. pastoris strain with high-yield GOD has a higher fermentation activity and specific activity compared with GOD from P.
notatum.
Key words: glucose oxidase ；Penicillium notatum ；recombinant expression
2016,32(7) 153高庆华等：点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究
鲜［1］；葡萄糖氧化酶作为酶电极还可用于生物传感
器领域［2］。
葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物及微生物体
内。研究及生产葡萄糖氧化酶的主要菌株为黑曲霉
（Abperrillus niger） 和 点 青 霉（Penicillium notatum），
这是因为霉菌产酶能力强，易于规模化生成 ；但黑
曲霉和青霉菌发酵生产 GOD 过程中，过氧化氢酶、
纤维素酶及淀粉酶等大量杂酶的存在给纯化带来相
当大的困难［3］。
重组葡萄糖氧化酶基因进行异源表达可有效地
解决这些问题［4，5］。尤其是毕赤酵母表达外源蛋白
具有表达量高、稳定性好、培养成本低和产物易分
离纯化等优点，适于大体积高密度连续发酵，具有
强且易控的醇氧化酶（Alcohol oxidase，AOX）启动
子等优点［6］，可严格控制外源基因的表达［7］。
近年来，河北省微生物研究所对保存的青霉属
的点青霉 No.8312 菌株，采用紫外线诱变方法处理，
筛选到了产酶较高菌株，本研究从点青霉菌中克隆
得到葡萄糖氧化酶基因，并将其构建在 pMD-AOX
载体上，转化毕赤酵母 X33，进行点青霉菌的 GOD
基因实现异源高效表达。同时，对重组表达的葡萄
糖氧化酶进行纯化，并对其性质进行初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 点青霉 Penicillium notatum 菌株
和 Escherichia coli DH5α 菌株由河北省微生物研究所
保存。毕赤酵母 Pichia pastoris X33 由中科院微生物
所馈赠。毕赤酵母表达载体 pMD-AOX（含 AOX 强
启动子和终止子，G418 抗性基因）为中科院微生物
所构建。
1.1.2 主要试剂 限制内切酶 Not I、Pme I 和 EcoR I
以及 Q5 DNA 聚合酶为 NEB 公司产品 ；邻联茴香
胺、辣根过氧化物酶、牛血清白蛋白等购自 Sigma
公司 ；蛋白质浓度测定试剂盒为上海生工公司产品 ；
DNA Marker 和蛋白 Marker 购于 Fermentas 公司 ；其
他均为国产分析纯试剂。真菌基因组提取试剂盒购
于北京索莱宝科技有限公司 ；质粒提取试剂盒、普
通 DNA 回收试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购于天
根生化科技（北京）有限公司。PCR 扩增引物由上
海生工合成。
1.1.3 培养基 察氏培养基、含有 Amp 抗性的 LB
培养基、含有 G418 的 YPD 培养基分别用以培养
点青霉、大肠杆菌和酵母菌，BMGY 培养基（酵母
提取物 1%、蛋白胨 2%、pH6.0 磷酸钾缓冲液 100
mmol/L、YNB 1.34%、生物素 4×10-5%、甘油 1%）
为毕赤酵母甲醇诱导表达前培养基。YPCS 发酵培养
基（g/L）（酵母提取物 10，蛋白胨 20，酪蛋白水解
物 5，山梨醇 5）为毕赤酵母诱导表达培养基。诱导
培养时，每 24 h 加入 1% 的甲醇。
1.2 方法
1.2.1 点青霉基因组的提取 按照真菌基因组提取
试剂盒方法提取 P. notatum 的基因组 DNA。
1.2.2 葡萄糖氧化酶基因的扩增 扩增来自于 P.
notatum 的葡萄糖氧化酶引物的设计参照 NCBI 上
报 导 的 葡 萄 糖 氧 化 酶 序 列（GenBank 登 录 号 ：
XM_002563405.1 和 JN809249.1），其 5 端引物序列
P1 为 ：5-ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA-3，
其 3 端引物序列 P2 为 ：5-CTAGGCACTTTTGGCA-
TAGTCTTCA-3，用这对引物以 P. notatum 基因组为
模 板 进 行 PCR 扩 增。 反 应 体 系 为 50 μL ：基 因 组
DNA 100 ng，引物各 0.2 μmol/L，dNTPs 250 μmol/L，
5×Q5 High-Fidelity DNA Polymerase Buffer 10 μL，Q5
High-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL。PCR 反应条件：
98℃ 5 min ；98℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 60 s，共 30
个循环 ；72℃ 10 min。PCR 产物经 DNA 回收试剂盒
回收。将经鉴定无误的连有点青霉葡萄糖氧化酶基
因的重组质粒进行测序。
1.2.3 葡萄糖氧化酶基因重组表达载体的构建 为
了将葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中表达，首先去
掉其自身的信号肽编码序列，通过 PCR 方法设计引
物将点青霉的葡萄糖氧化酶基因序列中的信号肽编
码序列去除。引物序列如下 ：GodF ：5-GGCTGAAG
CTTACGTAGAATTCTATAGCCCGGCCGAGCAGATCG
AC-3 ；GodR ：5-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAGCG
GCCGCCTAAGCTTTCTTGGCATAGTCTTC-3（下划线
分别为上下游引物中限制性内切酶 EcoR I 和 Not I
识别位点）。PCR 产物经纯化回收采用 GIBSON 连接
到表达载体 pMD-AOX 的 EcoR I 和 Not I 位点上，转
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7154
化到 E. coli DH5α。酶切验证筛选阳性克隆，并送测
序。
1.2.4 毕赤酵母的转化及诱导培养 采用电转化
法［8］，重组质粒 pMD-AOX-GOD 经 Pme I 酶切后线
性化。用 2 μg 线性化 pMD-AOX-GOD 质粒电击转
化 80 μL 毕赤酵母 X33 感受态细胞，然后将转化细
胞涂于含 100 μg/mL G418 的 YPD 平板上，30℃培
养 96 h。随机挑选阳性菌落转接液体 YPCS（含 100
μg/mL G418，下同），置于 30℃、200 r/min 条件下
振荡培养 3 d，期间每隔 24 h 加 1% 的甲醇。
1.2.5 10 L 发酵罐发酵 选取摇床水平上葡萄糖氧
化酶活性最高的转化子研究其发酵罐条件下葡萄糖
氧化酶的表达。挑单克隆接种于 YPD 培养基培养
10 h，按 3% 接种量转接于 100 mL BMGY 培养基至
OD600≈6 接种于发酵罐，装液量为 2 L BSM 培养基，
灭菌后，以 10% 发酵体积接种。参照酵母表达手
册，以浓氨水控制 pH5，培养温度控制在 30℃。培
养阶段甘油耗尽时（溶氧值 DO 开始明显上升），开
始流加 50% 甘油，至 OD600≈180，停止流加甘油，
4 h 后往培养基中甘油耗尽，开始流加甲醇诱导，期
间每隔 24 h 加维生素 C 水溶液（终浓度 80 μg/L），
12 h 测定发酵液酶活。发酵结束以 6 000×g、4℃离
心 20 min 收集发酵液上清，将所有收集到的上清液
用超滤浓缩纯化，提高分泌蛋白的浓度和纯度，用
BCA 法测蛋白浓度。用上清液进行 10% 聚丙烯酰
胺凝胶电泳，考马斯亮蓝 R-250 染色，脱色液（甲
醇 250 mL∶冰醋酸 50 mL∶水 200 mL）脱色，观察
GOD 蛋白的表达。
1.2.6 葡萄糖氧化酶的酶活和比活测定
1.2.6.1 GOD 活性测定 一般采用邻联茴香胺分光
光度法。在 3 mL 的反应体系中，包含 0.5 mol/L 醋
酸 缓 冲 液（pH5.1），0.17 mmol/L 邻 联 茴 香 胺 溶 液
和 1.72% 葡萄糖溶液及 0.1 mg/mL 辣根过氧化物酶，
35℃震荡混匀，加入 0.1 mL 葡萄糖氧化酶溶液，用
分光光度计，于 A=500 nm 自动记录随时间变化的
吸光度值，根据公式，计算葡萄糖氧化酶活力单位。
X=（ΔA500×3.1×df）/（7.5×0.1）
式中，X ：样品酶活（U/ mL）；ΔA500 ：活度值 ；3.1 ：
反应体积 ；df 为稀释倍数 ；7.5 ：葡萄糖内酯 A500
消光系数 ；0.1 ：加入酶液体积。
1.2.6.2 葡萄糖氧化酶比活性的测定 蛋白浓度测
定 采 用 上 海 生 工 Modified Bradford Protein Assay Kit
测定。得到蛋白质含量以后，同时测得其葡萄糖氧
化酶的活性，由此得到葡萄糖氧化酶的比活性。
1.2.7 酶的分离纯化 取发酵液在 4℃、6 000 r/min
离心 20 min，去除发酵液中的菌体 ；将离心得到的
上清液加入无水乙醇（终浓度 20%），4℃静置过夜，
6 000 r/min 离心 20 min ；取上清液，再加入无水乙
醇（终浓度 60%），4℃静置过夜，6 000 r/min 离心
20 min，将得到的沉淀用 0.1 mol/L pH7.4 的磷酸盐
缓冲溶液稀释到合适的酶活即得到初步纯化的 GOD
酶液。将初步纯化的 GOD 酶液采用 DEAE-Sephadex
A50 进一步纯化后经超滤浓缩后即可得精纯度的葡
萄糖氧化酶酶液。
1.2.8 葡萄糖氧化酶的酶学性质研究
1.2.8.1 温度对酶活力的影响 （1）最适温度 ：取
10 μL 一定浓度的纯化后酶液，分别于 35℃、40℃、
45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和 70℃下测定其酶
活力。（2）温度耐受 ：取一定量的纯化后的酶液，
分 别 于 35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃ 和
65℃孵育 30、60、90 和 120 min 测定酶活力。
1.2.8.2 pH 对酶活力的影响 （1）最适 pH ：取 10
μL 一定浓度的纯化后酶液，分别于不同 pH 的缓冲
液（终浓度均为 40 mmol/L）中，40℃测定其酶活力，
并计算其比活。（2）pH 耐受 ：取一定量的纯化后酶
液，分别于不同 pH 的缓冲液中孵育 5 h ；然后，于
40℃下，取一定浓度的 10 μL 酶液测定酶活力。
1.2.8.3 金属离子对酶活力的影响 将 10 μL 一定浓
度的纯化后酶液，在 pH6.0 缓冲液混合后，分别加
入终浓度为 0.1、1.0 和 10.0 mmol/L 的金属离子，补
水到 125 μL，40℃下测定其酶活力。
2 结果
2.1 点青霉GOD基因的克隆分析
以点青霉基因组 DNA 为模板，引物 P1 和 P2
进行 PCR 扩增（图 1）。序列分析结果表明，其基因
组 DNA 长 1 815 bp，GC 含量为 55.4%，无内含子，
编码 605 个氨基酸（图 2）。用 BLAST 进行同源分
析，结果显示与产黄青霉（Penicillium chrysogenum）
的 GOD 基 因（GenBank 登 录 号 ：XM_002563405.1）
2016,32(7) 155高庆华等：点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究
有 99% 的核酸序列相似性。推导的 GOD 氨基酸序
列与已知的产黄青霉氨基酸序列相似性达 99.8%，
仅第 15 位氨基酸发生了 Thr-Ala 的转变。
2.2 表达载体构建与鉴定
将经引物 GodF 和 GodR 进行 PCR 扩增并纯化
回收的点青霉 GOD 基因和经过 EcoR I 和 Not I 双酶
切的载体 pMD-AOX 进行 Gibson 连接以构建重组质
粒。用重组质粒转化感受态大肠杆菌 DH5α，并在
含 Amp 的 LB 平板上筛选阳性菌落。阳性菌落质粒
经 EcoR I 和 Not I 双酶切后，得到约 6.5 kb 和 1.8 kb
的两个 DNA 片段，亦与预期大小相符（图 3）。重
组质粒测序结果显示目的基因的完整阅读框序列已
正确插入到 pMD-AOX 载体 α-因子信号肽 DNA 序列
的下游，表明含点青霉 GOD 基因的毕赤酵母表达载
bp
2000
1000
3000
4000
5000
6000
8000
10000
M 1
1815
bp
P. chrysogenum GOD
P. notatum GOD
P. chrysogenum GOD
P. notatum GOD
P. chrysogenum GOD
P. notatum GOD
P. chrysogenum GOD
P. notatum GOD
P. chrysogenum GOD
P. notatum GOD
P. chrysogenum GOD
P. notatum GOD
P. chrysogenum GOD
P. notatum GOD
P. chrysogenum GOD
P. notatum GOD
P. chrysogenum GOD
P. notatum GOD
P. chrysogenum GOD
P. notatum GOD
P. chrysogenum GOD
P. notatum GOD
M ：DNA Marker ；1 ：PCR 扩增产物
图 1 点青霉基因组 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳
图 2 GOD 氨基酸同源性比较
体 pMD-AOX-GOD 已构建成功。
2.3 重组酵母葡萄糖氧化酶的表达
将重组的表达质粒 pMD-AOX-GOD 经 Pme I 酶
切后线性化后，电转化毕赤酵母 X33 感受态，在
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7156
YPD 平板生长 3 d 后，随机挑选阳性菌落转接液体
YPCS，经甲醇诱导 72 h 后，测定发酵液上清中的葡
萄糖氧化酶活性，从 32 个转化子中挑选出 6 株有葡
萄糖氧化酶活性的转化子，表达率为 16.7%。说明
表达载体 pMD-AOX-GOD 于毕赤酵母 X33 中得到有
功能活性表达。
2.4 10 L发酵罐发酵结果
选取 X33-GOD 中酶活最高株为实验株在 10 L
发酵罐中发酵，在甲醇未诱导之前，处于菌株培养
和碳源饲喂阶段，在这两个阶段内，菌体大量增长，
此时无葡萄糖氧化酶蛋白的表达。随着甲醇的诱导，
发酵液中的葡萄糖氧化酶活性逐渐增加（图 4），诱
导 144 h 后发酵液中 GOD 活性达到最高 496 U/mL，
蛋白质表达量达到 9.4 g/L，SDS-PAGE（图 5）结果
表明，发酵液中葡萄糖氧化酶蛋白表达量也在不断
积累，发酵液上清中 GOD 含量非常高，可以达到电
泳纯，可大大降低后期 GOD 纯化的成本。
2.5 重组酵母GOD的分离纯化
取 300 mL 发酵液经高速冷冻离心，酒精沉淀、
溶解后，上 DEAE-Sephadex A50 层析柱，超滤浓缩，
收率可达 94%。纯化前后电泳图谱（图 6）显示，
在甲醇的诱导下，GOD 在 X33 中的表达量明显高于
其他杂蛋白。发酵液上清经分离纯化后，可见一条
浓染的约 90 kD 的蛋白质条带，点青霉 GOD 理论分
子量为 60.2 kD，这与图 4 中点青霉 GOD 电泳结果
（65 kD）相似，但是重组酵母 GOD 蛋白条带明显比
点青霉 GOD 分子量大。根据该基因中有潜在的糖基
化位点，毕赤酵母表达系统又有转录翻译后的加工
功能，推测毕赤酵母表达的 GOD 蛋白质为糖蛋白。
通过蛋白含量标准曲线测定出酶液中的蛋白含
量，再通过常规的葡萄糖氧化酶酶活性测定方法，
最后得到了该酶的比活。经过测定，毕赤酵母 X33-
GOD 比活为 123.0 U/mg。同时，测定的青霉 GOD 比
bp
2000
1000
3000
4000
5000
6000
8000
10000
M 1 2 3 4 5
1815
6500
bp
M ：DNA Marker ；1-5 ：重组质粒 pMD-AOX-GOD 经 EcoR I 和 Not I 双酶切
的产物
图 3 重组质粒 pMD-AOX-GOD 琼脂糖凝胶电泳鉴定
M 1 2 3
65
200
kD
150
120
100
85
70
60
50
40
90
kD500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
En
zy
m
e
ac
tiv
ity
/U·mL-1 
0 12 24 36 48 60 72
Induction Time/h
84 96 108 120 132 144 156
图 4 葡萄糖氧化酶发酵液酶活增长曲线
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
90
200
kD
150
120
100
85
70
60
50
40
kD
M ：蛋 白 Marker ；1-12 ：经 甲 醇 诱 导 0、24、36、48、60、72、84、96、
108、120、132 和 144 h 葡萄糖氧化酶表达量
图 5 10 L 发酵罐中葡萄糖氧化酶经甲醇诱导不同时间内
的表达量
M ：蛋白 Marker ；1 ：毕赤酵母重组表达蛋白质上清液 ；2 ：浓缩纯化后的毕
赤酵母重组表达蛋白 ；3 ：点青霉表达 GOD
图 6 重组表达 GOD 蛋白 SDS-PAGE
2016,32(7) 157高庆华等：点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究
活仅为 101.3 U/mg。
2.6 GOD的酶学性质研究
2.6.1 温度对酶活力的影响 在 pH6.0 的测活条件
下，改变测活条件的反应温度，研究温度对酶活力
的影响，最适温度（图 7-A）显示，该酶催化反应
的最适温度为 40℃-45℃，70℃下酶活力基本接近 0。
重组 GOD 对温度的稳定性（图 7-B）显示，在 35℃
下孵育 90 min 酶活力基本保持不变，孵育到 120
min 时降低了 12 个酶活单位 ；在 40℃下孵育 90 min
降低了 15 个酶活单位，孵育到 120 min 时降低了 20
个酶活单位 ；在 45℃和 50 下℃孵育 30 min 降低了
15 个酶活单位，孵育到 120 min 时降低了 40 个酶活
单位 ；在 55℃下孵育 30 min 降低了 20 个酶活单位，
孵育到 120 min 时降低了 50 个酶活单位 ；60℃孵育
30 min，酶活力大约降低了 30 个酶活单位，孵育 90
min 后酶活力几乎检测不到。
2.6.2 pH 对酶活力的影响 在 40℃的测活体系中，
改变缓冲液的 pH 值，分析重组表达的葡萄糖氧化
酶的酶活力发现，酶活力对反应的 pH 作图，得到
一个相对平缓的曲线，最适 pH 为 6.0（图 8-A）。重
组葡萄糖氧化酶对 pH 的稳定性（图 8-B）表明，在
不同 pH 的缓冲液中孵育 5 h，重组表达的葡萄糖
氧化酶在 pH3.5-7.0 的缓冲液中的酶活力能维持在
90% 以上，在 pH3.0 和 pH8.0 缓冲液中，酶的活性
降低为原来的 60% 左右。
0
20
40
60
80
100
120
140
35 40 45 50 55 60 70
Temperature/ćEnzyme activity/U·mL-1 
0
20
40
60
80
100
120
140
0 30 60 90 120
Time/min
En
zy
m
e
ac
tiv
ity
/U·mL-1  35ć 40ć 45ć 50ć 55ć 60ć
A
B
图 7 温度对 GOD 酶活力（A）及热稳定性（B）的影响
0
20
40
60
80
100
120
140
160
3 4 5 6 7 8
pH
En
zy
m
e
ac
tiv
ity
/U·mL-1 
0
20
40
60
80
100
120
140
3 4 5 6 7 8
pH
En
zy
m
ea
ct
iv
ity
/U·mL-1 
A
B
图 8 pH 对 GOD 酶活力（A）及 pH 稳定性（B）的影响
2.6.3 金属离子对酶活力的影响 不同浓度的金属
离子对葡萄糖氧化酶的酶活力影响（图 9）显示，在
0.1 mmol/L 的金属离子浓度条件下，葡萄糖氧化酶
的酶活力大多能维持在 80% 以上（除 Ag+），Ag+ 对
其有抑制作用 ；在金属离子浓度为 1.0 mmol/L 时，
葡萄糖氧化酶的酶活力大多能维持在 80% 以上，其
中 Zn2+ 对其有激活作用，Ag+ 对其有抑制作用 ；当
金 属 离 子 浓 度 为 10 mmol/L 时，Ag+、Cu2+ 和 Fe3+
对 GOD 活力的抑制作用非常明显，Ag+ 尤为显著，
GOD 的剩余酶活力仅为 1%。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7158
3 讨论
GOD 作为安全的生物抗氧化剂，在科研医药和
食品工业生产上被广泛应用。目前，在产生菌的诱
变育种筛选及产酶条件的优化上做了大量工作［9-12］，
也有一些学者进行了黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因在
毕赤酵母中的克隆和表达［3，13，14］。毕赤酵母表达系
统优点是蛋白表达量高，可将外源蛋白分泌至胞外，
且被表达的蛋白中杂蛋白少 ；毕赤酵母还具有对表
达产物进行加工、折叠和翻译后修饰［15］。本研究依
据已知产黄青霉的 GOD 序列从点青霉中成功克隆了
GOD 基因，通过 BLAST，相似性达 99%，说明在青
霉属中 GOD 相对保守 ；点青霉 GOD 发生了氨基酸
置换（Thr15-Ala），由于点突变能改变酶分子的催化
反应动力学参数及催化反应活化能的现象，从而影
响蛋白质热稳定性［16］。
本研究构建的毕赤酵母菌工程菌株 X33-GOD
在 10 L 发酵罐中 30℃、pH6.5 条件下发酵培养时，
培养液 GOD 酶活可达 496 U/mL。X33-GOD 比原始
出发菌株点青霉的酶活（30 U/mL）提高近 16 倍。
郭元芳等［13］报道的毕赤酵母 SMD1168 表达黑曲
霉 accc30161GOD， 其 培 养 液 上 清 GOD 酶 活 力 为
107.18 U/mL ；周亚凤等［3］构建出 GOD 的高产酵母
工程菌株，经甲醇诱导 3-4 d，发酵液中的 GOD 活
力为 30-40 U/mL ；李卓夫［17］将青霉 GOD 在毕赤酵
母 GS115 中异源表达，在 3 L 发酵罐水平中，甲醇
诱导 132 h，发酵液中的最高酶活为 111.3 U/mL。因
此，本研究构建的毕赤酵母 X33-GOD 工程菌株具有
很高的推广应用价值。
0
20
40
60
80
100
120
0.1 mmol/L 1 mmol/L 10 mmol/L
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
/U·mL-1 
Metallic ion
AgNO3
CuSO4
MgSO4
Fe2SO43
MnSO4
CaCl2
ZnSO4
本研究所分泌表达的 GOD 的单亚基分子量为
90.0 kD，比原始菌株点青霉所产 GOD 单亚基分子
量高约 25 kD，分子量差异主要是由于糖基化造成的。
糖基化对毕赤酵母分泌表达的 GOD 在蛋白折叠中起
重要作用，能使酶蛋白结构具有更好的稳定性，这
种过糖基化现象在黑曲霉 GOD 在毕赤酵母的表达中
也存在［3］。
在青霉和黑曲霉中提取 GOD 需要经过 DEAE 离
子交换层析和凝胶过滤层析两步才能纯化，花费时
间长并且费用也相对较高［18，19］。毕赤酵母发酵表达
GOD，不需破碎菌体，发酵的上清液经离心就能得
到，且毕赤酵母表达系统极少分泌自身蛋白，杂蛋
白含量低，只需经过酒精沉淀和一步离子交换层析
就可以达到电泳纯，纯化收率高，费用低廉，该方
法适合工业化生产，有利于大规模纯化。
酶 学 性 质 研 究 发 现， 相 比 以 往 报 道 的 重 组
黑 曲 霉 GOD 和 产 黄 青 霉 GOD 的 最 适 温 度 仅 有
40℃［19，20］， 本 研 究 重 组 表 达 的 来 源 于 点 青 霉 的
GOD 的最适温度是 40-45℃，范围较宽 ；并且该酶
热稳定性良好，在 35-55℃之间都能保持良好的酶
学活性，酶的热稳定性提高很可能也是由于过糖基
化所造成的，毕赤酵母分泌表达的黑曲霉 GOD 也表
现出了热稳定性的提高［21］；其次该酶在 pH3.5-7.0
之间能保持 90% 以上酶相对活力，有较高的应用
价值。
本研究中 Zn2+ 对酶有一定的激活作用，而 Ag+、
Cu2+ 和 Fe3+ 对酶的活性有抑制作用，这与张茜［19］
报道的尼崎青霉菌 GOD 的性质一样。而 Kelley 等［22］
报道当 Cu2+ 达到 10 mmol/L 时，GOD 活性仍没有被
抑制 ；苏茉等［18］研究认为 Zn2+ 对黑曲霉 H1-9b 所
产 GOD 的活性有抑制作用。
4 结论
将点青霉菌的葡萄糖氧化酶基因（GOD）克
隆到载体 pMD-AOX 质粒，线性化质粒 pMD-AOX-
GOD，转化到毕赤酵母 Pichia pastoris X33 中异源表
达，获得了 GOD 的高产毕赤酵母工程菌株。结果
显示，与点青霉 GOD 相比，毕赤酵母 Pichia pastoris
X33GOD 具有更高的发酵酶活和比活。
图 9 金属离子对重组 GOD 的影响
2016,32(7) 159高庆华等：点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）