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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):90-99
收稿日期 ：2015-05-13
基金项目 ：“863”项目（2013AA102601）
作者简介 ：刘妍，硕士研究生，研究方向 ：植物基因工程 ；E-mail ：liuyan4368@sina.com
通讯作者 ：张锐，研究员，博士生导师，研究方向 ：棉花基因工程 ；E-mail ：zhangrui71@126.com
陆地棉 GhPYR1 基因的克隆和功能分析
刘妍  孟志刚  孙国清  王远  周焘  郭三堆　张锐
（中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）
摘 要 ： 植物激素脱落酸（Abscisic acid，ABA）在植物应对干旱、盐碱等逆境胁迫以及植物种子萌发、根伸长、芽休眠等
阶段发挥重要作用。PYR/PYL/RCAR 蛋白家族是 ABA 受体，与 ABA 结合后能够启动 ABA 信号传导通路，诱导 ABA 应答基因的表达。
利用电子克隆和 RT-PCR 技术从陆地棉中克隆了 GhPYR1 基因，其编码的 GhPYR1 蛋白与拟南芥中 AtPYR1 蛋白相似度为 73%。将
GhPYR1 蛋白序列与拟南芥 14 个 PYR/PYL/RCAR 家族成员蛋白序列进行比对并构建进化树，发现它与拟南芥 PYR/PYL/RCAR 蛋白
亚家族 III 亲缘关系最近。过表达 GhPYR1 基因的 T3 代拟南芥在外源 ABA 处理下，其种子萌发和初期根生长均滞后于野生型，表
现出对 ABA 更加敏感 ；高盐和干旱胁迫对转基因种子的萌发抑制更强烈，但苗期胁迫处理下转基因拟南芥的长势却明显优于野生
型 ；同时在外源 ABA 诱导条件下 ABA 应答基因 RD29A、RAB18 的表达量较野生型有明显提高。以上结果说明 GhPYR1 基因编码
的蛋白是 ABA 的受体，过表达该基因能够提高植物对 ABA 的敏感性和增强应对逆境胁迫的能力。
关键词 ： 陆地棉 ；GhPYR1 基因 ；生物信息学分析 ；生理功能分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.012
Cloning and Function Analysis of Gene GhPYR1 in Gossypium
hirsutum L.
LIU Yan MENG Zhi-gang SUN Guo-qing WANG Yuan ZHOU Tao GUO San-dui ZHANG Rui
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract: The phytohormone abscisic acid（ABA）plays an important role in response to drought, salinity and other abiotic stress. It
is also a key regulator involved in different plant developmental stages such as seed germination, root elongation, and bud dormancy. The PYR/
PYL/RCAR protein family is the ABA receptor, which can initiate the ABA signaling pathway and induce the expression of ABA response genes.
In this study, gene GhPYR1 was cloned from Gossypium hirsutum L. with electronic cloning and RT-PCR technology. GhPYR1 protein exhibited
73% sequence identity with Arabidopsis AtPYR1 protein. Protein sequence alignment among GhPYR1 and 14 family members of PYR/PYL/
RCAR in Arabidopsis as well as the construction of phylogenetic tree revealed that gene GhPYR1 was most closely related to subfamily III of
PYR/PYL/RCAR protein in Arabidopsis. T3 generation Arabidopsis over-expressing gene GhPYR1were more sensitive to exogenous ABA, as its
seed germination and early root growth lagged behind than wild type. The germination of transgenic seeds was more strongly inhibited by high salt
and drought stress, however, the transgenic lines were significantly better than the wild ones in the seeding stage. Moreover, the ABA-responsive
gene RD29A and RAB18 in transgenic Arabidopsis were significantly induced by ABA compared to the wild type. The above results show that
the protein encoded by gene GhPYR1 is the receptor of ABA and over-expression of GhPYR1 can improve the sensitivity of plant to ABA and
enhance the ability to respond to stress in plants.
Key words: Gossypium hirsutum L. ；GhPYR1 gene ；bioinformatics analysis ；physiological function analysis
2016,32(2) 91刘妍等：陆地棉 GhPYR1基因的克隆和功能分析
植 物 激 素 脱 落 酸（Abscisic acid，ABA）， 在
植物应对干旱、盐碱等非生物胁迫及植物种子成
熟、休眠等发育过程中发挥着重要作用［1，2］。2009
年，Ma 和 Park［3，4］两个实验团队分别通过遗传筛
选和酵母双杂交的方法，在拟南芥中证实了 PYR/
PYL/RCAR 蛋白是 ABA 的受体。拟南芥中该家族
有 14 个成员，分别命名为 PYR1 和 PYL1-13，它们
都是可溶性蛋白质，含有 START（STAR-RELATED
LIPID-TRANSFER）特征区域的蛋白质，分布于细胞
质和细胞核内［5］。PYR/PYL/RCAR 家族蛋白是 ABA
信号通路的起点，而 ABA 信号通路是一个双重负
调控系统［6，7］，核心组分除 PYR/PYL/RCAR 外，还
包括 PP2Cs、SnRK2s。在通常情况下，未结合 ABA
的 PYR/PYL/RCAR 蛋 白 不 与 PP2C 互 作，PP2C 通
过解磷酸化抑制 SnRK2 的活性。当应答来自环境
或发育的信号时，植物体内 ABA 的含量增加，并
与 PYR/PYL/RCAR 结 合 使 其 发 生 变 构［8-10］， 然 后
与 PP2C 互作，抑制 PP2C 的磷酸酶活性［3，4］，从
而使 SnRK2 被激活，活化的 SnRK2 磷酸化下游的
转录因子［11，12］，启动 ABA 应答基因 RD29A、RAB-
18［13，14］等的表达。继拟南芥之后，其他高等植物，
如玉米、大豆、水稻、草莓、青蒿等［15-18］的 ABA
受体研究也逐步展开，结果表明，在这些作物中过
表达 PYR/PYL/RCAR 家族基因成员，能够提高转基
因作物对 ABA 的敏感性、抗旱性和促进果实成熟等。
本研究克隆了陆地棉中 GhPYR1 基因全长，构
建了过表达载体，获得了过表达 GhPYR1 基因的 T3
代拟南芥，并初步鉴定转 GhPYR1 基因的拟南芥在
种子萌发、根生长期间对 ABA、盐碱和干旱的敏感
性以及苗期耐逆性和 ABA 应答基因的表达情况，旨
在为解析 ABA 通路与植物逆境胁迫应答的关系提供
依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 陆地棉 Gossypium hirsutum L. Y18、
拟南芥 Columbia Col-0 由本实验室保存。
1.1.2 载 体 和 菌 株 Gateway 入 门 载 体 Hbskb1-
HI-380、Gateway 目 的 载 体 pEarelyGate330、 农 杆
菌 GV3101 感受态均由本 实 验 室 保 存 ；大 肠 杆 菌
Trans-T1 感受态和克隆载体 pEASYTM-Blunt Zero 购于
北京全式金生物技术有限公司。
1.1.3 仪器与试剂 荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad 公
司 chromo4）；原平皓公司 RNA 提取试剂盒 ；东洋
纺公司 ReverTra Ace 反转录试剂盒 ；天根公司 Fast
HiFidelity PCR Kit ；Promega 公司 GoTag qPCR Master
Mix ；Invitrogen 公 司 Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme
Mix ；各化学试剂均购于 Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 DNA 的提取和 cDNA 和合成 以陆地棉 Y18
叶片为材料，使用改良的 CTAB 法提取棉花的基因
组 DNA ；RNA 的提取过程参照 EASYspin RNA 提取
试剂盒，提取的 RNA 用 ReverTra Ace 反转录试剂
盒反转录成 cDNA。反应体系 20 μL ：先将 RNA 11
μL、Oligo（dT）20 1 μL 混合后，65℃ 5 min ；再加入
5×RT Buffer 4 μL、RNase inhibitor（10 U/μL）1 μL、
ReverTra Ace 1 μL、dNTP Mix（10 mmol/L）2 μL。反
应条件 ：42℃ 30 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。
1.2.2 陆 地 棉 GhPYR1 基 因 编 码 区 的 克 隆 因 为
雷蒙德氏棉的祖先被公认为是陆地棉（Gossypium
hirsutum）D 亚基因组的供体，所以在陆地棉基因组
尚未公布的前提下，本研究以雷蒙德氏棉（Gossypi-
um raimondii）的基因组序列为参考，以 AtPYR1 基
因 序 列 Blast 雷 蒙 德 氏 棉 基 因 组 数 据 库， 并 结 合
开放阅读框预测工具 ORF Finder 预测得到可能的
GrPYR1 基因的编码序列。在基因编码区两侧设计
引物 GhPYR1F/R（表 1），以陆地棉 DNA 和 cDNA
表 1 引物序列表
引物名称 序列（5-3） 用途
GhPYR1F GCGGCCGCATGGCTGAACCCGAAT-
CCGAAC
基因克隆、载
体构建及 PCR
鉴定GhPYR1R CCTGCAGGCATCACCTGTGATTTAT-
TACAATCG
35SF ATGACGCACAATCCCACTATCCTTC qRT-PCR 引物
RD29AF CAGGTGAATCAGGAGTTGTT
RD29AR CCGGAAATTTATCCTCTTCT
RAB18F ATCGATCAAACTCATCAAAGTCTAA
RAB18R CGAGCTAGAGCTGGATCCAGA
GAPDHF TGAAATCAAAAAGCTATCAAGG
GAPDHR CATCATCCTCGGTGTATCCAA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.292
为 模 板 进 行 PCR 扩 增。 扩 增 体 系 为 50 μL ：Fast
HiFidelity Polymerase 1 μL、5×Fast HiFidelity PCR
Buffer 10 μL、10 mmol/L 上下游引物各 2 μL、模板
DNA/cDNA 2 μL、ddH2O 33 μL。PCR 反应程序为 ：
94℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，58℃退火 30 s，
72℃延伸 30 s，30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。
回收纯化 PCR 产物与克隆载体 pEASYTM-Blunt Zero
连接并转入大肠杆菌感受态 Trans-T1，挑取克隆子
用 GhPYR1F/R 引物进行菌落 PCR 检测，将阳性克
隆子送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。
1.2.3 GhRYR1 基 因 的 序 列 分 析 将 GhPYR1 基 因
编 码 的 蛋 白 序 列 Blast Swiss-Prot 蛋 白 数 据 库 ；利
用 MEGA 5.0 将 GhPYR1 和 AtPYR1、AtPYL1-13
蛋 白 序 列 进 行 比 对， 构 建 NJ 系 统 进 化 树 ；利 用
Protparam tool（http://web.expasy.org/protparam/）在线
程序对 GhPYR1 的基本性质进行分析。利用在线程
序 PSORT（http://psort.hgc.jp/form.html）进行亚细胞
定位预测。
1.2.4 过 表 达 载 体 的 构 建 在 GhPYR1 基 因 编 码
序列的 5 和 3 端分别加上 Not Ⅰ和 Sbf Ⅰ两个酶
切位点，PCR 扩增获得目的条带，回收后连接到
到 pEASYTM-Blunt Zero 克隆载体上，测序正确后与
Gateway 入门载体 Hbskb1-HI-380 同时进行 Not Ⅰ /
Sbf Ⅰ双酶切，回收目的片段经 T4 连接酶连接后
构建 GhPYR1-380 入门载体。然后通过 Gateway LR
反应构建过表达载体，反应体系 5 μL ：入门载体
GhPYR1-380 1 μL、 目 的 载 体 pEarlyGate330 3 μL、
Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix 1 μL，轻轻混匀后，
25℃孵育 6 h 后加 1 μL Proteinase K Solution 1 μL 结
束反应。产物转化大肠杆菌 Trans-T1 感受态，进行
菌落 PCR 和测序鉴定，获得阳性克隆子，成功构建
植物表达载体 pOEGhPYR1。
1.2.5 拟南芥转化和鉴定 将表达载体 pOEGhPYR1
通过热激法转化农杆菌 GV3101 感受态细胞，将鉴
定为阳性的农杆菌通过蘸花法转化野生型拟南芥植
株。将 T1 代拟南芥种子在含 50 mg/L 卡那霉素的
MS 固体培养基上进行筛选，提取 T1 代抗性植株的
DNA 进行 PCR 鉴定，为保证检测的正确性，每个
抗性植株分别用两对引物进行鉴定，一对特异扩增
GhPYR1 基因，另一对特异扩增部分 CaMV 35S 启动
子和 GhPYR1 基因，引物序列见表 1。收获 PCR 鉴
定为阳性的 T1 代植株种子，经 T2 代繁殖及进一步
抗性筛选最终获得纯合 T3 代株系，并对 T2、T3 代转
基因株系进行 PCR 鉴定。
1.2.6 转基因植株的生理实验分析 为了分析种子
萌发时转基因拟南芥对 ABA、高盐及干旱的反应情
况，将野生型和转基因植株的种子分别播种到 MS
及分别含 0.5 μmol/L ABA、200 mmol/L 甘露醇、100
mmol/L NaCl 的 MS 固体培养基上。每种培养基上，
野生型和转基因植株的 3 个株系分别点 40-50 粒种
子，每种处理做 3 个重复。然后 4℃冰箱黑暗春化
3 d，于气候培养箱 23℃/20℃，16 h 光照 /8 h 黑暗条
件下萌发 5 d 后进行拍照和种子萌发率的统计分析。
为 了 分 析 外 源 ABA、 高 盐 及 干 旱 条 件 下 转
基因拟南芥根生长初期的生长情况，首先将 WT、
OEGhPYR1-1、OEGhPYR1-2 在 MS 上 萌 发 7 d，7 d
后将植株转移至含5 μmol/L ABA、200 mmol/L甘露醇、
100 mmol/L NaCl 的 MS 固体培养基上继续培养，7 d
后进行拍照并统计根长。
1.2.7 ABA 应答基因的表达分析 将在 MS 培养基
上生长 10 d 的野生型和转基因型拟南芥幼苗用 10
μmol/L ABA 处理 3 h。收集 ABA 处理前和 ABA 处理
后的拟南芥材料后液氮速冻。提取拟南芥的 RNA 并
反转录为 cDNA 作为模板。通过实时定量 PCR 进行
ABA 应答基因 RD29A、RAB18 的表达量分析，内参
对照选择拟南芥 GAPDH 基因。本实验所用引物见表
1。反应体系 20 μL ：GoTag qPCR Master Mix（2×）
10.0 μL、cDNA 2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 0.4
μL、ddH2O 7.2 μL，每次实验设定 3 个重复。反应程
序为 ：98℃ 2 min ；98℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，
40 个循环。统计每个反应的荧光强度达到阈值时对
应的循环数（Ct）。目的基因相对于内参基因的相对
表达量用 2 - △△ Ct 法计算。
2 结果
2.1 GhPYR1基因克隆、序列分析及载体构建
分别以陆地棉 DNA 和 cDNA 为模板进行 PCR
扩增，均获得大小约 600 bp 左右、单一、清晰的条
带（图 1-A 和 B）。测序结果显示，扩增产物长 618
bp，编码 205 个氨基酸残基，ORF 区无内含子。将
2016,32(2) 93刘妍等：陆地棉 GhPYR1基因的克隆和功能分析
GhPYR1 基因序列 Blast 陆地棉基因组，结果显示
GhPYR1 基因在陆地棉 A 基因组和 D 基因组的第 3
号染色体上各有一个拷贝，说明克隆得到 GhPYR1
基因。将 GhPYR1 序列 Blast Swiss-Prot 数据库，显
示 GhPYR1 具有 PYR/PYL/RCAR 蛋白家族的特征结
构域（图 2-A），且与拟南芥 AtPYR1 有最高相似度，
为 73%（图 2-B）。
利用 MEGA 5.0 软件分析 GhPYR1 和拟南芥中
14 个 PYR/PYL/RCAR 家 族 成 员， 并 进 行 NJ 进 化
树分析，结果（图 3）表明，拟南芥的 PYR/PYL/
RCAR 家族被分成了 3 个亚家族，而 GhPYR1 与拟
南芥第Ⅲ亚家族的亲缘关系最近。利用 Protparam
tool 在 线 程 序 分 析 GhPYR1 的 基 本 性 质， 结 果 表
明，其由 205 个氨基酸残基组成，蛋白分子式为
C1001H1584N280O318S7，分子量为 22853.6 Da，等电点 pI
为 5.47，亲水性平均数为 -0.364，属于水溶性蛋白。
利用在线程序 PSORT 预测 GhPYR1 的亚细胞定位特
性，结果表明 GhPYR1 定位于细胞质的分值为 0.65，
而定位于叶绿体基质、叶绿体类囊体膜、叶绿体类
囊体间隙的分值均为 0.2，因此推测 GhPYR1 主要分
布于细胞质中。
将 GhPYR1 基 因 首 先 克 隆 到 pEASYTM-Blunt
Zero 载体上，随后经 Not Ⅰ和 Sbf Ⅰ双酶切与载体
Hbskb1-HI-380 连接，构建成功 GhPYR1-380 入门载
体（图 1-C 和 D）。最后入门载体 GhPYR1-380 与目
的载体 pEarelyGate330 在定量后进行 LR 反应，构建
1 M 2 M
A B
5 M
DC
0.5
kb
3 4 M
0.5 0.5
kb
8 M
F
0.5
kb
3.0
kb
E 6 7 M
3.0
kb
M ： DNA ladder（100 bp-1 kb）；A ：GhPYR1 基因 cDNA 扩增电泳图（1 ：GhPYR1 基因 ) ；B ：GhPYR1 基因 DNA 扩增电泳图（2 ： GhPYR1 基
因）；C ：GhPYR1-TEASY 与入门载体 Hbskb1-HI-380 经 Not Ⅰ和 Sbf Ⅰ双酶切 （3 ：GhPYR1-TEASY 双酶切 ；4 ： Hbskb1-HI-380 双酶切）；D ：
GhPYR1-380 经 Not Ⅰ和 Sbf Ⅰ双酶切鉴定（5： GhPYR1-380 质粒）；E：GhPYR1-380 与目的载体 pEarelyGate330 质粒定量（6：GhPYR1-380 质粒；
7 ：pEarelyGate330 质粒）；F ：过表达载体 pGhPYR1 酶切鉴定（8 ： 过表达载体 pGhPYR1）
图 1 GhPYR1 基因的克隆及载体
成功表达载体 pOEGhPYR1（图 1-E 和 F）。
2.2 转GhPYR1基因拟南芥获得
将 pOEGhPYR1 载 体 转 化 农 杆 菌，PCR 鉴 定
（图 4-A）为阳性后，利用蘸花法转化野生型拟南芥，
T1 代转基因拟南芥 PCR 鉴定结果如图 4-B 所示。每
个抗性植株分别用两对引物进行鉴定，产物大小分
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.294
别为 615 bp 和 826 bp，野生型受体拟南芥无特异扩
增。经鉴定最终获得 T1 代转株 GhPYR1 基因拟南芥
阳性植株 39 株。收获 T2 代拟南芥种子进行筛选后
得到各个株系的拟南芥单株，经 PCR 鉴定（图 4-C）
后进行繁代，收获得到 T3 代种子后进行抗性筛选，
选择在筛选平板上不分离的株系进行 PCR 鉴定后
（图 4-D），最终获得 3 个纯合转基因株系，分别命
名为 OEGhPYR1-1、OEGhPYR1-2、OEGhPYR1-3。
2.3 转GhPYR1基因拟南芥的生理鉴定
2.3.1 T3 代 转 GhPYR1 基 因 拟 南 芥 的 种 子 萌 发 实
验 以野生型拟南芥为对照，在 MS 和分别含 0.5
μmol/L ABA、100 mmol/L NaCl、200 mmol/L 甘露醇
的 MS 固体培养基上进行转基因拟南芥种子萌发实
验，结果如图 5 所示。图 5-A 显示，在 MS 培养基
Putative conserved domains have been detected, click on the image below for detailed results.
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1 40
Query
80 120 160 200
4050 5080 80200 ı200Color key tor allgnment scoresSuper families
1 25 50 75 100 125 150 175 200
A
B
A ：GhPYR1 具有 PYR-PYL-RCAR like 保守结构域 ；B ：GhPYR1 与 AtPYR1 相似度最高
图 2 GhPYR1 蛋白 Blast NCBI Swiss-Prot 结果
AtPYL7
AtPYL9
AtPYL8
AtPYL10
AtPYL12
AtPYL11
AtPYL13
I
II
III
AtPYL5
AtPYL6
AtPYL4
80
100
100
91
62
84
42
99
98
95
100
99
AtPYL1
AtPYL2
AtPYL3
AtPYR1
GhPYR1
0.05
图 3 GhPYR1 与拟南芥 14 个 PYR/PYL/RCAR 蛋白的进化树分析
2016,32(2) 95刘妍等：陆地棉 GhPYR1基因的克隆和功能分析
上，野生型和转基因型拟南芥表现一致，均能正常
萌发，长出绿色的子叶，萌发率在 95%-98% 之间
（表 2）；而在含 0.5 μmol/L ABA MS 的培养基上，转
基因拟南芥和野生型之间表型表现出显著差异，野
生型种子大多数能正常萌发，并长出绿色的子叶，5
d 萌发率在 90% 以上，3 个转基因株系则表现为萌
发滞后，同期观察长出绿色子叶的种子数量很少，
萌发率在 75%-87% 之间（图 5-B，表 2），野生型
和转基因株系间存在极显著差异（图 6）。在含 100
mmol/L NaCl 的培养基上，所有拟南芥的萌发率都下
降，但野生型相对下降幅度较小，5 d 萌发率仍维持
在 80% 以上，3 个转基因株系则大幅度下降，5 d 萌
发率仅有 5%-8% 左右（图 5-C，表 2），野生型和转
基因株系间存在极显著差异（图 6）。类似地，在含
200 mmol/L 甘露醇培养基上，3 个转基因株系的 5 d
萌发率下降至 6%-14%（图 5-D，表 2），与野生型
之间同样表现出极显著差异（图 6）。干旱、高盐等
生理逆境会引起细胞内脱水［19］进而植物通过增加
ABA 的合成和 ABA 代谢的调整使得植物体内 ABA
的含量上升［20］，上述结果表明，转 GhPYR1 基因拟
1 2 N M
0.5
kb
1 2 3 N M
0.5
kb
0.5
kb
1 2 3 4 M M
0.5
kb
1 2 35 6 7 8
C D
A B
A ：转化农杆菌的鉴定（1-2 ：2 个农杆菌单菌落 ；N ：阴性对照 ；M ：DNA ladder）；B ：T1 代转基因拟南芥的鉴定（1-3 ：转基因拟南芥
植株 ；N ：野生型拟南芥对照 ；M ：DNA ladder）；C ：T2 代转基因拟南芥的鉴定（1-8 ：部分 T2 代转基因拟南芥单株 ；M ：DNA ladder）；D ：
T3 代转基因拟南芥的鉴定（1-3 ：转基因纯合株系 OEGhPYR1-1、OEGhPYR1-2、OEGhPYR1-3 ；M ：DNA ladder）
图 4 农杆菌及转基因拟南芥的鉴定
OEGhPYR1-1
W
T
OEGhPYR1-3
O
EG
hP
Y
R
1-
2
OEGhPYR1-1
W
T
OEGhPYR1-3
O
EG
hP
Y
R
1-
2
OEGhPYR1-1
W
T
OEGhPYR1-3
O
EG
hP
Y
R
1-
2
OEGhPYR1-1
W
T
OEGhPYR1-3
O
EG
hP
Y
R
1-
2
A B C D
A ：MS 固体培养基上野生型和转基因拟南芥的萌发 ；B ：含 0.5 μmol/L ABA 的 MS 固体培养基上野生型和转基因拟南芥的萌发 ；C ：含 100
mmol/L NaCl 的 MS 固体培养基上野生型和转基因拟南芥的萌发 ；D ：含 200 mmol/L 甘露醇的 MS 固体培养基上野生型和转基因拟南芥的萌发
图 5 T3 代转 GhPYR1 基因拟南芥的种子萌发实验
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.296
南芥植株比野生型对 ABA 更敏感，而 ABA 含量的
增加，无论是外源的，还是内源的，都会影响拟南
芥种子的萌发，使其萌发率下降，萌发期滞后。
2.3.2 转 GhPYR1 基因拟南芥苗期耐逆实验 拟南
芥在 MS 平板上萌发生长 7 d 后，转移至分别含 5
μmol/L ABA、100 mmol/L NaCl、200 mmol/L 甘 露 醇
的 MS 固体培养基上继续培养 7 d，生长状况如图 7-
9 图所示。在 5 μmol/L 外源 ABA 处理下（图 7-A），
转 GhPYR1 基因的拟南芥植株的平均根长不足 5 cm，
而野生型拟南芥的平均根长在 6.5 cm 以上，极显著
于转基因拟南芥（图 7-B）。这一结果表明 ABA 具有
抑制拟南芥根生长的特性，而且，转基因拟南芥的
根生长被抑制程度更深，说明转基因拟南芥比野生
型对 ABA 更加敏感。
在 100 mmol/L NaCl 处理下，转 GhPYR1 基因的
拟南芥植株生长状况优于野生型（图 8-A），转基因
拟南芥的平均根长在 4.4 cm 以上，而野生型的在 3.7
cm 左右，显著短于转基因拟南芥（图 8-B）。结果表
明， 在 种 子 萌 发 后 期 根 的 生 长 过 程 中， 过 表 达
GhPYR1 基因的拟南芥较野生型更能适应高盐环境。
同样地，在模拟干旱条件下，GhPYR1 基因过表达
植株根的生长优于野生型（图 9-A），转基因拟南芥
的平均根长在 6.8 cm 以上，而野生型的根长在 6.0
cm 左右，差异极显著于转基因拟南芥（图 9-B）。上
述结果表明，100 mmol/L NaCl 和 200 mmol/L 甘露醇
均为拟南芥苗期生长的逆境，会抑制拟南芥的生长，
但转基因拟南芥相对生长状况要优于野生型，说明
200 mmol/L Mannitol
95.38 96.23 96.3495.83
81.66
86.59
75.78
91.62
6.81
13.64
9.30
98.01
85.05
5.32 7.84 5.71
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
WT OEGhPYR1-1 OEGhPYR1-2 OEGhPYR1-3
㨼ਁ⦷% MS05 μmol/L ABA100 mmol/L NaCl** ****
**
****** ** **
图 6 不同处理下野生型和转基因型拟南芥的萌发率
表 2 不同处理下野生型和转基因型拟南芥萌发率 /%
添加剂及浓度 WT OEGhPYR1-1 OEGhPYR1-2 OEGhPYR1-3
MS0 98.01±1.6048 95.38±1.2517 96.23±1.1931 96.34±1.1074
0.5 μmol/L ABA 95.83±2.1997 81.66±1.1511** 86.59±1.2355** 75.78±1.5315**
100 mmol/L NaCl 85.05±0.9295 5.32±1.1503** 7.84±0.9848** 5.71±1.8494**
200 mmol/L Mannitol 91.62±1.0511 6.81±1.7760** 13.64±3.2610** 9.30±1.3294**
注 ：各数据均为 x-±s，n=4 ；转基因植株分别与相同处理下的野生型数据进行显著性差异分析，* 表示差异显著 P<0.05 ；** 表示差异极显著 P<0.01
8
7
6
5
4
3
2
1
0
ṩ䮯cm
WT-1 OEGhPYR1-1 WT-2
B
6.52
4.56
**
6.71
4.9
**
A WT OEGhPYR1-1
OEGhPYR1-2
WT OEGhPYR1-2
A ：OEGhPYR1-1、OEGhPYR1-2 分别与 WT 拟南芥在含 5 μmol/L ABA 的 MS
固体培养基上生长情况比较 ；B ：根长统计分析
图 7 苗期野生型和转基因拟南芥在外源 ABA 条件下生长
情况
2016,32(2) 97刘妍等：陆地棉 GhPYR1基因的克隆和功能分析
转基因拟南芥具有较强的耐逆性。
2.4 ABA应答基因的表达分析
为了探明 ABA 与受体结合后，是否能启动下游
应答基因的表达，利用 qRT-PCR 的方法，分析了在
外源 ABA 处理前和处理后，野生型和转 GhPYR1 基
因拟南芥中 ABA 应答基因 RD29A 和 RAB18B 的表
达量变化，结果如图 10 所示。在 ABA 处理前，转
GhPYR1 基因的拟南芥中 RA29A 基因的表达量略高
于野生型，是野生型的 1.81 倍，RAB18 基因的表达
量略低于野生型，无明显差异 ；在 ABA 处理后，转
GhPYR1 基因的拟南芥和野生型中，RD29A 基因的
表达量都有所增加，野生型中增加了 20%，而转基
因中增加了 622%，达到处理前野生型的 8.08 倍 ；
类似地，RAB18 基因的表达量在处理后的野生型和
转 GhPYR1 基因拟南芥中均有所增加，在野生型中
增加了 56%，在转基因中增加了 457%，达到处理前
野生型的 5.38 倍。这些结果表明，在转 GhPYR1 基
因的拟南芥中，ABA 通路的活性要高于野生型，特
别是经 ABA 处理后，活性大幅提升，应答基因大量
表达，以使植物应对干旱、高盐等逆境。
7
6
5
4
3
2
1
0
ṩ䮯cm
WT-1 OEGhPYR1-1 WT-2
B
3.76
5.02
3.70
4.42
*
*
A WT-1 OEPYR1-1
OEGhPYR1-2
WT-2 OEPYR1-2
A ：OEGhPYR1-1、OEGhPYR1-2 分别与 WT 拟南芥在含 100 mmol/L NaCl 的
MS 固体培养基上生长情况比较 ；B ：根长统计分析
图 8 苗期野生型和转基因拟南芥在高盐条件下生长情况
8
9
7
6
5
4
3
2
1
0
ṩ䮯cm
WT-1 OEGhPYR1-1 WT-2
B
6.04
7.17
6.07
6.86
****
A WT OEPYR1-1
OEGhPYR1-2
WT OEPYR1-2
A ：OEGhPYR1-1、OEGhPYR1-2 分别与 WT 拟南芥在含 200 mmol/L 甘露醇
的 MS 固体培养基上生长情况比较 ；B ：根长统计分析
图 9 苗期野生型和转基因拟南芥在模拟干旱条件下的生长
情况
8
10
12
6
4
2
0
RD
29
Aสഐ⴨ሩ㺘䗮䟿
ABA༴⨶ࡽ
A
WT
B
ABA༴⨶ਾ
2
3
4
5
6
7
1
0
RA
B1
8สഐ⴨ሩ㺘䗮䟿
ABA༴⨶ࡽ1.00 0.81 1.56
5.38
ABA༴⨶ਾ
OEGhPYR1-1
WT
1.00
1.81
1.20
8.03
OEGhPYR1-1
A ：RD29A 基因的相对表达量 ；B ：RAB18 基因的相对表达量
图 10 野生型和转基因型拟南芥中 ABA 应答基因表达量
比较
3 讨论
ABA 通路在植物应对干旱、盐碱等非生物胁
迫及植物种子成熟、休眠等发育过程中发挥着重要
的作用。植物遭遇干旱、盐碱等逆境胁迫时，体内
ABA 含量增加，ABA 受体通过与 ABA 结合感知这
一信号，从而激活 ABA 通路，提高植物体内耐逆相
关基因表达，从而使植物度过逆境胁迫期。因此，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.298
提高植物对 ABA 信号的敏感性，有助于植物对逆境
胁迫作出快速及时的反应，提高植物的抗逆性。
本研究通过同源克隆的方法，从陆地棉中克隆
了 GhPYR1 基因。该基因在陆地棉中只有一个外显
子，ORF 长 618 bp，编码 205 个氨基酸残基，编码
序列含有 PYR/PYL/RCAR 蛋白家族的特征结构域，
与拟南芥中 AtPYR1 蛋白相似度为 73%，与拟南芥
中 的 AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2 及 AtPYL3 关 系 最
近，同属于第Ⅰ亚家族，亚细胞定位预测其最可能
分布于细胞质。过表达 GhPYR1 基因的拟南芥在添
加外源 ABA 的情况下表现出种子休眠期延长，萌发
滞后，苗期生长发育迟缓的现象，说明其对 ABA 的
敏感性增强，这一结果和在拟南芥中过表达青蒿的
PYR/PYL/RCAR 家族基因 AaPYL9，提高了转基因拟
南芥种子在萌发时对 ABA 的敏感性［17］相一致。
种子萌发包括吸胀、萌动和萌发等连续的生理
过程，是一个需水较多的生理时期。干旱、盐碱等
逆境，由于缺水会抑制种子萌发，导致萌发滞后等
现象发生，这是植物的一种自我保护手段，而 ABA
通路应该是参与这一自我保护调控过程的主要因子。
干旱、盐碱等逆境会诱导植物体内 ABA 含量增加，
从而激活和增强 ABA 通路，引起下游耐逆基因的大
量表达，同时抑制萌动、萌发等相关基因的表达。
本研究中拟南芥种子萌发时添加外源 ABA 的实验，
证实了植物在种子萌发期对 ABA 信号的应答，拟南
芥将环境中 ABA 含量升高这一现象，解读为存在干
旱、盐碱等逆境，从而启动植物体内的逆境应答反
应，而不是正常状态下的萌发，因而出现了和干旱、
盐碱状态下相似的表型。过表达 GhPYR1 基因的拟
南芥，因为对 ABA 的信号更加敏感，所以在相同浓
度的外源 ABA 或逆境条件下，其种子的萌发被抑制
得更为强烈。
在植物生长期，ABA 通路是植物应对逆境的主
要信号通路。本研究对苗期的拟南芥进行干旱和高
盐处理，转基因拟南芥表现出更好的生长势即说明
了这一点，因为在转基因拟南芥中，ABA 通路被激
活的程度，要数倍强于野生型在同等条件下被激活
的程度。RD29A 基因的表达量，在逆境下野生型只
增加 20%，而在转基因拟南芥中却增加了 622%，达
到处理前野生型的 8.08 倍 ；RAB18B 基因的表达量，
在逆境下野生型中增加 56%，而在转基因中则增加
了 457%，是处理前野生型的 5.38 倍。也正因为转
基因拟南芥对 ABA 更敏感，所以在只添加 ABA 的
模拟逆境环境下，转基因拟南芥的生长势要弱于野
生型，因为拟南芥将环境中的 ABA 信号，解读为逆
境信号，而同等信号强度下，转基因拟南芥激活的
ABA 通路的基因表达要数倍于野生型，而对应的它
抑制的与促进植物生长有关的通路基因的表达，也
应数倍于野生型。而恰恰因为这只是一个模拟逆境
的状态，并不存在真实逆境对植物生长的伤害，所
以，ABA 通路表达弱的野生型拟南芥反而长势优于
通路表达强的转基因拟南芥。
本研究结果证明了 GhPYR1 基因编码的蛋白是
ABA 的受体，同时证明了过表达 GhPYR1 基因的拟
南芥植株提高了对 ABA 的敏感性和增强了应对逆境
胁迫的能力，但同时也会抑制种子的萌发，所以将
该基因用于植物基因工程，用以提高植物耐旱、耐
盐碱性的时候，最好避免使用 CaMV 35S 这种组成
型表达的启动子，而代之以组织特异性或诱导表达
型启动子，以期在提高目的基因在靶标组织表达的
同时，降低其对种子萌发的抑制。
4 结论
GhPYR1 基因是拟南芥中 AtPYR1 基因的同源
基因，在拟南芥中过表达 GhPYR1 基因能够提高转
基因植株对 ABA 的敏感性。表现为在外源 ABA 存
在、干旱和高盐胁迫条件下，其种子的休眠期延长，
萌发率下降。同时，在苗期，转基因拟南芥对外源
ABA 敏感，更能适应高盐及干旱环境。在外源 ABA
条件下，ABA 应答基因的表达量提高，使得植物能
够对 ABA 信号做出及时反应，以启动植物体内的信
号传导机制，使植物安全度过逆境胁迫期。
参 考 文 献
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2016,32(2) 99刘妍等：陆地棉 GhPYR1基因的克隆和功能分析
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（责任编辑 李楠）