全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):121-127
金属硫蛋白（Metallothioneins，MTs）是一类相
对分子质量较低（约 6-7 kD）、富含半胱氨酸残基、
能与金属离子结合的胞质蛋白，在几乎所有真核生
物以及一些原核生物中都有表达［1-2］。从 NCBI 中可
以检索到 1 013 个植物 MTs 序列和类 MTs 序列，它
们在所有主要类群的维管植物中都存在，包括种子
植物、裸子植物、蕨类植物和拟蕨类植物［3］。尽管
它们的进化起源还未完全清楚［4］，但它们的序列具
收稿日期 ：2015-07-28
基金项目 ：新疆维吾尔自治区高技术研究发展项目（201416102）
作者简介 ：孟红恩，男，硕士研究生，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：menghongenxju@163.com
通讯作者 ：刘忠渊，男，博士，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：lzy1168@163.com
盐穗木金属硫蛋白 HcMT 在大肠杆菌中高效表达及
金属离子结合能力的检测
孟红恩 杜荣俸 徐鑫 刘忠渊
（新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046）
摘 要 ： 旨在研究盐穗木金属硫蛋白 HcMT 基因原核表达情况及结合金属离子的能力。从盐穗木中克隆获得的金属硫蛋白
（HcMT）基因亚克隆至 pGEX-6p-2 原核表达载体上，在大肠杆菌 BL21 中表达，分离纯化融白蛋白 GST-HcMT，通过原子吸收分光
光度法测定融合蛋白 GST-HcMT 结合金属离子的量以判断其与金属离子的结合能力。结果显示，诱导表达的融合蛋白 GST-HcMT
分子量在 34 kD 左右，与预期一致，且通过 Western blot 进一步得到验证 ；原子吸收结果表明其具有结合 Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+ 的
能力，融合蛋白结合 Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+ 的量分别是对照的 25 倍、10 倍、4 倍和 2 倍，其结合能力大小为 Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+。
关键词 ： 盐穗木金属硫蛋白 ；原子吸收分光光度法 ；金属离子结合能力
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.016
High-level Expression of a Type 2 Metallothionein Protein（HcMT）
from Halostachys caspica in Escherichia coli and Its Metal-binding
Ability
MENG Hong-en DU Rong-feng XU Xin LIU Zhong-yuan
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，
Xinjiang University，Urumqi 830046）
Abstract: This study aims to evaluate the prokaryotic expression and metal-binding ability of metallothionein protein in Halostachys
caspica（HcMT）. HcMT cloned from H. caspica was transferred to prokaryotic expression vector pGEX-6p-2 and expressed in Escherichia
coli BL21. Then the glutathione S-transferase（GST）fusion protein（GST-HcMT）was isolated and purified. Using atomic absorption
spectrometry，the metal-binding ability of the GST-HcMT was determined by measuring the amount of metal ions it bound with. The results
showed that the molecular weight of expressed fusion protein GST-HcMT was about 34 kD，which was as expected and confirmed by Western
blot. Furthermore，GST-HcMT bound 25，10，4，2 folds of Cu2+，Zn2+，Pb2+，and Cd2+ separately as GST alone，and the binding ability of
GST-HcMT was as follows ：Cu2+ > Cd2+ > Zn2+ > Pb2+.
Key words: metallothionein protein from Halostachys caspica（HcMT）；atomic absorption spectrometry（AAS）；metal-binding ability
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4122
有相同的特征。植物 MTs 根据半胱氨酸残基位置和
排列顺序的不同可以分为 3 类，即 I 类、II 类和 III
类（Class I，II，III）。I 类 MTs 含有两个小的富含
半胱氨酸残基的结构域，中间被一个不含有半胱氨
酸残基的间隔序列（大约 30-40 个氨基酸）隔开，
其中的 Cys 按 C-X-C、C-X-X-C 和 C-C（X 为除半胱
氨酸的其他氨基酸）的方式排列，根据蛋白序列中
半胱氨酸残基位置与排列顺序的不同又可以分为 4
个亚型（Type 1-4）［5］。大部分植物 MTs 都是 I 类
MT。Type 2 型植物金属硫蛋白通常含有 14 个半胱
氨酸残基，主要在叶中表达［6］。
金属硫蛋白在清除自由基、金属离子的代谢与
解毒等生命进程中发挥着重要作用［2，7］。一些植物
金属硫蛋白的表达可以被过氧化物、盐、干旱、冷、
重金属等非生物胁迫所诱导表达［1，8-10］。螯合金属
离子是金属硫蛋白中巯基簇的主要功能［6］，金属
硫蛋白可以结合 Zn2+、Cd2+、Hg2+、Cu2+、Pb2+ 等离
子，并可参与维持金属离子的稳态［11］。有研究发现
每种金属硫蛋白对某一种离子有较高的亲和性而对
其他离子只有较低的亲和性［12］。在大肠杆菌、酵母
以及其他植物中过表达 Type 2 型金属硫蛋白可以增
强其对金属离子的耐受性以及富集更多相应的金属
离子。例如，在大肠杆菌中表达海茄苳（Avicennia
marina） 金 属 硫 蛋 白 AmMT2 可 以 增 强 其 对 Zn2+、
Cu2+、Pb2+ 和 Cd2+ 的耐受性，且对 Cd2+ 有较高的亲
和力［13］。木榄（Bruguiera gymnorrhiza）金属硫蛋白
BgMT2 同 样 可 以 结 合 Zn2+、Cu2+、Pb2+ 和 Cd2+［14］。
过表达芥菜（Brassica juncea）金属硫蛋白 BjMT2 的
大肠杆菌中显示出较强的拮抗 Cu2+ 和 Cd2+ 胁迫的
能力，而转 BjMT2 的拟南芥若不外源添加 Cu2+ 其根
的生长将受到抑制［15］。同样，过表达天蓝遏蓝菜
（Thlaspi caerulescens）金属硫蛋白 TcMT2a 和 TcMT3
的 拟 南 芥 根 的 生 长 受 到 影 响［16］， 这 可 能 与 金 属
硫蛋白参与必需金属元素的代谢相关。而转盐穗
木（Arabidopsk thaliana） 金 属 硫 蛋 白 AtMT2b 烟 草
可以提高其对亚砷酸盐的敏感性以及根至芽中的迁
移［17］。这些结果表明金属硫蛋白可能是以结合金属
离子的形式参与植物体内金属离子的稳态以及运输。
而且，不同植物中不同的金属硫蛋白对各种金属离
子有不同的亲和力［18，19］。每一种金属硫蛋白都能与
多种金属离子结合，而每一亚型的金属硫蛋白的作
用机理还不明确，因此研究每一个植物金属硫蛋白
的功能对于更好地理解它们在植物中的作用有重要
的意义。
本研究从盐穗木（Halostachys caspica）中分离
鉴定一个 Type 2 型金属硫蛋白基因（HcMT）并亚克
隆至 pGEX-6p-2 表达载体，原核表达并纯化融合蛋
白 GST-HcMT，以期检测其与金属离子的结合能力。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株 原核表达载体 pGEX-6p-2 为新
疆生物资源基因工程重点实验室保存，pMD18-T 载
体 购 自 TaKaRa 公 司， 菌 株 DH5α 和 BL21（DE3）
购自北京全式金生物技术有限公司。
1.1.2 主要试剂 各种限制性内切酶、T4 DNA 连接
酶、异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以及 DNA
标准品购于 TaKaRa 公司。Taq DNA 聚合酶、胶回
收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自天根生化科技有
限公司。GST Bind Resin 和填料柱购自 Novagen 公司。
PVDF 膜购自 Millipore 公司，显色试剂购自碧云天
生物技术公司。引物合成及序列测定由上海生工生
物工程股份有限公司完成。其他常用试剂均为分
析纯。
1.2 方法
1.2.1 原核表达载体的构建 根据盐穗木金属硫蛋
白（HcMT）cDNA 基 因（GenBank 登 录 号 ：HS586-
469.1）序列设计了 2 条引物 ：上游引物 Pl ：5-CCGG
AATTCCCATGTCTTGCTGTGGTGG-3，下游引物 P2：
5-CCGCTCGAGTCATTTGCAGGTGCAAGGG-3，并分
别在上、下游引物中插入 EcoR I 和 Xho I 酶切位点
（下划线部分）。通过 PCR 扩增、胶回收后连接到
pMD18-T 载体上构成重组质粒 pMD18-T-HcMT。质
粒 pMD18-T-HcMT 与 pGEX-6p-2 分 别 用 EcoR I 和
Xho I 双酶切，将双酶切后的 pGEX-6p-2 和 HcMT 片
段经 T4 DNA 连接酶 4℃连接过夜，连接产物转化大
肠杆菌 DH5α 感受态细胞，抗生素筛选，挑取阳性
克隆进行菌液 PCR 鉴定、测序鉴定。
1.2.2 SDS-PAGE 检测 HcMT 的表达 将测序正确的
pGEX-6p-2-HcMT 质粒转化 BL21（DE3）感受态细胞。
2016,32(4) 123孟红恩等：盐穗木金属硫蛋白HcMT 在大肠杆菌中高效表达及金属离子结合能力的检测
阳性单克隆接种于 5 mL 含 50 mg/L Amp 的 LB 培养
基，37℃、220 r/min 过夜培养，按体积比 1∶100 转
接入 50 mL LB（含 Amp）新鲜培养基，相同条件下
继续培养，当 OD600 达到 0.4-0.6 时，加 IPTG 至终
浓度为 1 mmol/L，诱导表达 4 h，收集 2 mL 菌液离心，
沉淀用 100 μL 1×SDS 上样缓冲液彻底悬浮，煮沸
15 min，15% SDS-PAGE 电泳分析表达结果。
1.2.3 融合蛋白的纯化及浓度测定 12 000 r/min，
10 min 离心收集大量诱导表达后的菌体，用 4%（体
积 分 数 ） 的 冰 冷 1×GST 洗 涤 缓 冲 液（4.3 mmol/L
Na2HPO4，1.47 mmol/L KH2PO4，0.137 mmol/L NaCl，2.7
mmol/L KCl，pH7.3）重悬，超声破碎，离心收集上
清液。取 GST Bind Resin 填料装柱，使其自然沉降，
用 5 倍柱床体积的冰冷 1×GST 洗涤缓冲液平衡，
将收集的上清液逐滴加到柱子上，控制流速每小时
10 倍柱床体积左右，然后用 10 倍柱床体积的 1×GST
洗涤缓冲液洗涤柱子，5 倍柱体积的 GST 洗脱缓
冲 液（50 mmol/L Tris-HCI，10 mmol/L Glutathione，
pH8.0）洗脱目的蛋白，分别收集各阶段的流出液。
15% SDS-PAGE 电泳分析，Brandford 法测定洗脱蛋
白溶液的浓度。同时纯化原核表达的谷胱甘肽转移
酶（GST）标签蛋白作为对照。
1.2.4 Western blot 鉴 定 将 纯 化 的 GST-HcMT 融
合蛋白、GST 标签蛋白以及诱导表达后的重组菌裂
解上清液和转空载体的 BL21 裂解上清液进行 SDS-
PAGE 电泳，转膜（转移槽 0.65 mA/cm 稳流 2 h），
用 5% 脱脂奶粉 4℃封闭过夜，加入用 TBST（Tris
缓 冲 盐 - 吐 温 溶 液， 含 10 mmol/L pH7.6 Tris-HCl，
150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20）1∶5 000 稀释的
鼠 ANTI-GST 一抗，室温轻摇 2 h，TBST 洗膜 3 次，
每次 5 min ；加入用 TBST 1∶10 000 稀释的羊抗鼠
IgG，室温轻摇 2 h，TBST 洗膜 3 次，每次 5 min ；
BeyoECL 显色液显色，观察 PVDF 膜上的显色条带。
1.2.5 GST-HcMT 与金属离子的结合能力检测［13，14］
为了研究 HcMT 结合金属离子的能力，分别将含有
pGEX-6p-2 和 pGEX-6p-2-HcMT 质粒的大肠杆菌 E.
coli（BL21）过夜培养物以 1∶100 转接入 50 mL LB
（ 含 Amp） 新 鲜 培 养 基。 当 OD600 达 到 0.4-0.6 时，
加入终浓度 0.4 mmol/L 的 IPTG，与此同时向其中添
加终浓度分别为 200 μmol/L Al3+、200 μmol/L Cu2+、
200 μmol/L Mg2+、200 μmol/L Zn2+、100 μmol/L Cd2+、
100 μmol/L Mn2+、20 μmol/L Pb2+ 和 2 μmol/L Hg2+ 金
属离子混合物，37℃过夜诱导。按 1.2.4 所述方法分
离纯化得到 GST-HcMT，以 GST 标签蛋白作为对照。
将蛋白样品硝化溶解于 15% 稀硝酸中，采用原子
分光光度法（Atomic Absorption Spectrometry，AAS）
测定各金属离子含量。为了测定其结合 Pb2+、Zn2+、
Cd2+ 的能力，在加入 IPTG 的同时单独分别向培养基
中加入终浓度为 300 μmol/L Pb2+、400 μmol/L Zn2+ 或
200 μmol/L Cd2+，离心洗涤菌体后，按如上方法分离
纯化蛋白，然后测定各金属离子含量。每个样品重
复 3 次，数据用 Graph Pad Prism 5 进行分析。
2 结果
2.1 HcMT序列分析
将 HcMT 序列与其他一些 Type 2 型金属硫蛋白
序列比对（图 1）显示，它们都具有相似的典型的
结构特征。通过 MEGA 4.0 系统进化树分析（图 2）
显示，其与海蓬子（Salicornia brachiata）进化起源
更近。
2.2 GST-HcMT表达与条件优化
将鉴定正确的 pGEX-6p-2-HcMT、pGEX-6p-2 转
入菌液并分别诱导表达，结果（图 3）显示，前者
诱导后能够表达出大小 33 kD 左右的蛋白条带，而
图 1 HcMT 与其他 Type 2 型金属硫蛋白的序列比对
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4124
后者只在 26 kD 处有一蛋白条带，与预期大小一致。
2.3 GST-HcMT纯化及Western blot鉴定
用 GST 亲和层析柱纯化后的蛋白洗脱液，经
SDS-PAGE（图 4）分析后发现皆可得到纯度相对较
高的目的蛋白。然后将纯化后的蛋白进行 Western
blot 鉴定，结果（图 5）表明在 34 kD 位置出现了一
条明显的条带，与 SDS-PAGE 中 GST-HcMT 融合蛋
白的位置相符。
2.4 GST-HcMT与金属离子的结合能力检测
在诱导过程中，向培养基中外源添加各种金属
离子之后分离纯化融合蛋白，运用 AAS 测得各离
Helianthus annuus
Salicornia brachiata
Sedum alfredii
Puccinellia tenuiflora
Iris lactea var. lactea
Avicennia marina
Bruguiera gymnorhiza
98
57
11
17
35
73
19
100
Arabidopsis thaliana
Brassica juncea
Jatropha curcas
HcMT
0.05
各 Type 2 型 MT 蛋白的登录号 ：Brassica juncea（Swiss-Prot ：P56172.1）、Arabidopsis thaliana（GenBank ：AAA50250.1）、Bruguiera gymnorhiza（GenBank ：
ABF50984.1）、Avicennia marina（GenBank ：ABQ63078.1）、Jatropha curcas（GenBank ：AGJ71684.1）、Iris lactea var. lactea（GenBank ：BAP25845.1）、
Puccinellia tenuiflora（GenBank ：AFF18618.1）、Sedum alfredii（GenBank ：AIG51062.1）、Salicornia brachiata（GenBank ：AEF01492.1）、Helianthus annuus
（GenBank ：ABO26877.1）
图 2 HcMT 与其他 Type 2 型金属硫蛋白的系统进化树分析
M1 2 3 4 5 6 7 8
kD
45.0
33.0
25.0
M ：14.4-94.0 kD 的蛋白标准 Marker ；1，3 ：pGEX-6P-2/BL21 经 0.4 mmol/L
IPTG 诱 导 前 ；2，4 ：pGEX-6P-2/BL21 经 0.4 mmol/L IPTG 诱 导 后 ；5，7 ：
pGEX-6P-2-HcMT/BL21 经 0.4 mmol/L IPTG 诱导前 ；6，8 ：pGEX-6P-2-HcM-
T/BL21 经 0.4 mmol/L IPTG 诱导后
图 3 SDS-PAGE 检测 GST-HcMT 表达情况
M1 2 3 4
kD
94.0
66.2
45.0
33.0
26.0
M ：14.4-94.0 kD 的蛋白标准 Marker ；1，3 ：pGEX-6P-2/BL21 经 0.4 mmol/L
IPTG 诱 导 前 ；2，4 ：pGEX-6P-2/BL21 经 0.4 mmol/L IPTG 诱 导 后 ；5，7 ：
pGEX-6P-2-HcMT/BL21 经 0.4 mmol/L IPTG 诱导前 ；6，8 ：pGEX-6P-2-HcM-
T/BL21 经 0.4 mmol/L IPTG 诱导后
图 4 SDS-PAGE 鉴定纯化的 GST-HcMT
kD
100
70
50
35
25
M 1 2
M ：蛋白标准 Marker ；1 ：纯化后 GST 标签蛋白 ；2 ：纯化后融合蛋白 GST-
HcMT
图 5 Western blot 鉴定纯化后的 GST-HcMT
2016,32(4) 125孟红恩等：盐穗木金属硫蛋白HcMT 在大肠杆菌中高效表达及金属离子结合能力的检测
子的量如表 1 所示。与对照组 GST 相比，融合蛋
白 GST-HcMT 能够结合更多的 Cd2+、Cu2+、Zn2+，对
Mg2+、Mn2+、Al3+ 和 Hg2+ 没有显著性差异，而对 Pb2+
的结合量显著性比对照小。Pb2+ 的结合量显著性下
降引起了我们的兴趣，因此选择在混合添加过程中
差异极显著的代表 Cd2+、差异显著的代表 Zn2+ 以及
Pb2+ 进行分别单独在诱导过程中向培养基中添加实
验。采用相同的方法测结合金属离子的含量，结果
（表 2）显示，每摩尔 GST 对照能够结合 Cd2+、Zn2+、
Pb2+ 这 3 种离子的摩尔数分别为 0.549、0.958 和 2.171，
而每摩尔融合蛋白 GST-HcMT 能够结合 Cd2+、Zn2+
和 Pb2+ 这 3 种离子的摩尔数分别为 5.438、4.068、
表 1 AAS 测得的 GST 和 GST-HcMT 的摩尔比（金属离子 / 蛋白）
纯化后蛋白 Cd2+ Cu2+ Mg2+ Mn2+ Pb2+ Zn2+ Al3+ Hg2+
GST 0.368±0.068 0.027±0.006 3.967±0.306 0.087±0.031 0.378±0.023 0.488±0.017 5.195±1.125 0.139±0.001
GST-HcMT 2.682±0.004*** 0.683±0.057** 4.786±0.970 0.049±0.038 0.328±0.053* 0.756±0.056 * 4.378±0.715 0.138±0.002
注 ：摩尔比 = 金属离子（μmol/L）/ 蛋白（μmol/L），每组 3 个重复。* ：0.01
纯化后蛋白 金属离子浓度 /（μmol·L-1） 蛋白浓度 /（μmol·L-1） 摩尔比（金属离子 / 蛋白）
Cd GST 4.534 8.254 0.549±0.006
GST-HcMT 32.061 5.896 5.438±0.032***
Zn GST 6.654 6.946 0.958±0.049
GST-HcMT 23.758 5.840 4.068±0.123***
Pb GST 3.324 1.531 2.171±0.105
GST-HcMT 10.286 2.234 4.604±0.046***
4.604，基本上分别是对照的 10 倍、4 倍和 2 倍。
3 讨论
植物金属硫蛋白是一类在大多数的器官中表达
的低分子量多肽，通常认为其主要的作用是重金属
的解毒与维持必需金属离子的稳态。而作为金属离
子螯合剂，它们同样在不同的生理进程中发挥作用，
包括清除 ROS、响应各种逆境胁迫、调节植物的生
长等［15，20，21］。但植物金属硫蛋白的功能机制，尤
其是在金属与自由基胁迫下的生物学功能，仍有待
于进一步的阐明。
由于金属硫蛋白中丰富的半胱氨酸极不稳定且
常不以单体的形式存在，很难检测其在体内的表达
活性［22］。用于纯化的 GST 标签蛋白为研究小分子
蛋白质提供了解决方法，同时由于 GST 标签蛋白可
以抑制 MTs 特别是其铰链区在大肠杆菌中被蛋白水
解酶降解［6，23］，因而本研究选用含 GST 标签的融合
蛋白来研究 HcMT 结合金属离子的能力。结果显示
与 GST 相比，GST-HcMT 融合蛋白具有较强的结合
金属离子的能力，如 Zn2+、Cu2+ 和 Cd2+，提示一些
金属离子优先与 GST-HcMT 融合蛋白中的 HcMT 结
合。铜离子与锌离子是两种必需的参与氧化还原的
金属离子，当过量时有潜在的毒性。植物需要从环
境中获得 Zn2+ 和 Cu2+，所以它们需要调节这两种金
属离子在细胞与组织间的上调、存储、分布与排出。
锌与铜的缺失或过量都会影响植物的生长［24，25］。锌
与铜是必须金属元素中与金属硫蛋白结合量最大的
两种，而且它们与植物金属硫蛋白的结合也被广泛
研 究［10］。HcMT 既 能 与 Zn2+ 也 能 与 Cu2+ 结 合， 而
且 与 Zn2+ 的 结 合 量 更 高， 但 GST-HcMT 与 GST 的
摩尔比之比显示 HcMT 对 Cu2+ 的选择性结合可能更
好一些。一些研究表明尽管植物金属硫蛋白对金属
离子的亲和力不同，但其表达以及与金属离子的结
合能力在维持植物体金属耐受性和金属离子稳态发
挥着重要作用。其他重金属离子更多的是对植物体
造成氧化胁迫，如 Cd2+ 等［14］，而植物金属硫蛋白
是其 ROS 清除系统中重要的一部分，本实验显示出
的金属硫蛋白与重金属离子的结合能力使重金属在
体内累积以解除其毒害，可以看出这也是植物应对
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4126
重金属胁迫的一种方式。而在表 1 中融合蛋白 GST-
HcMT 相比于对照 GST 结合量较少的 Pb2+ 通过单独
添加测得数据的表 2 中可以看出，融合蛋白 GST-
HcMT 还是可以选择性结合 Pb2+ 的，产生表 1 相反
的结果一方面可能是由于混合添加时 Pb2+ 加入量较
少，另一方面可能是由于混合添加时其他金属离子
的干扰造成的。AAS 法在进行多元素测定时确实存
在准确度与精密度较差的缺陷［26，27］。而在单独添加
Cd2+、Zn2+ 时，融合蛋白 GST-HcMT 和对照蛋白 GST
与混合添加相比结合金属离子的含量都显著性提高，
但融合蛋白 GST-HcMT 与对照蛋白 GST 相比每摩尔
结合的金属离子的量都极显著的提高，这一结果与
混合添加时相一致。综合表 1 与表 2 结果可以看出，
HcMT 结合金属离子的能力 Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+。这
些结果与其他一些 2 型金属硫蛋白［28-31］的结果相
似，植物金属硫蛋白可以与多种金属离子结合，无
论是一价离子［32］、二价离子还是更高价离子，而且
其亲和力也存在一定区别，推测可能与其生长环境
等有一定的关系。
4 结论
本研究成功表达融合蛋白 GST-HcMT，并得到
Western blot 验证，又通过原子吸收分光光度法得出
其可以结合 Cu2+、Cd2+、Zn2+ 和 Pb2+，且表现出不同
的结合能力，这与以前报道这一类金属硫蛋白的结
果相吻合。
参 考 文 献
［1］Jin S, Cheng Y, Guan Q, et al. A metallothionein-like protein of rice
（rgMT）functions in E. coli and its gene expression is induced by
abiotic stresses［J］. Biotechnol Lett, 2006, 28（21）：1749-1753.
［2］Hassinen VH, Tervahauta AI, Schat H, et al. Plant metallothioneins-
metal chelators with ROS scavenging activity?［J］. Plant Biology,
2011, 13（2）：225-232.
［3］Leszczyszyn OI, Imam HT, Blindauer CA. Diversity and distribution
of plant metallothioneins ：a review of structure, properties and
functions［J］. Metallomics, 2013, 5（9）：1146-1169.
［4］Capdevila M. Metallothionein protein evolution ：a miniassay［J］.
J Biol Inorg Chem, 2011, 16（7）：977-989.
［5］Usha B, Venkataraman G, Parida A. Heavy metal and abiotic stress
inducible metallothionein isoforms from Prosopis juliflora（SW）D.
C. show differences in binding to heavy metals in vitro［J］. Mol
Genet Genomics, 2009, 281（1）：99-108.
［6］ Freisinger E. Structural features specific to plant metallothioneins
［J］. J Biol Inorg Chem, 2011, 16（7）：1035-1045.
［7］Grennan AK . Metallothioneins, a diverse protein family［J］. Plant
Physiol, 2011 ：155.
［8］Mir G. A plant type 2 metallothionein（MT）from cork tissue
responds to oxidative stress［J］. J Eep Bot, 2005, 55（408）：
2483-2493.
［9］ Shunsaku N, Liu S, Tetsuo T. Isolation and characterization of a
metallothionein-1 protein in Chloris virgata Swartz that enhances
stress tolerances to oxidative, salinity and carbonate stress in Sacch-
aromyces cerevisiae［J］. Biotechnol Lett, 2007, 29（8）：1301-
1305.
［10］ Yang Z, Wu Y, Li Y, et al. OsMT1a, a type 1 metallothionein, plays
the pivotal role in zinc homeostasis and drought tolerance in rice
［J］. Plant Mol Biol, 2009, 70（1-2）：219-229.
［11］Yang J, Wang Y, Liu G, et al. Tamarix hispida metallothionein-like
ThMT3, a reactive oxygen species scavenger, increases tolerance
against Cd2+, Zn2+, Cu2+, and NaCl in transgenic yeast［J］. Mol
Biol Rep, 2011, 38（3）：1567-1574.
［12］Foley RC, Liang ZM, Singh KB. Analysis of type 1 metallothionein
cDNAs in Vicia faba［J］. Plant Mol Biol, 1997, 33（4）：583-
591.
［13］Huang GY, Wang YS. Expression and characterization analysis
of type 2 metallothionein from grey mangrove species（Avicennia
marina）in response to metal stress［J］. Aquat Toxicol, 2010, 99
（1）：86-92.
［14］Huang GY, Wang YS, Ying GG. Cadmium-inducible BgMT2, a
type 2 metallothionein gene from mangrove species（Bruguiera
gymnorrhiza）, its encoding protein shows metal-binding
ability［J］. J Exp Mar Biol Ecol, 2011, 405（1-2）：128-132.
［15］An ZG, Li CJ, Zu YG, et al. Expression of BjMT2, a metallothionein
2 from Brassica juncea, increases copper and cadmium tolerance
in Escherichia coli and Arabidopsis thaliana, but inhibits root
elongation in Arabidopsis thaliana seedlings［J］. J Exp Bot,
2006, 57（14）：3575-3582.
［16］Hassinen VH, Tuomainen M, Peräniemi S, et al. Metallothioneins
2 and 3 contribute to the metal-adapted phenotype but are not
2016,32(4) 127孟红恩等：盐穗木金属硫蛋白HcMT 在大肠杆菌中高效表达及金属离子结合能力的检测
directly linked to Zn accumulation in the metal hyper accumulator,
Thlaspi caerulescens［J］. J Exp Bot, 2009, 60（1）：187-196.
［17］Veerle MJG, Barbara I, Henk WJH, et al. Expression of the
Arabidopsis metallothionein 2b enhances arsenite sensitivity and
root to shoot translocation in tobacco［J］. Environ Exp Bot, 2009,
66（1）：69-73.
［18］Young OA, Sun HK, Jeongyeo L, et al. Three Brassica rapa
metallothionein genes are differentially regulated under various
stress conditions［J］. Mol Biol Rep, 2012, 39（3）：2059-2067.
［19］Sereno ML, Almeida RS, Nishimura DS, et al. Response of
sugarcane to increasing concentrations of copper and cadmium and
expression of metallothionein genes［J］. J Plant Physiol, 2007,
164（11）：1499-1515.
［20］Yuan J. Characteristic and expression analysis of a metallothionein
gene, OsMT2b, down-regulated by cytokinin suggests functions in
root development and seed embryo germination of rice［J］. Plant
Physiol, 2008, 146（4）：1637-1650.
［21］Xue T, Li X, Zhu W, et al. Cotton metallothionein GhMT3a, a
reactive oxygen species scavenger, increased tolerance against
abiotic stress in transgenic tobacco and yeast［J］. J Exp Bot,
2009, 60（1）：339-349.
［22］Murphy A. Purification and Immunological Identification of
Metallothioneins 1 and 2 from Arabidopsis thaliana［J］. Plant
Physiol, 1997, 113（4）：1293-1301.
［23］Abdullah SNA, Cheah S, Murphy DJ. Isolation and characterisation
of two divergent type 3 metallothioneins from oil palm, Elaeis
guineensis［J］. Plant Physiol Biochem, 2002, 40（3）：255-263.
［24］ Mosleh YY, Paris-Palacios S, Biagianti-Risbourg S. Metallothione-
ins induction and antioxidative response in aquatic worms Tubifex
tubifex（Oligochaeta, Tubificidae）exposed to copper［J］. Che-
mosphere, 2006, 64（1）：121-128.
［25］Znidarsic N, Tusek-Znidaric M, Falnoga I, et al. Metallothionein-
like proteins and zinc-copper interaction in the hindgut of Porcellio
scaber（Crustacea ：Isopoda）exposed to zinc［J］. Biol Trace
Elem Res, 2005, 106（3）：253-264.
［26］黄开胜 , 李思源 , 何小青 , 等 . ICP-AES 法和 AAS 法测定涂料
中多种元素的比较研究［J］. 中国涂料 , 2010, 25（2）：49-
51.
［27］黄开胜 , 李思源 , 何小青 , 等 . 电感耦合等离子发射光谱（ICP-
AES）和原子吸收光谱（AAS）测定涂料中多种元素的比较研
究［J］. 现代涂料与涂装 , 2010, 13（1）：38-40.
［28］Zhang J, Zhang M, Tian S, et al. Metallothionein 2（SaMT2）
from Sedum alfredii hance confers increased Cd tolerance and
accumulation in yeast and tobacco［J］. PLoS One, 2014, 9（7）：
e102750.
［29］Gu CS, Liu LQ, Zhao YH, et al. Overexpression of Iris. lactea var.
chinensis metallothionein llMT2a enhances cadmium tolerance in
Arabidopsis thaliana［J］. Ecotox Environ Safe, 2014, 105 ：22-
28.
［30］Tomas M, Pagani MA, Andreo CS, et al. Sunflower metallothionein
family characterisation. Study of the Zn（II）- and Cd（II）-
binding abilities of the HaMT1 and HaMT2 isoforms［J］. J Inorg
Biochem, 2015 ：148 ：35-48.
［31］Mudalkar S, Golla R, Sengupta D, et al. Molecular cloning and
characterisation of metallothionein type 2a gene from Jatropha
curcas L. , a promising biofuel plant［J］. Mol Biol Rep, 2014, 41
（1）：113-124.
［32］Zhang M, Takano T, Liu S, et al. Abiotic stress response in yeast
and metal-binding ability of a type 2 metallothionein-like protein
（PutMT2）from Puccinellia tenuiflora［J］. Molecular Biology
Reports, 2014, 41（9）：5839-5849.
（责任编辑 马鑫）